Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Экстракция и характеристика флавоноида рутина из традиционной китайской медицины Flos sophorae immaturus

1.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/67417

⸱

31 октября 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Chinese Materia Medica, Beijing University of Chinese Medicine

В этой статье

Краткое содержание

Традиционная китайская медицина (ТКМ) представляет собой богатую сокровищницу естественных методов лечения и играет важную роль в удовлетворении разнообразных потребностей в области здравоохранения во всем мире. В этом исследовании представлено всестороннее экспериментальное исследование экстракции, разделения и физико-химических свойств рутина, ключевого активного компонента Flos sophorae immaturus.

Аннотация

Традиционная китайская медицина (ТКМ) долгое время служила богатым хранилищем естественных терапевтических решений, играя ключевую роль в решении разнообразных потребностей здравоохранения во всем мире. Среди различных трав, используемых в ТКМ, Sophora flavescens известна своим широким спектром лечебных свойств. Его применение уходит корнями в глубь веков и продолжает высоко цениться в современной медицине, особенно за его терапевтические преимущества при лечении сердечно-сосудистых заболеваний. Рутин, биологически активное флавоноидное соединение, широко распространено по всему растительному царству, причем самая высокая концентрация обнаружена в Flos sophorae immaturus. Сообщалось, что рутин снижает аномальную проницаемость и ломкость капилляров и действует как защитное средство для сердечно-сосудистых и цереброваскулярных сосудов. В этом исследовании представлен подробный экспериментальный протокол для экстракции, разделения и характеристики физико-химических свойств рутина, полученного из Flos sophorae immaturus. Кроме того, введен и описан протокол экстракции флавоноидов из ТКМ методом щелочной экстракции и кислотного осаждения.

Введение

Flos sophorae immaturus (FSI), высушенный бутон цветка Sophora japonica L., на протяжении веков является краеугольным камнем традиционной китайской медицины (ТКМ). К его основным активным компонентам относятся рутин, изокверцитрин, Sophorae Flos, а также другие флавоноиды и сапонины. Эти составляющие в совокупности оказывают различные фармакологические эффекты, такие как снятие тепла и детоксикация, охлаждение крови и гемостаза, а также снижение артериального давления. В клинической практике FSI в первую очередь ценится за его способность защищать проницаемость капилляров1, поддерживать функцию сердечно-сосудистой системы2, охлаждать кровь, останавливать кровотечение и регулировать огонь печени3. Его лечебные свойства обусловлены высокой концентрацией рутина (кверцетин-3-рутинозид), биоактивного флавоноида, который составляет до 20-30% его сухой массы4.

Рутин – флавоноид, широко распространенный в растениях. Его химическое название — Que-3-O-рутин (C27H30O16) (Рисунок 1). При комнатной температуре рутин выглядит в виде кристаллического порошка от светло-желтого до желто-зеленого цвета. Его температура плавления варьируется в зависимости от кристаллической формы и чистоты, обычно в диапазоне от 125 °C до 195 °C. Рутин обладает ярко выраженными полярными характеристиками: он слабо растворим в холодной воде, хорошо растворим в полярных органических растворителях, таких как этанол и метанол, и почти нерастворим в неполярных растворителях, таких как эфир и хлороформ. Кроме того, его растворимость чувствительна к pH и значительно увеличивается в щелочных условиях из-за диссоциации фенольных гидроксильных групп, образующих соли натрия или калия. Эти физические свойства тесно связаны с полигидроксильными и гликозидными группами в его молекулярной структуре5, непосредственно влияя на процесс его экстракции и применение в медицине, пищевой и других отраслях промышленности6. Рутин, хотя и распространен в растениях, наиболее распространен в FSI и проявляет множественную фармакологическую активность, включая капиллярную стабилизацию7, противовоспалительное, антиоксидантное8,противомикробное 9 и метаболическое регуляторное действие10.

Несмотря на клинический потенциал11, плохая растворимость и стабильность рутина в воде создают проблемы для экстракции и разработки рецептур5. Для устранения этих ограничений в качестве эффективной альтернативы стал метод экстракционно-кислотного осаждения щелочной кислоты (AEAP), использующий pH-зависимое поведение фенольных гидроксильных групп.

Основываясь на физических свойствах рутина, метод AEAP стал стандартизированным методом выделения рутина из FSI, используя его растворимость в щелочных растворах и последующую кристаллизацию в кислых условиях. AEAP использует pH-переключаемую ионизацию фенольных гидроксильных групп для повышения выхода и достижения экстракции рутина высокой чистоты из FSI. В щелочных условиях (pH >10) фенольные -OH-группы депротонируют с образованием гидрофильных -O-ионов , обеспечивая полную солюбилизацию из растительных тканей при минимизации окислительной деградации. Подкисление до pH 2-3 обращает эту ионизацию вспять, осаждая целевые фенольные соединения с минимальным совместным осаждением полярных примесей. Как полифенол с pH-зависимой растворимостью, рутин легко растворяется в щелочных растворах (например, гидроксиде натрия), но выпадает в осадок в кислых условиях из-за протонирования гидроксильных групп. AEAP предоставляет экономически эффективную, масштабируемую и экологически чистую альтернативу, соответствующую принципам «зеленой» химии за счет отказа от токсичных растворителей13. Это отражает более широкую тенденцию в химии натуральных продуктов, которая благоприятствует методам разделения, основанным на pH14. Сопоставимые методы используются для выделения куркумина (из куркумы) и берберина (из Coptis chinensis), используя изменения растворимости при определенных значениях pH для селективной экстракции. Метод AEAP идеально подходит для производства высокопроизводительного рутина из богатых флавоноидами источников, таких как FSI, для которого требуется только базовое лабораторное оборудование (например, pH-метры, центрифуги). Для растительных матриц с низким содержанием рутина или сложных интерферирующих соединений в будущем может быть рассмотрена возможность предварительной ферментативной гидролиза для повышения эффективности экстракции.

В заключение следует отметить, что AEAP представляет собой удобный подход к экстракции рутина, сочетающий эффективность, безопасность и масштабируемость. Его роль в модернизации ТКМ подчеркивает его потенциал в плане сближения традиционной практики с современными фармацевтическими стандартами.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Рутин является флавоноидом, содержащим несколько фенольных гидроксильных групп и растворимым в горячих щелочных растворах с последующим подкислением и осаждением. Он может быть извлечен с помощью процесса экстракции щелочью и кислотного осаждения. Реагенты и оборудование, использованные в данном исследовании, перечислены в Таблице материалов.

1. Подготовка к эксперименту

  1. Приобретите следующие материалы: Flos sophorae immaturus (20 г), буру (0,8 г), несколько стаканов, известковый порошок (1,5 г), концентрированную соляную кислоту, термометр и тест-полоски pH. Увеличенная версия этого изображения приведена на рисунке 2 .

2. Экстракция рутина

ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте соотношение буры и воды 0,8 г буры на 200 мл воды. Используйте соотношение известкового молока 1,5 г известкового порошка на 10 мл воды. Быстро и точно регулируйте pH. Восполняйте потерянную воду по мере необходимости.

  1. Экстракция щелочи
    ПРИМЕЧАНИЕ: Отфильтруйте с помощью круглой фильтровальной бумаги толщиной 6 см.
    1. Добавьте 250 мл воды и 0,8 г буры в 500 мл стакана. Нагрейте до кипения, затем добавьте 20 г Flos sophorae immaturus. Продолжайте кипятить 2-3 минуты.
    2. После закипания отрегулируйте pH до 8-9 с помощью известкового молока при помешивании. Продолжайте нагревать в течение 20 минут. Процедите через марлю в горячем состоянии до получения желто-коричневого фильтрата.
  2. Экстракция кислотных осадков
    1. Отрегулируйте экстракт до pH 2-3 с помощью концентрированной соляной кислоты и дайте ему отстояться. Смена прозрачного желто-коричневого раствора на мутный, наряду с постепенным образованием оранжево-желтого хлопьевидного осадка на дне емкости, свидетельствует об эффективном разделении рутина.
    2. Постояв в течение 6 часов, подвергните осадок фильтрации всасывания атмосферного давления. Соберите и обсушите для получения сырого рутина.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Разрежьте фильтрующую пленку в соответствии с используемым размером воронки Бринелля (диаметр 150 мм).
    3. Осадок промыть водой до нейтральной точки во время фильтрации с всасыванием атмосферного давления.

3. Рафинирование рутина

  1. После грубого взвешивания рутин повторно кристаллизуют с помощью горячей воды с коэффициентом растворимости 1:200. Водного раствора кипятить 30 минут и процедить, пока он горячий. Следите за тем, чтобы конечный объем раствора рутина составлял 210 мл.
  2. Отфильтруйте остатки. Дайте фильтрату постоять в целости и сохранности, затем снова отфильтруйте и высушите под вакуумом в духовке при температуре 60-70 °C до получения очищенного рутина (Рисунок 3).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Разрежьте фильтрующую пленку в соответствии с используемым размером воронки Бринелля (диаметр 150 мм).

4. Физико-химическая идентификация рутина

  1. Реакция гидрохлоридно-магниевых солей - идентификация флавоноидных родительских ядер
    1. Растворите 1-2 мл образца в метаноле и добавьте 50 мг порошка магния.
    2. Добавьте несколько капель концентрированной соляной кислоты. Осторожно встряхните. Раствор должен стать красным (рисунок 4).
  2. Реакция Молища - идентификация соединений сахара
    1. Добавьте 10% раствор этанола α-нафтола и встряхните. Наклоните пробирку и осторожно добавьте концентрированную серную кислоту по каплям вдоль внутренней стенки.
    2. Обратите внимание на образование коричневого кольца на границе раздела (рисунок 5).
  3. Озеленение реакции циркония и лимонной кислоты
    1. Добавьте 1-2 мл 10% раствора α-нафтола в раствор этанола образца. Хорошенько встряхните. Медленно добавьте 10 капель концентрированногоН2СО4 вдоль стенки тюбика, не встряхивая.
    2. Добавьте 2% раствор метанола лимонной кислоты. Цвет раствора должен стать светлее (рисунок 6).
  4. Дискриминация тонких слоев
    1. Используйте как очищенный рутин, так и стандартный рутин.
    2. Используйте хлороформ:метанол:муравьиная кислота (15:5:1) в качестве проявочного агента и 1% раствор этанола AlCl3 в качестве хромогенного агента. Наблюдайте за флуоресценцией под ультрафиолетовой лампой с длиной волны 365 нм.

5. ТСЦ исследование рутина

ПРИМЕЧАНИЕ: Для оценки чистоты рутина был использован метод тонкослойной хроматографии (ТСХ). В качестве неподвижной фазы использовалась силикагелевая пластина.

  1. Нанесите на планшет очищенный образец рутина и стандарт рутина (1 мг/мл метанола). Проявите пластину в подвижной фазе, состоящей из этилацетата:муравьиной кислоты:воды (8:1:1, v/v/v).
  2. После высыхания визуализируйте пластину под ультрафиолетовым светом на длине волны 254 нм.
  3. Рассчитайте коэффициент удержания (Rf) места отбора проб и сравните его со стандартным.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Одно пятно с идентичным значением Rf (примерно 0,35-0,50 при этих условиях) указывает на высокую чистоту, в то время как дополнительные пятна указывают на наличие примесей.

6. Определение чистоты рутина методом ВЭЖХ

ПРИМЕЧАНИЕ: Чистота рутина была количественно проанализирована с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Условия анализа были следующими: хроматографическая колонка - (250 мм × 4,6 мм, 5 мкм); подвижная фаза - ацетонитрил (А) и 0,2% водный раствор уксусной кислоты (В). Программа линейного градиентного элюирования: 0-15 мин, 20%-30% А; 15-30 мин, 30%-60% А. Расход - 1 мл/мин. Объем впрыска - 10 μл. Длина волны обнаружения - 355 нм. Температура колонны -40 °С.

  1. Точно взвесьте 0,1 г порошка образца рутина и переложите его в центрифужную пробирку объемом 10 мл. Добавьте 5,0 мл 60% раствора этанола и тщательно встряхните.
  2. Установите постоянную температуру на водяной бане или в колонной печи на 30 °C и проводите ультразвуковое исследование образца в течение 30 минут.
  3. Центрифугируйте образец при давлении 55 900 × г в течение 10 минут при комнатной температуре. Используйте надосадочную жидкость в качестве тестового раствора для анализа ВЭЖХ.

7. Определение рутина методом ЖХ-МС

Выделенные соединения были идентифицированы с помощью жидкостной хромато-масс-спектрометрии (ЖХ-МС). Условия ЖХ соответствовали методу ВЭЖХ. Масс-спектрометрия проводилась с использованием ионизации электроспреем (ЭСИ) в режиме отрицательных ионов с капиллярным напряжением 3,5 кВ. Температура десольватации -350 °С; Диапазон сканирования массы - м/з 100-1000.

  1. Взвесьте 10 мг очищенного образца рутина и переложите его в микроцентрифужную пробирку объемом 2 мл. Добавьте 0,6 мл дейтерированного ДМСО с помощью пипетки до полного растворения образца. Готовят стандартные растворы рутина по той же процедуре.
  2. Анализ обработанных образцов и стандартов с помощью спектроскопии протонного ядерного магнитного резонанса (1Ч ЯМР).
  3. Обработка спектральных данных с помощью совместимого программного обеспечения15.
  4. Сравните спектральные данные с литературой или ссылками на базы данных, такие как NIST или PubChem, для проверки.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

В эксперименте по физико-химической идентификации рутина раствор окрашивался в красный цвет после добавления порошка магния и небольшого количества концентрированной соляной кислоты с последующим встряхиванием, что свидетельствовало о наличии флавоноидного родительского ядра. В реакции Молиша на границе раздела образовалось фиолетовое кольцо, свидетельствующее о положительном результате и наличии сахарных фрагментов в молекулярной структуре. Раствор образца стал ярко-желтым при добавлении в метанол 2% хлорокислительного ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Экстракция рутина в первую очередь основанана методе щелочной экстракции и кислотного осаждения (AEAP) 6, который сочетает в себе такие преимущества, как простые требования к оборудованию, простота в эксплуатации, высокая эффективность и низкая стоимость. Этот метод часто дополняется микроволновой экстракцией (MAE)7 и ультразвуковой экстракцией (UAE)8, которые снижают расход реагентов, ускоряют время экстракции и улу...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы данной статьи заявляют, что они раскрыли все без исключения конфликты интересов, которые могли возникнуть в ходе проведения данного исследования и написания данной статьи. Мы подтверждаем, что у нас нет финансовых, личных или профессиональных отношений, которые потенциально могли бы повлиять на нашу интерпретацию результатов или выводов, представленных в этой работе. В частности, у нас нет никаких связей с какими-либо фармацевтическими компаниями, исследовательскими институтами или другими организациями, которые могли бы извлечь выгоду из опубликованных здесь результатов. Наконец, мы утверждаем, что наши выводы и заключения основаны исключительно на данных и анализе, представленных в данной статье, и не подвержены влиянию каких-либо внешних факторов. Мы по-прежнему придерживаемся самых высоких стандартов академической честности и этического поведения во всей нашей исследовательской деятельности.

Благодарности

Мы хотели бы выразить огромную благодарность Лаборатории фармацевтической химии Пекинского университета китайской медицины за предоставленную экспериментальную платформу. Их поддержка и ресурсы были неоценимы при проведении наших исследований и экспериментов. Мы глубоко ценим их стремление к научному совершенству и содействие развитию молодых исследователей.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1-НафтолМАКЛИНC16245764
Уксусная кислотаМАКЛИНC12662811
АцетонитрилМАКЛИНC16129374
Хлорид алюминияМАКЛИНC16485922
Лимонная кислотаМАКЛИНC16429480
ДМСОFUCHEN (Тяньцзинь) Chemical Reagent Co., Ltd20230306
ЭтанолFUCHEN (Тяньцзинь) Chemical Reagent Co., Ltd20250102
ЭтилацетатFUCHEN (Тяньцзинь) Chemical Reagent Co., Ltd20240318
Flos sophorae immaturusПекинский Тунгжэнтан10092026329782
Муравьиная кислотаFUCHEN (Тяньцзинь) Chemical Reagent Co., Ltd20150402
‌ MestReNovaИсследования Mestrelab/
Метанол и bbsp;innochemC16365684
Силикагель 60F254STEEMA20210222
XcaliburТермо Фишер Сайентифик/
Цирконилхлорид октагидратМАКЛИНC15350627

Ссылки

  1. Drew, A. K., et al. Chinese herbal medicine toxicology database: Monograph on Radix Sophorae Flavescentis, "ku shen". J Toxicol Clin Toxicol. 40 (2), 173-176 (2002).
  2. Chua, L. S. A review on plant-based rutin extraction methods and its pharmacological activities. J Ethnopharmacol. 150 (3), 805-817 (2013).
  3. Huang, R., et al. Evaluation of the synergetic effect of Yupingfeng San and Flos Sophorae Immaturus based on free radical scavenging capacity. Biomed Pharmacother. 128, 110265(2020).
  4. Li, R., Wang, C., Lei, P., Huang, L., Yuan, S. Chemical constituents in Flos sophorae carbonisatus. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 35 (5), 607-609 (2010).
  5. Ghorbani, A. Mechanisms of antidiabetic effects of flavonoid rutin. Biomed Pharmacother. 96, 305-312 (2017).
  6. Calabrese, E. J., et al. Rutin, a widely consumed flavonoid, that commonly induces hormetic effects. Food Chem Toxicol. 187, 114626(2024).
  7. Li, R. R., Yuan, S. T., Li, Z. H., Qin, H. L. Studies on chemical constituents in Flos sophorae carbonisatus. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 30 (16), 1255-1257 (2005).
  8. Nikfarjam, B. A., Adineh, M., Hajiali, F., Nassiri-Asl, M. Treatment with rutin - a therapeutic strategy for neutrophil-mediated inflammatory and autoimmune diseases: Anti-inflammatory effects of rutin on neutrophils. J Pharmacopuncture. 20 (1), 52-56 (2017).
  9. Singh, S., et al. Rutin protects t-butyl hydroperoxide-induced oxidative impairment via modulating the Nrf2 and iNOS activity. Phytomedicine. 55, 92-104 (2019).
  10. Cushnie, T. P., Lamb, A. J. Antimicrobial activity of flavonoids. Int J Antimicrob Agents. 26 (5), 343-356 (2005).
  11. Budzynska, B., et al. Rutin as neuroprotective agent: From bench to bedside. Curr Med Chem. 26 (27), 5152-5164 (2019).
  12. Tan, Y. Q., et al. Pharmacological properties of total flavonoids in Scutellaria baicalensis for the treatment of cardiovascular diseases. Phytomedicine. 107, 154458(2022).
  13. Tobar-Delgado, E., Mejía-España, D., Osorio-Mora, O., Serna-Cock, L. Rutin: Family farming products' extraction sources, industrial applications and current trends in biological activity protection. Molecules. 28 (15), 5864(2023).
  14. Wang, S., et al. Effect of combined ultrasonic and enzymatic extraction technique on the quality of noni (Morinda citrifolia L.) juice. Ultrason Sonochem. 92, 106231(2023).
  15. Dos Santos Dantas, T., et al. Phytochemical profile analysis by LC-ESI-MS(n) and LC-HR-ESI-MS and validated HPLC method for quantification of rutin in herbal drug and products from leaves of Croton blanchetianus. Biomed Chromatogr. 37 (9), e5665(2023).
  16. Santiago, M., Strobel, S. Thin layer chromatography. Methods Enzymol. 533, 303-324 (2013).
  17. Ravber, M., et al. Hydrothermal degradation of rutin: Identification of degradation products and kinetics study. J Agric Food Chem. 64 (48), 9196-9202 (2016).
  18. Zhang, Z., et al. Effect of pH regulation on the components and functional properties of proteins isolated from cold-pressed rapeseed meal through alkaline extraction and acid precipitation. Food Chem. 327, 126998(2020).
  19. Lv, H., et al. Extraction and separation of vitisin D, ampelopsin B and cis-vitisin A from Iris lactea Pall. var. chinensis (Fisch.) Koidz by alkaline extraction-acid precipitation and high-speed counter-current chromatography. J Chromatogr Sci. 54 (5), 744-751 (2016).
  20. Yang, Y., Chu, X., Li, Y., Meng, H., Qin, L. Alkali-extracted rhamnogalactoarabinan from Chaetomorpha linum: Characterisation and anti-type 2 diabetic effect. Carbohydr Polym. 356, 123388(2025).
  21. Gao, S., et al. Unveiling polysaccharides of Houttuynia cordata Thunb.: Extraction, purification, structure, bioactivities, and structure-activity relationships. Phytomedicine. 138, 156436(2025).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Видео скоро будет доступно
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.