Методическая статья

Ферментативная изоляция межклеточных везикул межтканевых мышц скелета

DOI:

10.3791/67439

⸱

7 февраля 2025 г.

 ,  ,  , 
1Regenerative Bioscience Center, Department of Animal and Dairy Science, College of Agricultural and Environmental Science, University of Georgia

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол направлен на выделение и очистку межклеточных везикул скелетных мышц (SkM-EVs) из мышечных тканей грызунов путем механической отслойки, ферментативной диссоциации, фильтрации и дифференциального ультрацентрифугирования. Это демонстрирует последовательность и надежность. Изолированные SkM-EV дают представление о мышечном гомеостазе и заболеваниях с потенциальным применением в качестве диагностических биомаркеров или терапевтических средств.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Внеклеточные везикулы (ВВ) представляют собой наночастицы, заключенные в липидный бислой, выделяемые клетками для транспортировки биологически активного груза, такого как белки, РНК и ДНК, для межклеточной коммуникации. Исследование EV-опосредованных перекрестных помех между клетками в мышечном гомеостазе и заболеваниях предлагает значительный потенциал для улучшения нашего понимания развития, регенерации и атрофии мышц. Тем не менее, существующие протоколы выделения ВВ, полученных из скелетных мышц (SkM-EV), сталкиваются с проблемами в достижении высокой чистоты и выхода, в первую очередь из-за трудностей в высвобождении ВВ из мышечных тканей без ущерба для клеточных мембран. В данной статье представлен эффективный протокол выделения SkM-EV, включающий механическую отслойку, ферментативную диссоциацию, фильтрацию и ультрацентрифугирование. Эти шаги оптимизированы для улучшения высвобождения EV из мышечных тканей, что дает SkM-EV высокой чистоты. Впоследствии проводят нанопроточную цитометрию, анализ БЦА и вестерн-блоттинг для характеристики количества и качества выделенных SkM-EV. Этот протокол обещает создать надежную платформу для получения тканевых EV для продвижения фундаментальных исследований, диагностики заболеваний и доставки лекарств.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Внеклеточные везикулы (ВВ) представляют собой наноразмерные, связанные с мембраной частицы, выделяемые клетками во внеклеточную среду. Эти ВВ переносят нуклеиновые кислоты, белки и липиды для модуляции нескольких сигнальных путей при их поглощении клетками-реципиентами. В частности, ВВ, выделенные из скелетных мышц (SkM-EV), участвуют в дегенерации, регенерации и росте мышц путем переноса миогенных регуляторных микроРНК или факторов транскрипции 1,2,3,4. По мере того, как наше понимание субпопуляций и характеристик SkM-EV продолжает развиваться, эти везикулы являются многообещающими в качестве биомаркеров для ранней диагностики 5,6 и в качестве терапевтических мишеней для нервно-мышечных расстройств. Эта расширяющаяся область открывает захватывающие возможности как для патологических исследований, так и для клинического применения.

Текущие исследования SkM-EV в основном сосредоточены на тех, которые получены из надосадочной жидкости клеточных культур после ex vivo культуры 2,7,8, что вызывает обеспокоенность по поводу точности целевых клеточных линий после последовательных пассажей и восприимчивости характеристик EV к изменению в искусственных условиях. Это подчеркивает необходимость выделения SkM-EV непосредственно из мышечных тканей, чтобы избежать влияния культуры ex vivo и лучше представлять условия in vivo. Несмотря на то, что было разработано несколько подходов к выделению ВВ из мышечных тканей, исследования по-прежнему значительно различаются в деталях протокола, что влияет на согласованность и сопоставимость. Срочно необходим стандартизированный протокол для выделения и определения характеристик SkM-EV для обеспечения надежности соответствующих исследований.

Учитывая физиологические особенности скелетной мускулатуры, мы разработали протокол выделения и очистки SkM-EV из образцов скелетных мышц грызунов с помощью механической отслойки, ферментативной диссоциации, фильтрации и дифференциального ультрацентрифугирования. Благодаря всестороннему анализу с использованием нанопроточной цитометрии, анализа BCA и вестерн-блоттинга мы обнаружили, что этот протокол стабильно дает SkM-EV высокой чистоты и количества в течение ограниченного периода времени. Его можно наносить на образцы скелетных мышц при различных состояниях, включая острые и хронические мышечные травмы. Кроме того, при соответствующей корректировке этот метод может быть адаптирован для мышечных тканей пациентов или других животных моделей. Стандартизация процесса выделения SkM-EV имеет важное значение для обеспечения стабильности качества SkM-EV, облегчения сравнения характеристик EV, таких как урожайность, размер, состав груза и функция, и продвижения их потенциального применения в качестве диагностических биомаркеров, а также улучшения нашего понимания их роли в различных физиологических и патологических процессах.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол изолирует внеклеточные везикулы (ВВ) из скелетной мышечной ткани с помощью механической отслойки, ферментативной диссоциации, фильтрации и дифференциального ультрацентрифугирования. Это позволяет изолировать ВВ от отдельных или комбинированных групп мышц конечностей грызунов, включая переднюю большеберцовую кость (TA), разгибатель длинного пальца (EDL), камбаловидную мышцу (SOL), икроножную мышцу (GAS) и четырехглавую мышцу (QUA). Использование животных было одобрено Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию в Университете Джорджии, и исследование соответствовало Рекомендациям Национальных институтов здравоохранения по уходу и использованию животных в исследованиях. Животные были размещены в помещениях для животных на факультете животноводства и молочных наук Университета Джорджии. В этом исследовании использовались взрослые самцы мышей дикого типа (C57BL/6J), ткань которых была собрана у мышей в возрасте 3 месяцев. Подробная информация об используемых реагентах и оборудовании представлена в Таблице материалов.

1. Механическая отслойка мышечных групп от мыши

  1. Усыпьте мышей сCO2 с последующим вывихом шейки матки (в соответствии с утвержденными в учреждении протоколами). Побрейте обе задние конечности.
  2. Закрепите ножку мыши в стерильной пластине передней стороной ножки вверх (рисунок 1A).
  3. Сделайте небольшой надрез (5 мм) на коже с боковой стороны лодыжки мыши с помощью ножниц для препарирования.
  4. Осторожно введите одно лезвие ножниц в разрез, расположив его под кожей, но не в подлежащих мышечных тканях. Затем разрежьте кожу вверх по направлению к колену, чтобы увеличить длину разреза.
  5. Захватите кожу вдоль разреза с помощью пинцета с грубым концом и расширяйте отверстие до тех пор, пока мышца не станет видна.
  6. Найдите мышцу ТА, которая проходит от колена до лодыжки на боковой стороне большеберцовой кости11, и с помощью пинцета с острым концом захватите и снимите тонкий слой соединительной ткани, покрывающий мышцу (рисунок 1B).
  7. Рядом с лодыжкой определите два сухожилия на конце ТА, одно из которых напрямую соединено с мышцей ТА, а другое — с сухожилием EDL, которое меньше и расположено рядом с сухожилием ТА на боковой стороне. Разрежьте оба сухожилия с помощью ножниц для рассечения.
  8. Возьмитесь за оба сухожилия пинцетом с шероховатым концом. Затем используйте еще одну пару шероховатых или острых пинцетов, чтобы отделить сухожилия, тем самым отделив TA от EDL (Рисунок 1C).
  9. Поднимите ТА за только что разорванное сухожилие с помощью пинцета с шероховатым концом. Затем разрежьте сухожилие ТА возле колена с помощью ножниц для препарирования, таким образом удалив мышцу. Повторите этот процесс, чтобы удалить EDL, и храните обе мышцы в PBS на льду.
  10. Отпустите ногу и переверните мышь так, чтобы задняя морда была обращена вверх.
  11. Теперь, когда кожа на ноге частично удалена, разрежьте кожу возле лодыжки с помощью ножниц для препарирования. Затем с помощью пинцета с шероховатым концом захватите и снимите кожу вверх к задней части колена, обнажая GAS.
  12. Разрежьте сухожилие GAS возле лодыжки с помощью ножниц для рассечения (Рисунок 1D).
  13. Возьмитесь за сухожилие GAS с помощью пинцета с шероховатым концом и поднимите его вверх, чтобы обнажить нижнюю часть GAS.
  14. Расположите небольшое сухожилие SOL на нижней стороне GAS рядом с коленом (где GAS все еще подключено). Разрежьте сухожилие SOL с помощью ножниц для препарирования, заставляя SOL сокращаться вверх (Рисунок 1E).
  15. Возьмитесь за разорванное сухожилие SOL пинцетом с острым концом и осторожно поднимите его, тем самым отделив SOL от нижней стороны GAS.
  16. Отрежьте конец SOL в том месте, где он прикрепляется к отрезанному концу GAS с помощью ножниц для препарирования, таким образом разделяя две мышцы. Сохраняйте SOL в PBS на льду.
  17. Отрежьте конец ГАС возле колена и положите его в ПБС на лед.
  18. После удаления четырех перечисленных мышц ниже колена переверните мышку так, чтобы передняя сторона лица была направлена вверх.
  19. При необходимости дополнительно отшлифуйте кожу пинцетом с шероховатым концом, чтобы обнажить QUA. Расположите ножку мыши под углом 90°, чтобы заставить QUA сгибаться. Разрежьте сухожилие, ближайшее к колену, с помощью ножниц для препарирования.
    1. Отделите КВА от бедренной кости, разрезав ее между мышцей и костью до тех пор, пока КВА не будет соединена только проксимальным сухожилием (Рисунок 1E). Затем разорвите проксимальное сухожилие и удалите QUA. Поместите QUA в PBS на лед.
  20. Следите за тем, чтобы после отслойки мышц большеберцовая и малоберцовая кости были четко обнажены (рисунок 1F).
  21. Промойте мышцы несколько раз с помощью PBS, чтобы удалить загрязнения, такие как шерсть и кровь (Рисунок 1G). Затем аккуратно высушите мышцы бумажными полотенцами. Используйте аналитические весы для измерения мышечной массы, которые позже будут использоваться для расчета EV, собранного на грамм мышц.

2. Ферментативная диссоциация оторванных мышечных фрагментов

  1. Аккуратно удалите мышечные сухожилия из мышечного образца с помощью пинцета с острым концом, пинцета-осколка, скальпеля или ножниц (рисунок 2A).
  2. После удаления сухожилия разрежьте мышцу в продольном направлении вдоль мышечных волокон (от сухожилия до сухожилия) на мышечные куски толщиной 1 мм с помощью ножниц или скальпеля, чтобы увеличить отношение площади поверхности к объему (рис. 2B, C).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Старайтесь ограничить повреждение миоволокна во время резки. Для более крупных мышц, таких как TA, GAS и QUA, делайте дополнительные разрезы по сравнению с меньшими мышцами, такими как EDL и SOL, чтобы обеспечить примерно одинаковое отношение площади поверхности к объему во всех образцах мышц (рис. 2D).
  3. Приготовьте 10 мл свежего буфера пищеварительных ферментов (ДЭБ) для каждой мыши и держите его на льду до использования.
    1. Для приготовления ДЭБ смешайте 2 мг фермента коллагеназы II на 1 мл модифицированной орлиной среды Дульбекко (DMEM) с 1% раствором пенициллин-стрептомицина. После смешивания отфильтруйте раствор через фильтр 0,2 мкм.
    2. Убедитесь, что ферментативная активность ДЭБ составляет более 250 единиц. Делайте ДЭБ вихрем до тех пор, пока раствор полностью не перемешается и порошок фермента коллагеназа II не исчезнет.
  4. Разделите мышечную ткань на аликвоты, каждая из которых содержит 20 мг мышечной ткани. Затем добавьте 1 мл ДЭБ в каждую аликвоту для ферментативной диссоциации.
  5. Инкубируйте ДЭБ и мышечную смесь в шейкере в инкубаторе при температуре 37 °C в течение 12 ч со скоростью встряхивания 100 оборотов в минуту (об/мин) (рис. 2E).

3. Фильтрация и низкоскоростное центрифугирование для обогащения SkM-EV

ПРИМЕЧАНИЕ: Установите охлаждаемую центрифугу на 4 °C и запускайте ее до тех пор, пока она не достигнет заданной температуры. Храните все необходимые пробирки и образцы на льду до тех пор, пока они не будут готовы к использованию.

  1. После процедур ферментативного пищеварения убедитесь, что не видно заметных мышечных фрагментов (Рисунок 3A). Перед центрифугированием в холодильнике извлеките 10 мкл раствора из DEB-мышечной смеси и переложите его в пробирку объемом 0,2 мл для тестирования жизнеспособности клеток, если это необходимо.
  2. Подготовьте и промаркируйте новые пустые микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл. Установите фильтр 0,45 мкм и шприц объемом 5 мл, сняв поршень (не выбрасывайте) и вкрутив ступицу в верхний конец фильтра 0,45 мкм. Расположите фильтр так, чтобы нижний конец был помещен в только что помеченную пустую пробирку (Рисунок 3D). Отфильтруйте 1x PBS через фильтр 0,2 мкм.
  3. Центрифугируйте смесь в течение 10 минут при 1 000 x g и 4 °C, чтобы удалить любой мусор (Рисунок 3B). Перенесите надосадочную жидкость (около 1 мл) в шприц с помощью микропипетки P200 (рис. 3C,E).
  4. Снова вставьте поршень шприца и медленно протолкните надосадочную жидкость через фильтр, позволяя ей пройти и собраться в только что помеченной микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 мл (рис. 3F).
  5. Снова извлеките поршень и нанесите пипеткой примерно 200 мкл 1x PBS в шприц.
  6. Снова вставьте поршень и медленно протолкните 200 мкл 1x PBS через фильтр (рис. 3G), чтобы удалить остатки надосадочной жидкости из фильтра и поместить их в маркированную микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл.
  7. Повторите процесс фильтрации для других пробирок, используя новый фильтр для каждого образца ткани.
  8. После фильтрации убедитесь, что раствор прозрачный и не содержит остаточных мышечных фрагментов (рисунок 3H).

4. Дифференциальное ультрацентрифугирование для очистки SkM-EV

ПРИМЕЧАНИЕ: Установите охлаждаемую центрифугу на 4 °C и запускайте ее до тех пор, пока она не достигнет заданной температуры. Храните все необходимые пробирки и образцы на льду и будьте готовы к использованию.

  1. Перенесите отфильтрованный раствор в новые микропробирки объемом 1,5 мл (подходящие для до 200 000 x g). Сбалансируйте все микропробирки с помощью дополнительного PBS 1x, чтобы обеспечить одинаковый объем, прежде чем помещать их в микроультрацентрифугу.
  2. Убедившись, что объем всех пробирок одинаков, закройте пробирки и поместите их в ротор микроультрацентрифуги, которую необходимо сбалансировать (рисунок 4A).
  3. Включите микроультрацентрифугу и настройте ее на работу в течение 1 часа при температуре 100 000 x g и 4 °C (рис. 4B).
  4. Поместите ротор с пробирками в микроультрацентрифугу, закройте крышку и включите вакуум (Рисунок 4C).
  5. Как только вакуум достигнет уровня 2, нажмите кнопку запуска и дождитесь завершения процесса центрифугирования (Рисунок 4D).
  6. После завершения цикла микроультрацентрифуги нажмите на кнопку вакуума, чтобы восстановить давление в камере перед снятием ротора и пробирок. Держите трубки на льду и расположите их вертикально, чтобы не потревожить гранулы.
  7. Осторожно удалите надосадочную жидкость с помощью микропипетки P200, не допуская нарушения работы гранулы (Рисунок 4E).
  8. Извлеките наконечник, затем добавьте 50 мкл 1x PBS в пробирку после удаления надосадочной жидкости с помощью микропипетки P200. Для образцов GAS и QUA добавьте до 500 мкл 1x PBS для ускорения растворения (рис. 4F).
  9. Повторно суспендируйте гранулу, осторожно пипетируя вверх и вниз с помощью микропипетки P20 (или микропипетки P200, если было добавлено 500 μL) до тех пор, пока она полностью не разломится и больше не станет видимой.
  10. Закройте пробирку и храните ее при температуре 4 °C для кратковременного хранения (менее одной недели), -80 °C для длительного хранения или поместите пробирку обратно на лед, если образец будет немедленно охарактеризован с помощью нанопроточной цитометрии, вестерн-блоттинга или других анализов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В соответствии с этим протоколом внеклеточные везикулы скелетных мышц (SkM-EV) были успешно извлечены из различных групп мышц, включая переднюю большеберцовую кость (TA), длинный разгибатель пальца (EDL), камбаловидную (SOL), икроножную мышцу (GAS) и четырехглавую мышцу (QUA) у мышей дикого типа. Последующая характеристика этих SkM-EV была проведена с помощью нанопроточной цитометрии, выяснев их отличительные особенности, как указано в таблице 1. Примечательно, что из всего лишь 1 г мышечной ткани был по...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протокол начинается с препарирования групп мышц задних конечностей у мышей или получения посмертногомышечного материала человека на основе имеющихся протоколов. Следующие процедуры изоляции внеклеточных везикул скелетных мышц (SkM-EVs) включают в себя три основных этапа: мягкое ферментативное расщепление ткани для высвобождения интерстициальных SkM-EVs, фильтрация и низкоскоростное центрифугирование, а также ультрацентрифугирование. Наконец, для профилирования изо...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана Министерством обороны W81XWH2210261 (до Яо Яо).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Микроцентрифужные пробирки 0,6 млThermoFisher Scientific05-408-120
1,5 мл микропробирки (C) Eppendorf5720411009
1,5 мл микроцентрифужные пробиркиThermoFisher Scientific3448Прозрачный, градуированный, нестерильный
BD 5 мл ШприцBecton Dickinson14-827-52 Наконечник Люэр-Лока
Предметные стекла для подсчета клеток, двойная камера для счетчика клетокBio-Rad145-0011
Центрифуга 5430REppendorf22620667
Чистящий растворNanoFCM Inc.
Коллагеназа IIWorthington Biochemical CorporationLS004176
DPBS (10x) Жидкость (-кальций,-магний)CytivaSH30378.02Окончательное используемое разведение составляет 1x
DPBS/Модифицированный (1x)CytivaSH30264.02
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)Genesee Scientific25-500
E-POD Pure Выносной дозатор водыMillipore SigmaZRXSP0D01
FA-45-30-11 Ротор микроцентрифугиEppendorf05-401-503
Fisher Vortex Genie 2ThermoFisher Scientific12-812
Flow NanoAnalyzerNanoFCM Inc.
Heratherm OGS60 General Protocol OvenThermoFisher Scientific51028112гравитационная конвекция, 2,3 куб.фута 120 В
MemGlow-488 ProbeCytoskeleton Inc.MG01-02
Millipak Специальный дозатор MilliporeSigmaTANKMPK02
пенициллин-стрептомицинGibco15070063
пипетка Pipet-Lite LTS L-1000XLS+Rainin17014382
пипетка Pipet-Lite LTS L-200XLS+Rainin17014391
пипетка Pipet-Lite LTS L-20XLS+Rainin17014392
Наконечники для пипеток ER LTS 1000µ L F 768G/8Наконечники для30808038
ER LTS 20&микро; L F 960G/10Наконечники для30807966
ER LTS 200&микро; L F 960G/10Rainin30807967
Бусины для контроля качестваNanoFCM Inc.
S110-AT Ротор с фиксированным угломнаклона ThermoFisher Scientific455391,10,000 об/мин
S16 exo 65-155 нм бусиныNanoFCM Inc.
НожницыSPI, США
Sorvall mX 150+ Микро-ультрацентрифугаThermoFisher Scientific50135641
TC 20 автоматический счетчик клетокBio-Rad1450102
Trypan Blue SolutionCorning25-900-CI
ПинцетSPI, США
VWR 15mL центрифуга пробиркиAvantor89039-668
Ватман Пурадиск 13 фильтровCytiva6782-13040.45 & микро; m размер пор
Wild-type C57BL/6J мышиJackson Laboratorystock #000664
пипеток Rainin пипеток Rainin

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yamaguchi, A., et al. Pulsed ultrasound promotes secretion of anti-inflammatory extracellular vesicles from skeletal myotubes via elevation of intracellular calcium level. Elife. 12, 89512(2023).
  2. Yamaguchi, A., et al. Skeletal myotube-derived extracellular vesicles enhance itaconate production and attenuate inflammatory responses of macrophages. Front Immunol. 14, 1099799(2023).
  3. Takada, Y., et al. Tumor necrosis factor-α blunts the osteogenic effects of muscle cell-derived extracellular vesicles by affecting muscle cells. Calcif Tissue Int. 112 (3), 377-388 (2023).
  4. Bourgeois, B. L., Levitt, D. E., Molina, P. E., Simon, L. Differential expression of adipocyte and myotube extracellular vesicle miRNA cargo in chronic binge alcohol-administered siv-infected male macaques. Alcohol. 108, 1-9 (2023).
  5. Kargl, C. K., et al. Angiogenic potential of skeletal muscle derived extracellular vesicles differs between oxidative and glycolytic muscle tissue in mice. Sci Rep. 13 (1), 18943(2023).
  6. Vann, C. G., et al. Differential microRNA profiles of intramuscular and secreted extracellular vesicles in human tissue-engineered muscle. Front Physiol. 13, 937899(2022).
  7. Anakor, E., et al. The neurotoxicity of vesicles secreted by als patient myotubes is specific to exosome-like and not larger subtypes. Cells. 11 (5), 845(2022).
  8. Mendhe, B., et al. Lyophilized extracellular vesicles from adipose-derived stem cells increase muscle reperfusion but degrade muscle structural proteins in a mouse model of hindlimb ischemia-reperfusion injury. Cells. 12 (4), 557(2023).
  9. Madison, R. D., Robinson, G. A. Muscle-derived extracellular vesicles influence motor neuron regeneration accuracy. Neuroscience. 419, 46-59 (2019).
  10. Hanson, B., et al. EV-mediated promotion of myogenic differentiation is dependent on dose, collection medium, and isolation method. Mol Ther Nucleic Acids. 33, 511-528 (2023).
  11. Frimand, Z., Das Barman, S., Kjær, T. R., Porpiglia, E., De Morrée, A. Isolation of quiescent stem cell populations from individual skeletal muscles. J Vis Exp. 190, e64557(2022).
  12. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (misev2018): A position statement of the international society for extracellular vesicles and update of the misev2014 guidelines. J Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  13. Welsh, J. A., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles (misev2023): From basic to advanced approaches. J Extracell Vesicles. 13 (2), e12404(2024).
  14. Fan, Y., et al. Differential proteomics argues against a general role for CD9, CD81 or CD63 in the sorting of proteins into extracellular vesicles. J Extracell Vesicles. 12 (8), e12352(2023).
  15. Baietti, M. F., et al. Syndecan-syntenin-Alix regulates the biogenesis of exosomes. Nat Cell Biol. 14 (7), 677-685 (2012).
  16. Shanely, R. A., et al. Human skeletal muscle biopsy procedures using the modified bergström technique. J Vis Exp. (91), e51812(2014).
  17. Mousavi, K., Miranda, W., Parry, D. J. Neurotrophic factors enhance the survival of muscle fibers in edl, but not sol, after neonatal nerve injury. Am J Physiol Cell Physiol. 283 (3), C950-C959 (2002).
  18. Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nat Protoc. 10 (10), 1612-1624 (2015).
  19. Ishii, K., Suzuki, N., Mabuchi, Y., Sekiya, I., Akazawa, C. Technical advantage of recombinant collagenase for isolation of muscle stem cells. Regen Ther. 7, 1-7 (2017).
  20. Motohashi, N., Asakura, Y., Asakura, A. Isolation, culture, and transplantation of muscle satellite cells. J Vis Exp. (86), e50846(2014).
  21. Mozzetta, C. Isolation and culture of muscle stem cells. Methods Mol Biol. 1480, 311-322 (2016).
  22. Clemens, Z., Wang, K., Ambrosio, F., Barchowsky, A. Arsenic disrupts extracellular vesicle-mediated signaling in regenerating myofibers. Toxicol Sci. 195 (2), 231-245 (2023).
  23. Ma, S., et al. Skeletal muscle-derived extracellular vesicles transport glycolytic enzymes to mediate muscle-to-bone crosstalk. Cell Metab. 35 (11), 2028-2043.e7 (2023).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи