3D-визуализация сосудистых перицитов сетчатки у мышей методом иммуноокрашивания

Краткое содержание

Перициты в сосудистой сети сетчатки исследовали методом иммунофлуоресцентного окрашивания рецептором тромбоцитарного фактора роста β после ретроорбитального введения флуоресцентного лектина томата. Меченая сетчатка была дополнительно обработана методом очищения тканей и полностью смонтирована для визуализации трехмерных изображений перицитов, окружающих сосудистую сеть сетчатки, под конфокальным микроскопом.

Аннотация

Перициты сетчатки имеют важное значение для развития сосудов и стабильности сетчатки, играя ключевую роль в поддержании целостности сосудистой сети сетчатки. Чтобы получить подробное представление о морфологических характеристиках перицитов, в этом исследовании описан новый подход, сочетающий ретроорбитальную инъекцию флуоресцентного агента, иммунофлуоресцентное окрашивание и лечение очищением тканей. Во-первых, флуоресцентный лектин томата вводили в ретроорбитальный синус живой мыши для обозначения сосудистой сети сетчатки. Через 5 минут мышь приносили в жертву, а ее неповрежденную сетчатку осторожно извлекали из чашечки сетчатки и иммунофлуоресцентно окрашивали рецептором тромбоцитарного фактора роста β для выявления перицитов. Кроме того, окрашенную сетчатку обрабатывали реагентом для очистки тканей и целиком устанавливали на предметное стекло микроскопа. Благодаря этим подходам в прозрачной сетчатке были четко замечены сосуды сетчатки и перициты. Под конфокальным микроскопом мы получили больше возможностей для получения изображений с высоким разрешением для дальнейшей реконструкции и анализа морфологических характеристик перицитов вдоль сосудистого дерева сетчатки в трехмерном виде. С методологической точки зрения этот протокол предлагает эффективный подход к визуализации перицитов в сосудистой сети сетчатки, предоставляя ценную информацию об их роли как в физиологических, так и в патологических условиях.

Введение

Перициты сетчатки встроены в базальную мембрану вдоль абуминальной стороны эндотелиальных клеток сосудов, демонстрируя сетчатый рисунок краткосрочных процессов, обернутых вокруг кровеносных сосудов сетчатки¹. Этот тесный контакт между перицитами и сосудистой сетью сетчатки способствует поддержанию гомеостаза сетчатки окружающей^среды2. Несмотря на то, что многочисленные исследования предоставили морфологические доказательства наличия перицитов в сосудистой сети сетчатки, большая часть нашего понимания морфологических характеристик перицитов сетчатки основана на традиционных гистологических^{методах}.

В соответствии с этими исследованиями, мы разработали это исследование, чтобы эффективно продемонстрировать больше морфологических деталей перицитов в микроциркуляторном русле сетчатки, сочетая традиционные гистологические методы с современными передовыми научными методами. Подход здесь объединяет три ключевых метода: ретроорбитальную инъекцию флуоресцентного лектина томата живым мышам, иммунофлуоресцентное окрашивание с помощью рецептора тромбоцитарного фактора роста β (PDGFR-β) и стратегию очищения тканей на основе растворителя. Ретроорбитальная инъекция флуоресцентного лектина томата доказала свою эффективность и надежность для наблюдения за сосудистой сетью сетчатки мыши как in vivo, так и in vitro ^4,5. PDGFR-β служит широко используемым биомаркером для иммунофлуоресцентного окрашивания перицитов⁶. Для получения изображений перицитов с высоким разрешением в более толстой и цельной сетчатке стратегия очистки тканей повышает гистологическую прозрачность ^2,7,8.

Несмотря на то, что каждый из этих методов применялся индивидуально в исследованиях сетчатки, их совокупная совместимость для исследования перицитов в сосудистой сети сетчатки мыши остается неопределенной. Поскольку средняя толщина сетчатки мыши составляет примерно 180-220^мкм9, мечение антителами и конфокальная визуализация в этой толстой ткани без очистки часто приводят к высоким фоновым сигналам, что затрудняет наблюдение за пространственными отношениями между перицитами и кровеносными сосудами¹⁰. С помощью описанных здесь подходов мы стремимся предоставить простой метод визуализации перицитов в сосудистой сети сетчатки в трехмерном (3D) виде под конфокальным микроскопом. Эта расширенная клеточная информация из перицитов в сосудистой сети сетчатки может улучшить наше понимание гомеостаза окружающей среды сетчатки и подчеркнуть потенциальные стратегии защиты сосудов, тем самым улучшая функциональные результаты при сосудистых заболеваниях сетчатки.

Протокол

Для этого исследования были использованы три молодых взрослых самца мышей C57BL/6 (8-10 недель, масса тела 20-25 г). Они были размещены в 12-часовом цикле свет/темнота с контролируемой температурой и влажностью и имели свободный доступ к пище и воде. Это исследование было одобрено Комитетом по этике Института акупунктуры и прижигания Китайской академии медицинских наук Китая (одобрение No 2023-03-14-04) и проведено в соответствии с Руководством Национальных институтов здравоохранения по уходу и использованию лабораторных животных (National Academy Press, Вашингтон, округ Колумбия, 1996).

1. Ретроорбитальная инъекция in vivo флуоресцентного лектина томата

1. Введите 50 мг/кг пентобарбитала внутрибрюшинно, чтобы обезболить мышь. Оцените глубину анестезии, оценив отсутствие реакции на стимул пощипывания пальца ноги.
2. Поместите мышь в правое боковое лежачее положение головой влево.
3. Осторожно надавите двумя пальцами на периорбитальную область, чтобы обнажить левый глаз мыши^{, чтобы} можно было легче ввести инъекцию в левый ретроорбитальный синус животного.
4. С помощью шприца объемом 1 мл с иглой 27G аккуратно проколите примерно на 2-3 мм орбитальный венозный синус мыши так, чтобы скос на игле был направлен вперед под углом 45°.
5. Введите 0,1 мл (1 мг/мл) флуоресцентного лектина томата в орбитальный венозный синус мыши.

2. Перфузия и энуклеация глаз

1. Через 5 мин после ретроорбитального введения введите раствор трибромэтанола (250 мг/кг) внутрибрюшинно для глубокой анестезии мыши. Впоследствии усыпьте животное с помощью обескровливания и сердечной перфузии. Как только дыхание остановится, вскройте грудную полость хирургическими ножницами¹².
2. Как только дыхание остановится, откройте грудную полость хирургическими ножницами. Заранее простерилизуйте хирургические инструменты и работайте в вытяжном шкафу. С помощью иглы 24G введите ее на 2 мм в левый желудочек сердца через верхушку левого желудочка. Проводят перфузию со скоростью 3 мл/мин с 20 мл 0,9% физиологического раствора с последующим добавлением 20 мл 4% формальдегида в 0,1 М фосфатном буфере (PB, pH 7,4).
3. Положите принесенную в жертву мышь на бок и снимите ножницами кожу, закрывающую глаза. Энуклеируйте глаза с помощью ножниц и щипцов.
4. Разрежьте зрительный нерв и окружающие ткани, затем приподнимите глаз и переложите на 12-луночную пластину для последующей фиксации в 4% формальдегиде в 0,1 М PB в течение 2 ч.
5. Криозащитите ткань в 25% сахарозе в 0,1 М PB (pH 7,4) при 4 °C до тех пор, пока она не опустится на дно раствора.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку глазная ткань хорошо обезвоживается в растворе сахарозы, сетчатка может быть более легко и полностью отделена, что облегчает последующие всесторонние исследования.

3. Рассечение сетчатки глаза

1. Перенесите глаза в чашку Петри, содержащую 0,1 М PB (pH 7,4), с помощью пластиковой пастеровской пипетки.
2. Проткните край роговицы острыми ножницами, разрежьте вокруг роговицы и радужной оболочки и выбросьте.
3. Используйте щипцы для снятия хрусталика и стекловидного тела. Затем оттяните чашеобразную сетчатку от центра глаза с помощью тонких щипцов. Промойте сетчатку 0,1 М PB (pH 7,4) в чистой чашке Петри.

4. Иммунофлюоресцентное окрашивание и очищение тканей сетчатки

1. Осторожно удалите чашеобразную сетчатку и инкубируйте ее в 2% растворе Triton X-100 в 0,1 М PB (pH 7,4) в течение ночи при температуре 4 °C.
2. Перенесите сетчатку в раствор для блокировки (0,1 М PB + 1% Triton-X 100 + 0,2% азид натрия + 10% обычная ослиная сыворотка) и вращайте со скоростью 72 об/мин на шейкере в течение ночи при температуре 4 °C.
3. Перенесите сетчатку в раствор, содержащий первичные антитела козьего анти-PDGFR-β (10 мкг/мл) в буфере для разведения (0,1 М ПБ + 0,2% Тритон-Х 100 + 0,2% азид натрия + 1% нормальная ослиная сыворотка) в микроцентрифужной пробирке и вращайте на шейкере в течение 2 суток при 4 °С.
4. Промойте сетчатку 2x с помощью буфера для стирки (0,1 М PB + 0,2% Triton-X 100) при комнатной температуре, затем держите их в буфере для стирки в течение ночи при температуре 4 °C на шейкере.
5. На следующий день перенесите сетчатку в смешанный раствор, содержащий 1 мг/мл вторичного антитела осла против козы 488 и 0,2 нг/мл флуоресцентного ядерного 4',6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) в микроцентрифужной пробирке и вращайте со скоростью 72 об/мин на шейкере в течение 5 ч при 4 °C.
6. Промойте сетчатку в 6-луночной пластине с промывочным буфером в течение 1 часа, 2х, при комнатной температуре. Держите сетчатку в буфере для стирки на шейкере в течение ночи при температуре 4 °C. Выполните визуализацию и анализ в соответствии с шагом 5 для получения изображений перед очищением тканей.
7. Перенесите сетчатку в реагент для очищения тканей и осторожно вращайте ее со скоростью 60 об/мин на шейкере в течение 1 часа при температуре 37 °C.
8. После очищения тканей промойте чашеобразную сетчатку 0,1 М PB (pH 7,4) в чистой чашке Петри.
9. Сделайте 4 радиальных разреза, достигающих примерно 2/3 радиуса сетчатки, с помощью пружинных ножниц для создания формы лепестка.
10. Расплющите и закрепите сетчатку на предметном стекле микроскопа, а затем удалите излишки PB с помощью небольшого кусочка абсорбирующей бумаги. Держите внутреннюю часть сетчатки на предметном стекле лицевой стороной вверх.
11. Обведите установленную сетчатку спейсером и заполните промежуток свежим реагентом для очистки тканей и покровным стеклопакетом.

5. Визуализация и анализы

1. Получите внешний вид сетчатки до (после выполнения шага 4.6) и после процедуры очищения тканей.
2. Сканируйте монтажные изображения помеченной сетчатки с помощью панорамного сканера срезов тканей. Используйте объектив с 2-кратным увеличением и NA 0,08.
3. Получение изображений с большим увеличением осуществляется с помощью конфокальной системы визуализации, оснащенной следующими объективами: 10-кратный объектив с NA 0,40 и 40-кратный объектив с NA 0,95. Установите конфокальную точечную дыру на 152 μм (объектив с 10-кратным увеличением) и 105 μм (объектив с 40-кратным увеличением). Установите пространственное разрешение захвата изображения на уровне 1024 x 1024 пикселей (объектив с 10-кратным увеличением) и 640 x 640 пикселей (объектив с 40-кратным увеличением).
4. Захват 50 изображений (Z-стек) в кадрах размером 2 мкм с маркированной сетчатки. Интегрируйте все изображения в один фокус в режиме проекции/топографии. Для настройки нажмите «Установить начальную фокальную плоскость» > «Установить конечную фокальную плоскость» > «Задать размер шага» > «Выбрать шаблон глубины» > «Захват изображений» > серии Z.
5. Получение изображений с использованием следующих длин волн возбуждения и излучения для различных сигналов флуоресценции: Зеленые флуоресцентные сигналы на длинах волн 499 нм и 519 нм; красные флуоресцентные сигналы на длинах волн 591 нм и 618 нм; и синие флуоресцентные сигналы на длинах волн 401 нм и 421 нм.
6. Восстановите изображения в трехмерном шаблоне путем импорта конфокальных изображений Z-стека в программное обеспечение для анализа, выбрав «Добавить новые поверхности» > «Выбрать параметры объема» > «Выбрать исходный канал» > «Настроить отображение» > «Настроить угол поверхности > моментальный снимок».

Результаты

При внешнем наблюдении цельной сетчатки прозрачность тканей цельной сетчатки была увеличена с помощью лечения очищения тканей по сравнению с сетчаткой без очищения тканей (Рисунок 1).

Для гистологического исследования на цельной сетчатке сосудистая сеть сетчатки была помечена красным цветом с помощью флуоресцентного лектина томата через ретроорбитальную инъекцию, а перициты сетчатки показаны зеленым цветом с помощью PDGFR-β (рис. 2, рис. 3 и рис. 4). Несмотря на то, что эта маркировка могла наблюдаться на образце до и после очищения тканей, для сравнения, фоновый шум образца сетчатки был уменьшен при очистке тканей (рис. 2). Лечение также сделало меченые перициты сетчатки и сосудистую сеть более четкими под помощью панорамного сканера срезов тканей (рис. 2) и лазерного сканирующего конфокального микроскопа (рис. 3).

Здесь также показано градационное распределение перицитов сетчатки вдоль сосудистого дерева сетчатки (рис. 3). От центральной части сетчатки до ее периферической области перициты расположены на базальной мембране сосудистой сети сетчатки, включая сосудистый ствол и ветви и капилляры (рис. 3).

На основании приведенного выше наблюдения пространственная корреляция перицитов и сосудистой сети сетчатки была дополнительно оценена с помощью изображений Z-стека с более высоким увеличением из очищенного образца сетчатки (рис. 4). С помощью системы обработки изображений мы также предоставили 3D-изображения, чтобы продемонстрировать, что перициты плотно обхватывают сосудистую сеть сетчатки разного диаметра (рис. 4). На рисунке 4A0-D0 показано иерархическое разветвление сосудов сетчатки от высшего к низшему. Поскольку перициты более обильно распределены в капиллярах, окрашивание PDGFRβ на рисунке 4D0 показывает более сильную интенсивность и сигнал по сравнению с рисунком 4A0-C0.

В отличие от сетчатки мышей без очистки тканей (рис. 1A, рис. 2A, рис. 3A0-D0), настоящий подход эффективно снижает фоновые сигналы сетчатки для демонстрации пространственных отношений между перицитами и кровеносными сосудами от цельной сетчатки (рис. 1B, рис. 2B, рис. 3A1-D1).

Рисунок 1: Сравнение оптической прозрачности всей сетчатки без и с лечением очищения тканей. (A, B) Внешний вид всей сетчатки до (A) и после (B) лечения очищения тканей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Сравнение особенностей мечения перицитов и сосудистой сети сетчатки всего массива без и с лечением очищения тканей. (A, B) Репрезентативные монтажные изображения всей сетчатки до (A) и после (B) лечения очищения тканей были получены с помощью системы виртуальных слайдов. Сосудистая сеть окрашена в красный цвет (флуоресцентный лектин томата), перициты — в зеленый (PDGFR-β), а клеточное ядро — в синий (DAPI). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3: Сравнение разрешения визуализации перицитов сетчатки по градации вдоль сосудистого дерева сетчатки до и после лечения очищения тканей. (A-D) Репрезентативные изображения с меченой сетчатки до лечения очищения тканей (A0-D0) и после лечения очищения тканей (A1-D1) показывают распределение перицитов, окружающих сосудистую сеть сетчатки, в порядке сосудистого ствола (A0, A1), ветви первого порядка (B0, B1), ветви второго порядка (C0, C1) и капиллярная (D0, D1). Сосудистая сеть окрашена в красный цвет (флуоресцентный лектин томата), перициты — в зеленый (PDGFR-β), а клеточное ядро — в синий (DAPI). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 4: Пространственное соотношение перицитов с сосудистой сетью сетчатки разного диаметра. (А-Г) Репрезентативные изображения с высоким разрешением с меченой сетчатки вдоль сосудистого дерева сетчатки, показывающие распределение перицитов, окружающих сосудистую сеть сетчатки, в различных диаметрах, включая сосудистый ствол (A0, A1), ветви первого порядка (B0, B1), ветви второго порядка (C0, C1) и капилляры (D0, D1). A1-D1: Соответствующие изображения панелей A0-D0 были реконструированы, чтобы показать пространственную корреляцию перицитов с сосудистой сетью сетчатки в разных диаметрах в трехмерных проекциях и дополнительно продемонстрировать увеличенные изображения локальных областей на панелях A1-D1 (стрелки) со вставками. Сосудистая сеть окрашена в красный цвет (флуоресцентный лектин томата), перициты — в зеленый (PDGFR-β), а клеточное ядро — в синий (DAPI). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Обсуждение

В этом исследовании мы подробно описали технический процесс демонстрации морфологии перицитов в сосудистой сети сетчатки с использованием ретроорбитального введения флуоресцентного лектина томата, иммунофлуоресцентного исследования с помощью PDGFR-β и очищения тканей на основе растворителя. Результаты показывают, что эти методы хорошо совместимы для выделения перицитов в сетчатке. Комбинация этих методологий предлагает эффективный подход к визуализации морфологических характеристик перицитов в сосудистой сети сетчатки с детальной 3D-точки зрения.

Доказано, что один из ключевых методов, ретроорбитальная инъекция у мышей, является простым и оптимальным методом доставки сосудистых мечеющих агентов, превосходящим методы внутрибрюшинной инъекции в хвостовую вену и внутрибрюшинную инъекцию для наблюдения за сосудистой сетью сетчатки мыши^13,14. Хотя принцип и механизм мечения сосудов с помощью ретроорбитальной инъекции до конца не изучены, очевидно, что этот метод надежно помечает сосудистую сеть сетчатки флуоресцентным лектином томата. Флуоресцентное мечение остается стабильным как при гистохимической обработке, так и при очищении тканей. Таким образом, помимо использования в визуализации in vivo, ретроорбитальная инъекция флуоресцентного лектина томата эффективно помечает просвет кровеносных сосудов, обеспечивая четкое представление сосудистой сети сетчатки для гистологического исследования in vitro и ex vivo.

Для мечения перицитов сетчатки использовали иммунофлуоресцентное окрашивание PDGFR-β¹⁵. Учитывая, что окрашенная сетчатка подвергалась дальнейшей обработке тканевым очищающим реагентом для уменьшения рассеяния света в тканях при микроскопическом морфологическом исследовании, сетчатку инкубировали в окрашивающем растворе в течение более длительного времени для усиления проникновения антител^16,17.

Цельная сетчатка относительно прозрачна, что позволяет видеть сосудистую сеть сетчатки¹⁸. Однако из-за рассеивания света при его толщине он ограничивает проникновение света и получение изображений с высоким^{разрешением19}. С помощью методов очищения тканей стало возможным рассмотреть перициты в сетчатке с высоким разрешением^19,20. Однако эти методы еще не получили широкого применения для исследования перицитов сетчатки мышей. В этом исследовании подход к очищению тканей на основе растворителей значительно расширил наши возможности по визуализации перицитов в сосудистой сети сетчатки, что позволило нам получить изображения Z-стека с высоким разрешением с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа.

Перициты, распределенные вдоль микрососудистого дерева, играют важную роль в сложном пространственном и временном распределении крови в капиллярной сети сетчатки²². Их высокопластичная морфология и адаптивные сократительные способности делают перициты идеальными для регулирования капиллярного кровотока в ответ на местную активность нейронов в физиологических и патологических^{условиях.} Являясь ключевым игроком гемато-сетчаточного барьера или нейроваскулярного взаимодействия сетчатки, перициты сетчатки также привлекают внимание в поддержании неоваскуляризации, ангиогенеза и трансмиграции лейкоцитов²⁴.

В качестве технического ограничения следует иметь в виду, что, помимо PDGFR-β, для идентификации перицитов 22,24,25 также использовались другие маркеры, такие как NG-2 и CD13. Таким образом, выбор правильного перицит-специфичного маркера для однозначной демонстрации перицитов по-прежнему остается сложной задачей. Это исследование предоставляет дополнительные доказательства того, что PDGFR-β является лучшим кандидатом для выявления морфологических особенностей перицитов.

Таким образом, мы продемонстрировали, что комбинация ретроорбитального введения флуоресцентного лектина томата, иммунофлуоресцентного окрашивания и очищения тканей позволила получить изображения с высоким разрешением, раскрывающие подробную морфологию перицитов в сосудистой сети сетчатки мыши в физиологических условиях. Эти результаты позволяют предположить, что этот метод может быть ценным для будущих исследований изменений перицитов сетчатки при патологических состояниях.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
4',6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI)	Thermo Fisher Scientific	D3571	Защита от света
Alexa Fluor 488 ослик против коз IgG (H+L)	Thermo Fisher Scientific	A-11055	Защита от света
C57BL/6 мышь	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.	SCXK (Jing) 2021-0006
Система конфокальной визуализации	Olympus	FV1200
Goat anti-PDGFR-β	Научно-исследовательские и опытно-конструкторские работы	AF1042	25 & микро; Г&нбсп;
Программное обеспечение Imaris	Oxford Instruments	v.9.0.1
Lycopersicon esculentum(Tomato) lectin, DyLight594	Thermo Fisher Scientific	L32471	1 мг
Микроцентрифужная пробирка	Axygen	MCT-150-C	1,5 мл
Нормальная сыворотка осла	Jackson ImmunoResearch	017-000-121	10 мл
Панорамный сканер срезов тканей	Olympus	VS120-S6-W
Photoshop и  Иллюстрация	Adobe	CS6
RapiClear 1.52 Solution	SunJin Lab	RC152001	10 мл
Шестилуночная пластина	Costar	3335
Пружинные ножницы	Fine Science Tools	15003-08
Предметное стекло для микроскопа Superfrost Plus	Thermo Fisher Scientific	4951PLUS-001	25 мм x 75 мм x 1 мм