Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Использование оптического пинцета для получения гибридных сфероидов

1.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/67422

⸱

30 мая 2025 г.

 ,  , 
1Department of Clinical and Experimental Pathology, Institute of General and Experimental Pathology, Wrocław Medical University, 2Department of Optics and Photonics, Faculty of Fundamental Problems of Technology, Wrocław University of Science and Technology

В этой статье

Краткое содержание

В данной работе мы предлагаем протокол изготовления гибридных сфероидов с использованием оптического пинцета. Этот метод позволяет с высокой точностью контролировать ранние стадии процесса формирования сфероида, что недостижимо другими методами.

Аннотация

Двумерная (2D) клеточная культура по-прежнему является одной из наиболее часто используемых моделей в доклинических исследованиях рака. Тем не менее, трехмерные (3D) модели in vitro , по-видимому, более точно оценивают окружающую среду in vivo , включая более релевантную архитектурную морфологию, микроокружение и реакцию на лекарства.

Оптическая ловушка использует один или несколько сфокусированных лазерных лучей для неинвазивного манипулирования положением, движением, взаимодействием и динамикой структур в нано- и микромасштабе. Оптический пинцет (ОТ) нашел множество применений в клеточной биологии; Тем не менее, их потенциал в исследованиях рака все еще недооценен. В данной работе мы рекомендуем неинвазивный протокол формирования сфероидов лимфом-стромальных клеток с использованием оптического пинцета. Этот метод не только конструирует гибридные сфероиды de novo , но и позволяет контролировать количество прикрепленных клеток и время формирования адгезии, обеспечивая важный источник информации для тканевой инженерии. Кроме того, OT позволяет изучать ранние стадии формирования гибридных сфероидов, что не может быть достигнуто с помощью стандартных объемных методов. Важно отметить, что описанная модель может быть использована для изучения минимальных изменений адгезии, индуцированных противораковыми препаратами. Этот протокол может быть легко применен к другим типам клеток.

Введение

Трехмерные (3D) клеточные модели ускоряют исследования рака, поскольку они лучше напоминают опухолевую ткань по нескольким функциональным и структурным свойствам. К ним относятся, среди прочего, продукция внеклеточного матрикса, взаимодействие между клетками, поддержание градиентов питательных веществ и кислорода, а также аналогичные реакции на лечение 1,2,3,4. В последнее время для лучшего отражения условий in vivo были разработаны усовершенствованные гетерогенные 3D-модели с участием различных типов клеток 5,6,7.

В-клеточная неходжкинская лимфома (В-НХЛ) представляет собой гетерогенную группу злокачественных новообразований, происходящих из В-лимфоцитов, неотъемлемых компонентов иммунной системы8. Характеризуясь разнообразным спектром клинических проявлений и гистологических особенностей, В-НХЛ охватывает спектр расстройств, начиная от вялотекущих форм с затяжным клиническим течением до агрессивных вариантов, которые быстро прогрессируют. Патогенез В-НХЛ и других гематологических злокачественных новообразований часто связан с воздействием микроокружения опухоли11,12. Например, клетки лимфомы часто распространяются на костный мозг, что потенциально приводит к опасным для жизниосложнениям. Было признано, что мезенхимальные стромальные клетки (МСК), которые являются ключевыми компонентами ниши костного мозга, влияют на рост и прогрессирование опухоли14, в основном посредством прямых межклеточных взаимодействий 15,16,17; Таким образом, существует острая необходимость в разработке моделей, позволяющих изучать такие взаимодействия. Ранее нами было установлено, что МСК при совместном культивировании на агарозных гидрогелях с клетками лимфомы самоагрегируются в многоклеточные сфероиды, при этом стромальные клетки образуют ядро и равномерно окружены клетками лимфомы18. В данной работе мы представляем протокол изготовления 3D-модели гибридных лимфом-стромальных клеток с помощью оптического пинцета.

Более 35 лет назад Эшкин впервые сообщил о явлении неинвазивной оптической ловушки вирусов и бактерий с помощью сфокусированного лазерного луча19. В настоящее время оптический пинцет (ОТ) имеет динамично растущее влияние в биомедицинской области, в том числе в исследованиях клеточной биологии 20,21,22,23. ОТ позволил изучить не только физико-механические свойства отдельной клетки 24,25,26, но и прямые межклеточные взаимодействия на уровне одной клетки, а в дальнейшем 2D и 3D расположение и структурирование клеток 27,28,29. Метод оптической ловушки основан на оптических силах порядка нескольких пиконьютонов, действующих в виде электромагнитного излучения (фотонов), которое изменяет свой импульс при взаимодействии с веществом30. Вследствие этого, используя один или несколько лазерных лучей, операторы могут выборочно манипулировать положениями, движением и динамикой объектов в микро- инаномасштабе20. На практике метод оптического захвата позволяет осуществлять селективный и неразрушающий захват живых клеток, помещая их в контакт с поверхностью другой клетки или молекулы и запускаяинициирование процесса адгезии. Используя вышеуказанные функциональные возможности, мы сначала попытались оптически поместить одну клетку лимфомы на монослой стромальных клеток, чтобы исследовать ее адгезивные свойства. Далее мы приступили к оценке способности оптического пинцета физически воссоздавать многоклеточный сфероид в режиме реального времени33. Чтобы достичь этого, отдельные клетки лимфомы захватывали одну за другой и прикрепляли к ранее подготовленному 3D-сфероиду стромы. Еще одним применением оптического захвата было измерение минимального времени межклеточной адгезии и оценка мельчайших изменений адгезии в результате противоопухолевого лечения 34,35. Несмотря на то, что 3D-модели широко используются в исследованиях рака, изучение ранних стадий формирования сфероидов остается сложной задачей. В основном это связано с ограниченной доступностью методов, позволяющих прикасаться к микромиру с высокой точностью и в то же время минимально инвазивным воздействием. С другой стороны, полный потенциал ОТ еще предстоит достичь в рамках организации и структуры ячеек в 3D. Таким образом, в данной работе пошагово описан комбинированный рабочий процесс по созданию 3D-конструкции лимфомы с использованием стандартных 3D-методик и манипуляций в оптическом пинцете. Важно отметить, что протокол может быть легко адаптирован для использования с другими типами клеток, имеющими значение при гематопатологических злокачественных новообразованиях.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Изготовление микроформ на основе агарозного геля

ПРИМЕЧАНИЕ: Правильные методы асептики имеют важное значение при работе со всеми клеточными культурами. Все реагенты, используемые в этом протоколе, перечислены в Таблице материалов. Приготовьте три геля с МСК для одного эксперимента, как показано на рисунке 1А.

figure-protocol-1
Рисунок 1: Получение сфероидов мезенхимальных стромальных клеток (МСК). (А) Иллюстрация, изображающая этап подготовки агарозных микроформ. (B) Посев мезенхимальных стромальных клеток (МСК) и культивирование мезенхимальных сфероидов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

  1. Начните с подготовки микроформочек для агарозы. Промойте 3D чашку Петри с микроплесенью (см. Таблицу материалов) деионизированной водой (3x) и поместите под ультрафиолетовую лампу на 30 минут для проведения стерилизации.
  2. Сначала приготовьте 2% раствор агарозы. Отмерьте 1 г высококачественного чистого стерильного порошка агарозы (см. Таблицу материалов) и поместите его в стерильную коническую пробирку объемом 50 мл. Добавьте в агарозу 50 мл стерильного 0,9% раствора хлорида натрия (см. Таблицу материалов) и хорошо перемешайте. Закрутите крышку конической трубки до тех пор, пока она не станет надежной, но все еще ослабленной.
  3. С помощью микроволновой печи доведите до кипения и полностью растворите порошок агарозы. Прекращайте разогревать в микроволновой печи каждые 10 секунд и осторожно поворачивайте коническую трубку, чтобы убедиться, что агароза растворится. Избегайте образования пузырьков при смешивании или пипетировании агарозы. Охладите агарозу примерно до 70 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что нет остатков полупрозрачного нерастворенного порошка.
    ВНИМАНИЕ: Расплавленная агароза очень горячая и может вызвать серьезные ожоги кожи.
  4. Работа в ламинарном шкафу с использованием асептических методов. Приготовьте гидрогели, заполнив предварительно стерилизованные микроформы 500 μл агарозы. Отсасывайте любые пузырьки, которые могут быть застряли в мелких деталях микроплесени, с помощью пипетки.
  5. После 15 мин инкубации при комнатной температуре, когда агароза застынет, осторожно извлеките гели из микроплесени в стерильную 6-луночную пластину. Не повреждайте структуру геля. Прежде чем перейти к следующему шагу, проверьте под микроскопом, правильно ли подготовлены микроформы, и убедитесь, что края не повреждены. Проверьте, нет ли зазоров, через которые может просочиться среда.
  6. Добавьте достаточное количество 1x фосфатного буферного солевого раствора (PBS), чтобы полностью покрыть микроформы, прежде чем поместить пластину под ультрафиолетовую лампу на 30 минут для стерилизации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Агарозные микроформы можно хранить перед использованием до 2 недель в конической пробирке, накрытой 1x PBS в условиях холодильника (4 °C).
  7. Перед использованием микроформ для получения сфероидов уравновесьте гель, полностью покрыв его средой RPMI (4,0 мл/лунка для 6-луночного планшета) и инкубируйте в течение минимум 15 минут.

2. Получение мезенхимальных стромальных клеток (МСК) сфероидов

  1. Культивируют клеточную линию HS-5 (см. Таблицу материалов), мезенхимальную стромальную клеточную линию человека, в культуральной среде RPMI 1640 с добавлением 10% инактивированной при нагревании фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллин-стрептомицина (см. Таблицу материалов) в стандартных условиях, обеспечивая смену среды каждые 48 ч.
  2. Когда клетки HS-5 слились примерно на 90%, проведите пассаж клеток следующим образом:
    1. Удалите питательную среду с помощью серологической пипетки.
    2. Промойте ячейки, добавив 1x PBS и взболтав и аспирируя, чтобы удалить остатки среды.
    3. Отделите клетки от дна колбы с культурами, добавив 2 мл раствора трипсина-ЭДТА (см. Таблицу материалов) в колбу для клеточных культур и инкубируйте при 37 °C для облегчения отделения клеток.
    4. Остановите трипсинизацию, добавив 2 мл полной питательной среды.
    5. С помощью пипетки объемом 5 мл аккуратно подвесьте клетки и перенесите их в коническую пробирку объемом 15 мл.
    6. Центрифугируйте клеточную суспензию при 300 x g в течение 7 минут. Удалите надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки в 1 мл свежей питательной среды.
    7. Возьмите 10 μл клеточной гранулы и перенесите ее в пробирку объемом 0,5 мл. Затем добавьте 10 μL 0,4% раствора трипанового синего (см. Таблицу материалов) и подсчитайте ячейки в автоматическом счетчике ячеек (см. Таблицу материалов).
    8. Исходя из полученной выше плотности клеток, разбавьте клетки до 2 x 105 клеток/мл среды.
  3. Удалите клеточную питательную среду из агарозной микроплесени.
  4. Осторожно засейте 190 мкл клеточной суспензии, упомянутой выше (шаг 2.2.8), в камеру посева клеток агарозной микроплесени. Одна лунка будет содержать примерно 150 клеток (38 000 клеток/гель).
  5. Инкубируйте клетки в агарозной микроплесени в инкубаторе (5% CO2, 37 °C, влажная атмосфера) в течение 30 минут, пока клетки не осядут на дне геля. Через 30 минут извлеките из инкубатора планшет с микроплесенью и медленно добавьте дополнительную среду снаружи гелей, полностью покрывая их (например, 4,0 мл/лунку для 6-луночного планшета).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Добавляйте среду не непосредственно в гелевую агарозную микроформу, а в чашку для культивирования, избегая повреждения свежеобразовавшихся сфероидов.
  6. Поместите гель в инкубатор при температуре 37 °C во влажной атмосфере 5%CO2 на 72 ч до образования однородных сфероидов. (Рисунок 1В).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется наблюдать за образованием сфероидов в течение следующих 3 дней под инвертированным микроскопом. Как правило, мезенхимальные стромальные клетки начинают образовывать сфероиды в течение 24 ч, но этот процесс может быть быстрее или медленнее при различном прохождении и плотности клеток. После 72 ч инкубации на агарозной микроплесени мезенхимальные стромальные клетки образуют относительно однородные сфероиды; Однако стоит отметить, что они могут различаться по размеру и форме, несмотря на то, что инкубируются в идентичных условиях. Носитель необходимо заменять, когда он меняет цвет с фиолетово-красного на желтый.

3. Культивирование клеток лимфомы и подготовка к оптическому захвату

Гематологические клеточные линии, включая клетки лимфомы, свободно плавают в питательных средах в колбах, предназначенных для суспензионного культивирования, без какого-либо прикрепления к культуральной пластине или сосуду. Для поддержания оптимальных свойств клеток рекомендуется начинать подготовку образца не ранее, чем за 30 минут до процедуры сборки гибридных сфероидов с помощью оптического пинцета. Важно отметить, что протокол, описанный в этом разделе, относится к клеточной линии лимфомы человека Ri-1, но аналогичный протокол применяется и к другим гематологическим линиям раковых клеток.

  1. Культивировали клеточную линию лимфомы Ri-1 (см. Таблицу материалов) в среде RPMI 1640 с добавлением 10% FBS и 1% пенициллина/стрептомицина.
  2. Клетки лимфомы должны содержаться в инкубаторе в стандартных условиях культивирования, включая 37 °C и увлажненный воздух с 5%CO2. Поддерживайте культуру в диапазоне 3-5 x10-5 клеток/мл в логарифмической фазе путем пропускания каждые 2-3 дня.
  3. Соберите клетки и перенесите суспензию в полистирольную пробирку объемом 15 мл. Центрифугируйте клетки при 300 x g в течение 7 минут при комнатной температуре, чтобы получить клеточную гранулу. Удалите надосадочную жидкость и добавьте 10 мл свежей среды, аккуратно пипетируйте пипеткой до получения однородной суспензии.
  4. Отсадите 10 мкл клеточной суспензии в новую центрифужную пробирку и добавьте 10 мкл трипанового синего. Хорошо пипетируйте суспензию перед передачей 10 мкл в счетную камеру для определения плотности и жизнеспособности клеток (обычно выше 95%).
  5. Разбавляют клеточную суспензию до достижения конечной плотности 1 x 104 клеток/мл. Держать клетки лимфомы при температуре 37 °С до проведения оптических манипуляций.

4. Настройка системы оптического пинцета

ПРИМЕЧАНИЕ: Приведенный ниже протокол был разработан специально для изготовленного по индивидуальному заказу оптического пинцета36 (рисунок 2A). Тем не менее, этот анализ может быть использован с другими коммерчески доступными системами отлова. Независимо от того, какой тип оборудования доступен, основные этапы подготовки системы (например, запуск лазерного и компьютерного программного обеспечения, монтаж образца и проверка возможности перемещения ячейки в оптической ловушке) остаются неизменными. Все эксперименты проводились при комнатной температуре, т.е. 25 °С.

figure-protocol-2
Рисунок 2: Схема, иллюстрирующая рабочий механизм создания гибридного сфероида с помощью оптического пинцета. (A) Специально разработанная оптическая установка пинцета. (В) Процесс прикрепления отдельных клеток лимфомы к поверхности сфероида МСК. Одна клетка лимфомы была оптически захвачена и прикреплена к поверхности стромального сфероида до тех пор, пока не образовывалось стабильное соединение. Этот процесс продолжался до тех пор, пока вся поверхность стромального сфероида не была покрыта клетками лимфомы. (C) Репрезентативное изображение иммуногистохимического окрашивания гибридного сфероидного среза было получено с использованием моноклонального мышиного антитела против CD20 против CD20. Иммуноокрашивание проводили с использованием моноклонального антитела мышиного антитела к человеку против CD20 на автокрасителе (см. Таблицу материалов), следуя инструкциям производителя. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

  1. Включите источник света микроскопа.
  2. Носите защитное стекло, безопасное для лазера.
  3. Включите лазер и установите мощность для получения жесткости ловушки примерно 50 пН/мкм в системе оптического пинцета. Прежде чем продолжить, подождите 10 минут, дав лазерному лучу стабилизироваться.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В специально разработанной системе заданная жесткость ловушки достигается при мощности лазера 100 мВт на входе объектива микроскопа, измеренного для полистирольных шариков размером 3 мкм. Его минимальная инвазивность на клетки лимфомы ранее была подтверждена32,33, при этом сохраняется способность манипулировать живыми клетками.
  4. Тем временем запустите компьютерное программное обеспечение. В окне программного обеспечения появится изображение образца с микроскопа. С помощью видимых на экране маркеров перемещайте оптическую ловушку в нужном направлении.
  5. Когда система будет готова, добавьте 30 μL деионизированной воды в центр нижнего объектива.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В специально разработанной системе используется цель погружения в воду; Однако иммерсионный носитель может отличаться в зависимости от настроек пользователя.
  6. Поместите на предметный столик микроскопа 35 мм чашку для клеточных культур (см. Таблицу материалов) со стеклянным дном. Стабилизируйте блюдо с помощью держателей.
  7. Поднимите объектив с помощью винта микрометрического микроскопа до тех пор, пока капля воды не коснется стеклянного дна чашки.
  8. С помощью микрометрового винта аккуратно отрегулируйте микроскопический предметный столик до тех пор, пока не увидите, как лазерный луч резко сфокусирован в одну яркую точку на экране. Изображение образца с микроскопа будет отображаться в окне программного обеспечения. С помощью видимых на экране маркеров перемещайте оптическую ловушку в любом нужном направлении.
  9. Добавьте 100 мкл предварительно приготовленной суспензии клеток лимфомы (см. пункт 3.5) в центр чашки со стеклянным дном. Дайте им опуститься на дно посуды примерно на 5 минут.
  10. С помощью движений предметного столика микроскопа найти плавающую клетку лимфомы. Позвольте оптической ловушке попасть на образец, щелкнув по курсору ловушки на экране. Постарайтесь переместить ячейку в нужное место. Клетка, чтобы быть полезной для манипуляций, должна иметь возможность легко перемещаться в заданном направлении.
    ПРИМЕЧАНИЕ: По нашим наблюдениям, от 5 до 10% клеток лимфомы, добавленных в стеклянную чашку, навсегда прикрепляются ко дну после инкубационного периода. Этот процент будет увеличиваться с длительностью манипуляции и может достигать 30% уже через 60 минут. Однако, несмотря на эти потери, количество клеток, первоначально добавленных в чашку, позволит как эффективно калибровать систему, так и покрыть сфероид клетками лимфомы.

5. Получение гибридных сфероидов с помощью оптического пинцета

  1. Осторожно извлеките один стромальный сфероид из лунки агарозной формы с наконечником пипетки (100-1000 мкл) и поместите его на стеклянную чашку со стеклянным дном диаметром 35 мм.
  2. Добавьте 2 мл питательной среды RPMI и инкубируйте в течение 10 мин при 37 °C в стандартных условиях. За это время сфероид будет мягко прилипать к стеклу, что препятствует движению во время манипуляции.
  3. Поместите чашку со сфероидом на предметный столик микроскопа и стабилизируйте чашку на микроскопическом предметном столике с помощью держателей.
  4. Осторожно добавьте 100 мкл раствора клеток лимфомы с конечной плотностью 1 x 104 клеток/мл (шаг 3.5). Дайте им опуститься на дно посуды примерно на 5 минут.
  5. С помощью движений предметного столика микроскопа найти плавающую клетку лимфомы. Позвольте оптической ловушке попасть в выбранную ячейку, щелкнув по курсору ловушки на экране. После того, как клетка захвачена и перемещена, переместите предметный столик микроскопа, чтобы доставить клетку в контакт с поверхностью стромального сфероида.
  6. Начните с прикрепления клетки лимфомы к поверхности сфероида стромы на 10 секунд. Затем проверьте, прикреплена ли клетка навсегда, с помощью трех повторных попыток отсоединения клетки лимфомы с помощью оптического пинцета.
  7. Если клеточный контакт нарушен, прикрепите клетку лимфомы к поверхности сфероида еще раз с помощью оптической ловушки; Правда, на этот раз на более длительный промежуток времени, примерно 20 с.
    Примечание: Важно определить конкретные временные интервалы для захвата одиночных клеток для каждой клеточной линии отдельно. При предварительных манипуляциях установлено, что клетки лимфомы клеточной линии Ri-1 проявляют сильное адгезивное свойство к стромальным сфероидам, преимущественно прикрепляясь за 10-20 с к его поверхности. Таким образом, удельные временные интервалы контакта для захвата одиночных Ri-1 клеток составили 10, 20 и 30 с. В связи с трудоемким характером процедуры для формирования сфероидов с оптическим пинцетом рекомендуется использовать клеточные линии с минимальным временем адгезии не более 30 с.
  8. Повторяйте процедуру с последующими клетками лимфомы до тех пор, пока вся поверхность сфероида стромы не будет покрыта клетками лимфомы.
  9. Чтобы равномерно покрыть имеющуюся поверхность стромального сфероида клетками лимфомы, необходимо изменить положение оптической ловушки в объеме микроскопического образца. Изменяя плоскость изображения с помощью винта микрометрического микроскопа, можно изменить положение оптической ловушки, что обеспечивает более глубокое перемещение захваченных объектов в образце.
  10. Чтобы лучше представить спонтанно образовавшийся сфероид, покройте ядро стромальных клеток 2-3 слоями клеток лимфомы.
  11. Перенесите чашку со стеклянным дном, содержащую сфероид, в инкубатор на 1 ч инкубации в стандартных условиях.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Гибридный сфероид можно культивировать в течение длительного времени в 20 мкл среды RPMI в висячей капле.

6. Определение жизнеспособности сфероида

  1. Оцените жизнеспособность клеточного сфероида с помощью набора для окрашивания живых/мертвых (см. Таблицу материалов). Аккуратно удалите питательную среду и непосредственно промойте сфероид 100 мкл 1x PBS.
  2. Инкубируйте сфероид в 100 мкл 1x раствора PBS, содержащего 1 мкМ кальцеина-АМ и 2 мкМ гомодимера-1 этидия-1, в течение 20 мин при 37 °С.
  3. Наблюдайте за сфероидами с помощью флуоресцентного микроскопа (см. Таблицу материалов) и делайте снимки (см. Таблицу материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Нет необходимости стирать сфероид после окрашивания. Фоновые уровни флуоресценции при этом анализе по своей природе низкие, потому что красители практически не флуоресцентны до взаимодействия с клетками.
  4. С помощью программы ImageJ (см. Таблицу материалов) определить жизнеспособность сфероида, рассчитав отношение площади, окрашенной в зеленый цвет (живые клетки), к общей площади, окрашенной в красный цвет (мертвые клетки) и зеленый.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Наши предыдущие результаты показали, что мезенхимальные стромальные клетки, культивируемые с клетками лимфомы, составляют гомогенное стромальное ядро, к которому раковые клетки равномерно прикрепляются18. В этом исследовании мы успешно сконструировали человеческий гибридный сфероид, состоящий из мезенхимальных стромальных клеток и клеток лимфомы, с использованием специально изготовленного оптического пинцета. На рисунке 2B показан репрезентативный сфероид в светлополь...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В этом исследовании гибридные сфероиды мезенхимального стромального ядра и клеток лимфомы были сконструированы в режиме реального времени с использованием оптического пинцета. Новые лазерные технологии, в том числе системы ловушек, в настоящее время коммерчески доступны и становятся все более популярными. Тем не менее, на сегодняшний день большинство оптических пинцетов продолжают оставаться инструментами, изготовленными по индивидуальному заказу; Таким образом, калибровка, процедуры раб...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Авторы выражают искреннюю благодарность Николаю Чарнику, тщательное редактирование которого значительно улучшило ясность исследования.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
µ-Тарелка 35 мм, высокое стеклянное дноIBIDI81158
12-256 mico-mold 3D PetriDish Microtissue Inc., RI, США12-256TR
3 &m; m полистирольные микросферыPolysciences17134-15
анти-CD20 антитела (клон L26)DakoIS604
Автоматизированный счетчик клеток, EVENanoEntekEVE/ EVE-MC
Автоокрашиватель Link 48DakoD09634
Камера OlympusU-TV0.63XC
CelCultureEsco Technologies, Inc.Предметные стекла для
, EVENanoEntekNE-EVS
Клеточная линия HS-5ATCCCRL-3611
Клеточная линия Ri-1 DSMZ ACC 585
Фетальная бычья сывороткаGibcoA5256701
флуоресцентным микроскопом OlympusBX43
ImageJ программаНациональный институт здравоохранения, штат Мэриленд, США
Инвертированный микроскопOlympusIX73
Набор реагентов для живых/мертвых детей Thermo Fisher ScientificL3224
Пенициллин-стрептомицин (10 000 Ед/мл)Gibco15140122
фосфат буферизованный физиологический раствор, pH 7,4Gibco10010023
RPMI 1640 MediumGibco11875093
раствор хлорида натрияSigma-Aldrich7647-14-5
Раствор хлорида натрия 0,9 %, стерильныйITW ReITW Reagents, S.R.L.agents, S.R.L.A1671
Трипановый синий раствор, 0,4%Gibco15250061
TrypLE Express Enzyme (1X), без фенола красногоGibco12604013
трипсин-ЭДТА (0,05%), феноловый красныйGibco25300096
ультрачистый агарозныйинвитроген16500500
<сильный>оптический пинцет
Дихроичные зеркалаThorlabsDMSP805R
Цифровой фотоаппаратMikrotron GmbHMC1362
Гальвано-зеркальная система сканированияXY ThorlabsGVS002
Инвертированный микроскоп OlympusIX71
Объектив 1ThorlabsAC254-050-B-ML
Объектив 2ThorlabsAC508-200-B-ML
Nd:YAG 1064 нм лазерQuantumVentus
Инкубатор CO2 подсчета клеток CCL

Ссылки

  1. Brancato, V., Oliveira, J. M., Correlo, V. M., Reis, R. L., Kundu, S. C. Could 3D models of cancer enhance drug screening. Biomaterials. 232, 119744(2020).
  2. Fontoura, J. C., et al. Comparison of 2D and 3D cell culture models for cell growth, gene expression and drug resistance. Mater Sci Eng. C. 107, 110264(2020).
  3. Kapałczyńska, M., et al. 2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures. Arch Med Sci. 14 (4), 910-919 (2018).
  4. Duval, K., et al. Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture. Physiology (Bethesda). 32 (4), 266-277 (2017).
  5. Barbosa, M. A. G., Xavier, C. P. R., Pereira, R. F., Petrikaitė, V., Vasconcelos, M. H. 3D cell culture models as recapitulators of the tumor microenvironment for the screening of anti-cancer drugs. Cancers (Basel). 14 (1), 190(2021).
  6. Jubelin, C., et al. Three-dimensional in vitro culture models in oncology research. Cell Biosci. 12, 155(2022).
  7. Pape, J., Emberton, M., Cheema, U. 3D cancer models: the need for a complex stroma, compartmentalization and stiffness. Front Bioeng Biotechnol. 9, 660502(2021).
  8. Singh, R., et al. Non-Hodgkin's lymphoma: A review. J Family Med Prim Care. 9 (4), 1834-1840 (2020).
  9. Campo, E., et al. The International consensus classification of mature lymphoid neoplasms: a report from the clinical advisory committee. Blood. 140 (11), Erratum in: Blood. 141 (4), 437 (2023). 1229-1253 (2022).
  10. Swerdlow, S. H., et al. The 2016 revision of the World Health Organization classification of lymphoid neoplasms. Blood. 127 (20), 2375-2390 (2016).
  11. Ng, W. L., Ansell, S. M., Mondello, P. Insights into the tumor microenvironment of B cell lymphoma. J Exp Clin Cancer Res. 41, 362(2022).
  12. Mancini, S. J. C., et al. Deciphering tumor niches: lessons from solid and hematological malignancies. Front Immunol. 12, 766275(2021).
  13. Zhang, Q. Y., Foucar, K. marrow involvement by Hodgkin and non-Hodgkin lymphomas. Hematol. Oncol Clin North Am. 23 (4), 873-902 (2009).
  14. Gao, Q., et al. marrow mesenchymal stromal cells: Identification, classification, and differentiation. Front Cell Dev Biol. 9, 787118(2022).
  15. Lwin, T., et al. Lymphoma cell adhesion-induced expression of B cell-activating factor of the TNF family in bone marrow stromal cells protects non-Hodgkin's B lymphoma cells from apoptosis. Leukemia. 23 (1), 170-177 (2009).
  16. Kumar, A., Bhattacharyya, J., Jaganathan, B. G. Adhesion to stromal cells mediates imatinib resistance in chronic myeloid leukemia through ERK and BMP signaling pathways. Sci Rep. 7 (1), 9535(2017).
  17. Cuiffo, B. G., Karnoub, A. E. Mesenchymal stem cells in tumor development: emerging roles and concepts. Cell Adh Migr. 6 (3), 220-230 (2012).
  18. Duś-Szachniewicz, K., Gdesz-Birula, K., Rymkiewicz, G. Development and characterization of 3D hybrid spheroids for the investigation of the crosstalk between B-Cell non-Hodgkin lymphomas and mesenchymal stromal cells. OncoTargets Ther. 15, 683-697 (2022).
  19. Ashkin, A., Dziedzic, J. M. Optical trapping and manipulation of viruses and bacteria. Science. 235, 1517-1520 (1987).
  20. Spyratou, E. Advanced biophotonics techniques: The role of optical tweezers for cells and molecules manipulation associated with cancer. Front Phys. 10, 247-285 (2022).
  21. Choudhary, D., Mossa, A., Jadhav, M., Cecconi, C. Bio-molecular applications of recent developments in optical tweezers. Biomolecules. 9 (1), 23(2019).
  22. Nussenzveig, H. M. Cell membrane biophysics with optical tweezers. Eur Biophys J. 47 (5), 499-514 (2018).
  23. Zhang, X., Ma, L., Zhang, Y. High-resolution optical tweezers for single-molecule manipulation. Yale J Biol Med. 86 (3), 367-383 (2013).
  24. Li, X., et al. Optical tweezers study of membrane fluidity in small cell lung cancer cells. Opt Express. 29 (8), 11976-11986 (2021).
  25. Wullkopf, L., et al. Cancer cell's ability to mechanically adjust to extracellular matrix stiffness correlates with their invasive potential. Mol Biol Cell. 29, 2378-2385 (2018).
  26. Yousafzai, M. S., et al. Effect of neighboring cells on cell stiffness measured by optical tweezers indentation. J Biomed Opt. 21 (5), 57004(2016).
  27. Gupta, S. K., et al. Quantification of cell-matrix interaction in 3D using optical tweezers. Multi-Scale Extracellular Matrix Mechanics and Mechanobiology. Studies in Mechanobiology, Tissue Engineering and Biomaterials. Zhang, Y. , Springer. Berlin/Heidelberg, Germany. 283-310 (2020).
  28. Ma, Z., et al. Laser patterning for the study of MSC cardiogenic differentiation at the single-cell level. Light Sci Appl. 2, 68(2013).
  29. Kirkham, G. R., et al. Precision assembly of complex cellular microenvironments using holographic optical tweezers. Sci Rep. 5, 8577(2015).
  30. Pesce, G., et al. Optical tweezers: theory and practice. Eur Phys J Plus. 135, 949(2020).
  31. Avsievicha, T., Zhua, R., Popovb, A., Bykova, A., Meglinski, I. The advancement of blood cell research by optical tweezers. Rev Phys. 5, 100043(2020).
  32. Duś-Szachniewicz, K., et al. Physiological hypoxia (physioxia) impairs the early adhesion of single lymphoma cell to marrow stromal cell and extracellular matrix. Optical tweezers study. Int J Mol Sci. 19, 1880(2018).
  33. Duś-Szachniewicz, K., Gdesz-Birula, K., Nowosielska, E., Ziółkowski, P., Drobczyński, S. Formation of lymphoma hybrid spheroids and drug testing in real time with the use of fluorescence optical tweezers. Cells. 11 (13), 2113(2022).
  34. Hu, S., Gou, X., Han, H., Leung, A. Y., Sun, D. Manipulating cell adhesions with optical tweezers for study of cell-to-cell interactions. J Biomed Nanotechnol. 9 (2), 281-285 (2013).
  35. Johansen, P., Fenaroli, F., Evensen, L., Griffiths, G., Koster, G. Optical micromanipulation of nanoparticles and cells inside living zebrafish. Nat Commun. 7, 10974(2016).
  36. Drobczyński, S., Duś-Szachniewicz, K. Real-time force measurement in double wavelength optical tweezers. J Opt Soc AmB. 34, 38-43 (2017).
  37. Pavlasova, G., Mraz, M. The regulation and function of CD20: an "enigma" of B-cell biology and targeted therapy. Haematologica. 105 (6), 1494-1506 (2020).
  38. Gieseler, J., et al. Optical tweezers- from calibration to applications: a tutorial. Adv Opt Mater. 13, 74-241 (2021).
  39. Bustamante, C. J., Chemla, Y. R., Liu, S., Wang, M. D. Optical tweezers in single-molecule biophysics. Nat Rev Methods Primers. 1, 25(2021).
  40. Mitrakas, A. G., et al. Applications and advances of multicellular tumor spheroids: Challenges in their development and analysis. Int J Mol Sci. 24 (8), 6949(2023).
  41. Malm, M., et al. Evolution from adherent to suspension: systems biology of HEK293 cell line development. Sci Rep. 10, 18996(2020).
  42. Ling, Y., et al. A cell-laden microfluidic hydrogel. Lab on a Chip. 7 (6), 756-762 (2007).
  43. Azizipour, N., Avazpour, R., Sawan, M., Ajji, A., Rosenzweig, H. Surface optimization and design adaptation toward spheroid formation on-chip. Sensors. 22 (9), 3191(2022).
  44. Ryu, N. E., Lee, S. H., Park, H. Spheroid culture system methods and applications for mesenchymal stem cells. Cells. 8 (12), 1620(2019).
  45. Han, S. J., Kwon, S., Kim, K. S. Challenges of applying multicellular tumor spheroids in preclinical phase. Cancer Cell Int. 21, 152(2021).
  46. Feng, Q., Li, D., Li, Q., Cao, X., Dong, H. Microgel assembly: Fabrication, characteristics, and application in tissue engineering and regenerative medicine. Bioact Mater. 9, 105-119 (2021).
  47. Volpe, G., et al. Roadmap for optical tweezers. J Phys Photonics. 5, 022501(2023).
  48. Pradhan, M., Pathak, S., Mathur, D., Ladiwala, U. Optically trapping tumor cells to assess differentiation and prognosis of cancers. Biomed Opt Express. 7, 943(2016).
  49. Duś-Szachniewicz, K., et al. Differentiation of single lymphoma primary cells and normal B-cells based on their adhesion to mesenchymal stromal cells in optical tweezers. Sci Rep. 9, 9885(2019).
  50. Gdesz-Birula, K., Drobczyński, S., Sarat, K., Duś-Szachniewicz, K. Sonidegib Inhibits the adhesion of acute myeloid leukemia to the bone marrow in hypoxia: An optical tweezer study. Biomedicines. 13, 578(2025).
  51. Matheson, A. B., et al. Optical tweezers with integrated multiplane microscopy (OpTIMuM): A new tool for 3D microrheology. Sci Rep. 11, 5614(2021).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Трехмерное культивирование клетокклетки лимфомыстромальные сфероидыоптический захватадгезия клетокфлуоресцентная микроскопияагарозная микроформатканевая инженерия
Использование оптического пинцета для получения гибридных сфероидов
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.