Тест на эффективность трансляции с использованием полисомных профилей в условиях теплового напряжения

Краткое содержание

Представленный здесь протокол включает в себя полисомальное профилирование для выделения транслатома, мРНК, связанных с рибосомами, в неполисомальные и полисомальные РНК из Arabidopsis с помощью центрифугирования градиента плотности сахарозы. Этот метод демонстрирует эффективность трансляции термически напряженного арабидопсиса.

Аннотация

Трансляционный контроль различных генов в условиях теплового стресса является критически важным этапом для адаптации растений к окружающей среде. Оценка трансляционной активности различных генов может помочь нам понять молекулярные механизмы, лежащие в основе устойчивости растений, способствуя развитию культур с повышенной стрессоустойчивостью в условиях глобального изменения климата. В данной работе представлена подробная методология оценки эффективности трансляции с помощью полисомного профилирования на предприятиях, подверженных тепловому стрессу. Процедура разделена на три части: обработка термическим стрессом для арабидопсиса, проверка эффективности трансляции с использованием полисомных профилей и расчет эффективности трансляции путем выделения неполисомальной и полисомальной РНК на основе профиля. В первой части растения Arabidopsis подвергаются контролируемому тепловому стрессу, чтобы имитировать проблемы окружающей среды. Обработка включает в себя воздействие на растения высоких температур в течение заданного времени, что обеспечивает постоянную и воспроизводимую индукцию напряжения. Этот шаг имеет решающее значение для изучения физиологических и молекулярных реакций растения на тепловой стресс. Вторая часть включает в себя проверку эффективности трансляции с помощью полисомного профилирования. Полисомы экстрагируются с помощью градиентного центрифугирования сахарозы, которое разделяет мРНК на основе рибосомной нагрузки. Это позволяет исследовать занятость рибосом на мРНК, что дает представление о механизмах трансляционного контроля в условиях стресса. В третьей части РНК выделяется как из полисомных, так и из неполисомальных фракций. Spike-in РНК используется для точного измерения количества РНК в каждой фракции. Расчет эффективности трансляции выполняется путем сравнения распределения мРНК по этим фракциям в нормальных условиях и в условиях теплового стресса. Трансляционную активность конкретных генов дополнительно оценивают путем проведения количественной ПЦР в реальном времени (qRT-PCR) с рибосом-ассоциированной РНК и общей РНК. Эта методология фокусируется исключительно на эффектах теплового стресса, предоставляя подробный протокол для анализа трансляционной регуляции в растениях.

Введение

Трансляция имеет решающее значение для организмов для синтеза функциональных белков из мРНК, поддерживая основные клеточные функции и биологические процессы, такие как метаболизм и передача сигналов, а также обеспечивая реакцию на стресс. Без трансляции клетки не могут производить жизненно важные белки, что влияет на их структуру, функцию и регуляцию, тем самым влияя на поддержание жизни и способствуя биологическому разнообразию ^1,2. Поэтому изучение трансляционной эффективности растений имеет решающее значение. Перевод включает в себя несколько важных этапов. Во-первых, инициация происходит по мере того, как мРНК связывается с рибосомой, чему способствуют факторы инициации, такие как eIFs у эукариот, которые идентифицируют стартовый кодон, обычно AUG. Затем происходит элонгация в виде молекул транспортной РНК (тРНК), каждая из которых несет определенные аминокислоты, последовательно связывающиеся с рибосомой. Между соседними аминокислотами образуются пептидные связи, удлиняющие полипептидную цепь в соответствии с последовательностью мРНК. Наконец, терминация инициируется при встрече со стоп-кодоном (UAA, UAG или UGA), распознаваемым факторами высвобождения, которые побуждают рибосому высвобождать вновь синтезированный белок. На протяжении всей трансляции различные эукариотические факторы инициации (эИФ), факторы элонгации и рибосомные РНК работают вместе, обеспечивая точность и эффективность ^3,4.

Предыдущие исследования показали, что посттрансляционные модификации играют решающую роль в регулировании взаимодействия между эИФ и, таким образом, влияют на эффективность перевода. Исследования in vitro показали, что киназа казеина 2 (CK2) фосфорилирует eIF3c, eIF5 и eIF2β, увеличивая их взаимодействие друг с другом и с eIF1 ^5,6. В темноте E3-лигаза КОНСТИТУТИВНО ФОТОМОРФОГЕННАЯ 1 (COP1) подавляет трансляцию, ингибируя TOR-опосредованное фосфорилирование S6K-RPS6. Нефосфорилированный RPS6 не способен образовывать функциональные рибосомы, тем самым останавливая^{трансляцию}. И наоборот, в световых условиях киназа супрессор PHYA 105 (SPA1) фосфорилирует eIF2α, облегчая сборку комплекса eIF2 и способствуя инициации трансляции⁸. Эти результаты подчеркивают сложные механизмы контроля, которые регулируют трансляцию в ответ на сигналы окружающей среды.

Умеренные стимулы окружающей среды могут эффективно способствовать трансляционным процессам, способствующим росту, таким как фотоморфогенез ^8,9. Однако, когда факторы окружающей среды являются чрезмерными, неподвижные растения должны развивать соответствующие регулирующие механизмы для смягчения ущерба, вызванного экологическим стрессом¹⁰. В предыдущих исследованиях, связанных со стрессовыми реакциями растений, большинство из них были сосредоточены на регуляции на метаболическом, гормональном и транскрипционном уровнях 11,12,13,14. Тем не менее, недавние исследования начали подчеркивать влияние трансляционной регуляции на стрессоустойчивость растений 15,16,17. Установки могут повысить свою стрессоустойчивость за счет снижения поступательной эффективности, тем самым сводя к минимуму ненужное потребление энергии. Из-за образования немембранозных стрессовых гранул в растительных клетках нетранслируемая мРНК и ассоциированные белки агрегируются внутри них, снижая эффективность трансляции¹⁸. Одним из распространенных стрессов окружающей среды, с которыми часто сталкиваются растения, является тепловой стресс, который, как сообщается, вызывает образование стрессовых гранул в растительных клетках^19,20. Глобальное повышение средних температур из-за глобального потепления серьезно влияет на урожайность сельскохозяйственных культур²¹. Поэтому изучение физиологической регуляции растений в условиях теплового стресса имеет решающее значение. Предыдущее исследование показало, что термическая обработка пшеницы привела к снижению мРНК, связанной с полисомами. Тем не менее, мРНК, хранящиеся в стрессовых гранулах, высвобождались и возвращались в рибосомы, облегчая трансляцию после восстановления²². Кроме того, в предыдущих исследованиях сравнивали экспрессию генов между общей мРНК и связанной с полисомами мРНК у погруженных в воду растений¹⁶. Результаты показали, что равновесные уровни мРНК, связанные с абсцизовой кислотой и абиотическими стрессовыми реакциями, незначительно увеличивались после погружения. Кроме того, значительно увеличилось количество мРНК, связанных с полисомами. Эти результаты свидетельствуют о том, что регулирование трансляции может играть более важную роль в контроле устойчивости растений к стрессу. Таким образом, эффективный метод выделения полисомальных РНК имеет решающее значение для изучения транслатома образцов, подвергшихся стрессовой обработке.

В этом протоколе мы модифицировали метод выделения РНК с высокорискованной и объемной экстракции фенол/хлороформ методом осаждения LiCl на метод мелкомасштабной экстракции фенола/тиоцианата гуанидиния, который требует меньшего объема. Первый метод предполагает прямое смешивание с полисомальными фракциями, в результате чего получается более крупный экспериментальный отход ^9,15,23. В отличие от этого, этот модифицированный подход использует принципы дифференциальной плотности: полисомальная РНК сначала смешивается с раствором с высоким содержанием соли и сахара, а затем осаждается ультрацентрифугированием. В дальнейшем проводят экстракцию РНК с использованием небольшого объема реагента фенол/гуанидиния тиоцианат. Такой метод эффективно снижает образование органических отходов, делая наш эксперимент более экологичным. Кроме того, используемые органические растворители обладают меньшей токсичностью. Эти причины побудили нас соответствующим образом скорректировать и усовершенствовать экспериментальные процедуры. Кроме того, предыдущие методы не предоставляли исчерпывающего протокола для расчета эффективности трансляции с использованием нормализации с помощью пиковой нормализации, которая необходима для более глубокого транслатомического анализа.

В данной статье мы описываем профилирование полисом и протокол выделения полисомальной РНК для исследования эффективности трансляции и транслатомический анализ у Arabidopsis в условиях теплового шока. Этот протокол был использован для оценки эффективности трансляции в диком типе Col-0 в нормальных условиях, условиях теплового шока и после восстановления. Результаты профилирования полисом и процентное содержание полисомальной РНК выявили изменения в эффективности трансляции после обработки тепловым стрессом у рассады арабидопсиса .

Протокол

1. Подготовка образца рассады арабидопсиса с термическим стрессом

1. Пластина 250 семян для каждой реплики и каждого состояния с пипеткой на фильтровальной бумаге, помещенной на агаровую пластину Мурашиге и Скуга (MS) без сахарозы (pH 5,6) с добавлением 1,2% фитоагара.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для посадки рассады на пластины MS на пластину кладут стерильную фильтровальную бумагу, чтобы предотвратить проникновение корней рассады глубоко в среду, что облегчает отбор проб. Затем семена высаживают поверх фильтровальной бумаги. Чтобы исключить влияние сахаров на рост растений и результаты экспериментов, рекомендуется использовать для выращивания среду МС, не содержащую сахарозу.
2. Оберните пластину MS с высаженными семенами алюминиевой фольгой, чтобы блокировать свет, и инкубируйте при 4 °C в течение 2 дней, чтобы вызвать яровизацию.
3. Перенесите яровизированные семена в камеру роста для выращивания в течение 16 ч: 8 ч, светло-темного фотопериода при 22 °C с интенсивностью света 100 мкмоль/^м2/с.
4. Для образцов с тепловым стрессом заклейте пластины MS Medium, содержащие 5-дневную рассаду, водонепроницаемой клейкой лентой и поместите их на водяную баню при температуре 40 °C на 1 час.
5. Для образцов, восстанавливающихся после термической обработки, пластины охлаждают сразу после термической обработки. Затем поместите их в камеру роста при температуре 22 °C на 2 часа.
6. Соберите 250 саженцев с обработанными или необработанными в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл для каждой реплики и немедленно заморозьте образцы в жидком азоте.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждого условия были подготовлены две группы образцов. Один из них предназначен для анализа полисомного профилирования, а другой — для экстракции неполисомальных и полисомальных РНК.

2. Приготовление градиента сахарозы

1. Приготовьте градиентный раствор, содержащий следующие концентрации сахарозы: 12,5%, 24,4%, 36,3%, 48,1% и 60%. В состав раствора входят 50 мМ Tris-HCl, 25 мМ KCl, 10 мМ MgCl₂, 100 мкг/мл гепарина и 50 мкг/мл циклогексимида (CHX).
2. Загружайте градиентные растворы от высокой концентрации к низкой, начиная снизу и двигаясь вверх. После добавления каждой концентрации градиентного раствора заморозьте раствор до твердого состояния перед добавлением следующей концентрации. На каждую концентрацию градиента сахарозы добавьте 2,2 мл. Этот процесс приведет к прерывистому градиенту плотности сахарозы.
3. Приготовленный градиент сахарозы временно хранить при температуре -80 °C и разморозить в течение ночи при температуре 4 °C перед использованием.

3. Подготовка образцов полисомного профилирования

1. Измельчите 250 5-дневных саженцев Col-0, подвергшихся термическому стрессу или необработанных, которые были предварительно заморожены в порошок с помощью гомогенизатора с частотой 30 циклов/с в течение 1 минуты.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Когда количество растений с одинаковым фоном одинаково, они имеют одинаковый выход экстракции РНК. Тем не менее, при сравнении гиперэкспрессирующих трансгенных или мутантных растений с разным фоном, количество используемых растений должно быть скорректировано в соответствии с условиями растения.
2. Для получения экстракционного раствора, содержащего неполисомальную и полисомальную РНК, в каждую пробирку добавляют 500 мкл экстракционного буфера из полисом (200 мМ Tris-HCl, pH 8,0, 50 мМ KCl, 25 мМ MgCl₂, 50 мкг/мл циклогексимид, 100 мкг/мл гепарина, 2% PTE, 10% DOC, 400 ед/мл ингибитора рибонуклеазы) и перемешивают образцы путем инвертирования и вортексирования. Следите за тем, чтобы в образцах сохранялась температура 4 °C на протяжении всего процесса.
3. Центрифугируйте экстракционный раствор при 4 °C, 12 000 x g в течение 10 минут. Затем отфильтруйте надосадочную жидкость через сетчатое фильтр 100 мкм, чтобы получить прозрачный раствор для экстракции без частиц.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Частицы, присутствующие в экстракционном растворе, могут осаждаться во время ультрацентрифугирования, потенциально образуя гранулы, которые могут повлиять на точность измерений профилирования полисом.
4. Загрузите отфильтрованную надосадочную жидкость на заранее подготовленный градиент сахарозы и убедитесь, что он достигает равновесия.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за высокой скорости вращения ультрацентрифуги важно обеспечить как безопасность, так и правильное функционирование ультрацентрифуги. Чтобы добиться этого, необходимо перед вращением подтвердить, что вес образца идентичен. Поэтому мы используем прецизионные весы, чтобы убедиться, что веса градиентов абсолютно однородны.
5. Центрифугирование градиента сахарозы с загруженными образцами при 4 °C, 210 000 x g в течение 3,5 ч с помощью ультрацентрифуги с качающимся ведром. Установите скорости ускорения и замедления на максимум. После ультрацентрифугирования неполисомальные и полисомальные РНК распределяются в соответствии с их плотностью в соответствующем растворе градиента сахарозы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При градиенте сахарозы неполисомальная РНК с более низкой плотностью распределяется в верхнем слое, в то время как полисомальная РНК, характеризующаяся более высокой плотностью из-за наличия многочисленных рибосом, участвующих в активной трансляции на мРНК, распределяется в нижнем слое. Впоследствии профилирование полисом может быть измерено с помощью фракционатора градиента плотности.

4. Анализ полисомного профилирования

ПРИМЕЧАНИЕ: Для измерения профилирования полисом используется фракционатор градиента плотности с микрообъемным шприцевым насосом.

1. Приготовьте раствор для погони (70% сахарозы, 10% глицерина и 0,02% бромофенола синего) для микрообъемного шприцевого насоса.
2. Используйте программное обеспечение для управления фракционатором градиента плотности. Откалибруйте машину с помощью деионизированной воды. После калибровки используйте его для выполнения полисомного профилирования.
   1. Чтобы выполнить настройку базовой линии, включите UV/VISDetector до тех пор, пока свет не изменится с красного на зеленый. Отрегулируйте ручку смещения рекордера , чтобы выровнять линию маркера, затем поверните ручку регулировки базовой линии в минимальное открытое положение. Установите ручку чувствительности на UV/VISdetector на уровень 2.0 и нажмите кнопку Auto Baseline . Наконец, с помощью ручки смещения рекордера установите желаемую базовую линию на 20. Процесс калибровки будет варьироваться в зависимости от марки механизма и различных образцов.
3. После ультрацентрифугирования поместите пробирки с образцами в ректификатор градиента плотности с помощью системы прокалывания пробирки, чтобы пробирку можно было подключить к шприцевому насосу с раствором для слежки и УФ-детектором.
4. Переключите ректификатор градиента плотности в режим программного управления (REMOTE) и установите скорость впрыска микрообъемного шприцевого насоса на 3 мл/мин.
5. Запустите настройки программного обеспечения, чтобы начать и получить график профиля полисом с помощью фракционатора, измерив наружный диаметр₂₅₄.

5. Выделение неполисомальных и полисомальных РНК

ПРИМЕЧАНИЕ: Для этой части протокола использовалась другая группа образцов из той же партии после выполнения ультрацентрифугирования с выполнением тех же этапов, которые были описаны ранее.

1. На основании результатов измерения профиля полисом соберите отдельно фракции неполисомальной и полисомальной РНК. Рассчитайте объемы раствора как для неполисомных, так и для полисомальных фракций и соберите неполисомальную фракцию (верхнюю часть).
   Примечание: Согласно профилям, фракция с более чем двумя рибосомами определяется как полисомальная фракция, тогда как фракция с пиками рРНК 40S, 60S и 80S определяется как неполисомальная фракция.
2. Тщательно перемешайте целевые фракции РНК с предварительно холодным 2x высокосолевым раствором (400 мМ Tris-HCl, pH 8,0, 100 mM KCl, 50 мМ MgCl₂).
3. Добавьте 8 мкл разведенного запаса Eukaryotic Poly-A RNA Control из набора.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для нормализации всплеска, необходимой для седьмого шага. Набор для контроля РНК Eukaryotic Poly-A включает в себя гены B. subtilis , такие как ген DAP , которые отсутствуют у растений, в качестве референсных генов. Чтобы определить долю потери референсного гена во время реакции после экстракции, перед экстракцией добавьте равное количество реагента, содержащего образец РНК гена DAP , в разные пробирки с неполисомальной или полисомальной РНК. Это позволяет определить долю потери референсного гена во время реакции после экстракции и может быть использовано в целях нормализации.
4. Центрифугируйте смешанную РНК с высоким содержанием солей при 4 °C, 450 000 x g, в течение 5 ч с помощью ультрацентрифуги с качающимся ротором.
5. После ультрацентрифугирования РНК будет осаждаться на дне центрифужной пробирки. Аккуратно слейте надосадочную жидкость сверху, чтобы сохранить гранулу РНК на дне.
6. Быстро промойте гранулу РНК 500 μл предварительно холодной воды, обработанной диэтилпирокарбонатом (DEPC), повторив этот шаг 3 раза.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы предотвратить повторное растворение РНК в воде, обработанной DEPC, необходимо предварительно охладить воду, обработанную DEPC, перед использованием, чтобы снизить ее растворимость. Кроме того, время контакта между водой, обработанной DEPC, и гранулой РНК во время промывки должно быть сведено к минимуму.

6. Экстракция неполисомальных и полисомальных РНК

1. Добавьте 500 мкл реагента для экстракции РНК и смешайте с образцом РНК, который необходимо экстрагировать. Выдерживать в течение 10 минут.
2. Добавьте 100 μл хлороформа, тщательно перемешайте и инкубируйте в течение 10 минут для разделения фаз.
3. Центрифугируйте реакционную смесь при 4 °C, 12 000 x g в течение 10 минут. Перенесите верхний прозрачный водный слой, содержащий РНК, в новую пробирку, аккуратно смешайте его с равным объемом изопропанола и инкубируйте при -20 °C в течение 2 ч для осаждения РНК.
4. После осаждения центрифугировать при 4 °C, 12 000 x g в течение 10 минут. Осторожно выбросьте надосадочную жидкость и оставьте гранулу РНК на дне.
5. Промойте гранулу РНК 1 мл предварительно охлажденного 75% этанола. Центрифугируйте при 4 °C, 12 000 x g в течение 10 минут, выбросьте надосадочную жидкость и высушите гранулу РНК на воздухе.
6. После высыхания гранулы РНК повторно суспендируйте гранулу РНК в 30 мкл воды, обработанной DEPC, и измерьте концентрацию РНК (OD₂₆₀) с помощью спектрофотометра полного спектра (220 нм-750 нм).

7. Нормализация с резким увеличением

1. Используйте 1000 нг экстрагированной РНК для обратной транскрипции, выполненной с помощью набора для количественной ПЦР в соответствии с инструкциями производителя. Как неполисомальные, так и полисомальные РНК должны быть обратно транскрибированы в кДНК.
2. Смешайте 1 мкл кДНК с праймерами гена DAP и используйте буфер SYBR для измерения уровня экспрессии целевого гена в соответствии с инструкцией производителя. Затем используйте ПЦР в реальном времени для определения экспрессии гена DAP .
   ПРИМЕЧАНИЕ: Последовательности праймеров гена DAP следующие:
   Прямой праймер = 5'-ATA AAA GAA TTC AGC TAA CGC TTC C-3'
   Обратный капсюль = 5'-TTG TTT CTT TGC CTC TAT TGT ATC C-3'
3. Сравнить уровни экспрессии генов DAP в измеряемых группах неполисомальных и полисомальных РНК и оценить содержание РНК в условиях пропорциональной потери. Используя нормализованное содержание РНК, рассчитать соотношение РНК в полисомах.

Результаты

Дикий вид Arabidopsis, Col-0, выращивали на среде MS при световом фотопериоде 16 ч:8 ч. Для контроля использовали 5-дневную рассаду без обработки термическим стрессом. Группу теплового стресса подвергали тепловой обработке в течение 1 ч при 40 °С на предварительно нагретой водяной бане, в то время как группу восстановления помещали при температуре 22 °С в течение 2 ч сразу после термической обработки. Используя различные условия термообработки и восстановления, мы можем использовать последующие шаги для измерения их поступательной эффективности.

Перед экстракцией РНК необходимо сначала подготовить градиент сахарозы. Для разделения неполисомальной и полисомальной РНК на основе разницы их плотности мы приготовили градиентный раствор с концентрациями сахарозы 12,5%, 24,4%, 36,3%, 48,1% и 60%. Затем мы загружали градиентные растворы от высокой концентрации к низкой, начиная со дна (рис. 1A). Впоследствии мы можем использовать этот градиент для разделения неполисомальной РНК более низкой плотности в верхнем слое, в то время как полисомальная РНК более высокой плотности будет распределена в нижнем слое с более высокими концентрациями сахарозы. Неполисомальную и полисомальную РНК выделяли из обработанного или необработанного Col-0. Чтобы частицы в растворе не влияли на результаты анализа полисомного профилирования, РНК-содержащий раствор следует фильтровать через сетчатое фильтр для получения экстракционного раствора, не содержащего частиц. Отфильтрованную надосадочную жидкость загружали на заранее подготовленный градиент сахарозы и уравновешивали. После ультрацентрифугирования образцов, загруженных сахарозным градиентом, неполисомальные и полисомальные РНК были распределены по плотности в пределах градиента сахарозы. В дальнейшем профилирование полисом проводили с помощью фракционатора градиента плотности (рис. 1В). Управление фракционатором с градиентом плотности осуществляется с помощью программного обеспечения, первоначально откалиброванного с помощью деионизированной воды. После калибровки образцы загружаются в ректификационный агрегат после ультрацентрифугирования. Работая в режиме программного управления, микрообъемный шприцевой насос впрыскивает в градиент раствор сахарозы с концентрациями выше градиента сахарозы, проталкивая образец. Это позволяет начать измерение с вершины градиента сахарозы, где плотность ниже, и двигаться к низу, где плотность выше. Затем активируются настройки программного обеспечения, чтобы начать сбор данных, генерируя граф профиля полисом с помощью измерения OD₂₅₄ (рисунок 1B). Когда мы наблюдаем более высокую интенсивность сигнала в полисомальной фракции, это указывает на то, что образец демонстрирует более высокую эффективность трансляции.

Графики профилирования полисом для 5-дневных сеянцев Col-0 при различных обработках представлены на рисунке 2. Результаты контрольной группы демонстрируют четкое разделение между неполисомальной фракцией и полисомальной фракцией (рис. 2А). Однако после 1 ч теплового стресса при 40 °C интенсивность сигнала полисомальной фракции значительно снижалась (рис. 2В). Когда термически обработанной рассаде дали восстановиться при температуре 22 °С в течение 2 ч, интенсивность сигнала полисомальной фракции восстановилась до уровня, аналогичного контрольной группе (рис. 2В). Наши результаты показали, что обработка тепловым стрессом через 1 ч значительно снижает эффективность трансляции рассады арабидопсиса. Тем не менее, растениям потребовалось 2 часа восстановления, чтобы восстановить эффективность трансляции до уровней, сравнимых с теми, которые были у рассады, не страдающей от теплового стресса.

Чтобы собрать дополнительные данные, сравнивающие эффективность трансляции сеянцев Col-0 в различных условиях обработки, мы выделили и экстрагировали фракции неполисомальной и полисомальной РНК. При сборе неполисомальных и полисомальных фракций РНК руководствовались результатами измерений профиля полисом. Для экстракции неполисомальных и полисомальных РНК мы используем реагент фенол/тиоцианат гуанидиния для экстракции выделенных образцов неполисомальной и полисомальной РНК. С помощью использованного нами метода экстракции РНК мы можем получить стабильную и высококачественную РНК для нашего последующего анализа (табл. 1). Затем нормализуйте извлеченную РНК с помощью набора GeneChip Eukaryotic Poly-A RNA Control Kit для смягчения ошибок, вызванных различными потерями экстракции. Затем с помощью ПЦР в реальном времени была проведена количественная оценка экспрессии генов DAP , которые входят в состав набора генов B. subtilis . Для оценки содержания РНК в условиях пропорциональной потери был проведен сравнительный анализ уровней экспрессии гена DAP между группами неполисомальных и полисомальных РНК (рис. 3А). Мы рассчитали отношение нормализованной полисомальной РНК к общей РНК для уточнения эффективности трансляции между ними (рис. 3B). Наконец, соотношение РНК в полисомах рассчитывали с использованием нормализованного содержания РНК (рис. 3C). Результаты соотношения РНК в полисомах при различных обработках Col-0 показали закономерность, согласующуюся с результатами профиля полисом, показанными на рисунке 2А. Оба результата указывают на то, что тепловой стресс значительно снижает соотношение РНК в полисомальной фракции, и этот эффект может быть обращен вспять после 2-часового восстановления при 22 °C (Таблица 1).

С помощью этого метода мы можем получить целую неполисомальную или полисомальную фракцию РНК с высоким качеством, а не разделять РНК на дополнительные фракции²³. Наши результаты также показывают, что как профили полисом, так и процентное содержание РНК в полисомах могут эффективно отражать эффективность трансляции у Arabidopsis с различными условиями лечения.

Рисунок 1: Схема рабочего процесса профилирования полисом. (A) Схематическая иллюстрация приготовления градиента сахарозы в центрифужной пробирке объемом 13 мл. (B) Блок-схема иллюстрирует экспериментальный процесс профилирования полисом. Сначала извлекается транслатом. В дальнейшем неполисомальные и полисомальные РНК разделяют на основе их разницы в плотности с помощью ультрацентрифугирования в градиентах сахарозы различной плотности. Наружный диаметр₂₅₄ измеряют с помощью фракционатора градиента плотности для получения приведенного ниже графика результатов профилирования полисом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Полисомное профилирование Col-0 в различных условиях. (А, В, В) Получены результаты профилирования полисом Col-0 в условиях (А) без термической обработки (контроль), (В) термической обработки при 40 °С в течение 1 ч и (В) восстановления при 22 °С в течение 1 ч после термической обработки. Неполисомальные и полисомальные РНК фракционировали с использованием градиента сахарозы 12,5%-60%. На профилях указаны положения неполисомальной (NP) и полисомальной (PL) РНК. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3: Диаграмма рабочего процесса экстракции неполисомальных и полисомальных РНК. (A) Иллюстрация нормализации РНК по спайку. (B) Иллюстрация разделения неполисомальных и полисомальных РНК и расчета процентного соотношения полисомальных РНК. (C) Процентное содержание полисомальной РНК в Col-0, обработанном различными состояниями. Полосы погрешностей указывают среднее значение ± SD (n=3 биологических повторов). *p-значение < 0,01, t-критерий Стьюдента. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

		Содержание (нг)	260/280	260/230
Контроль	РНК NP	758.3	2.19	2.16
	РНКPL	302.3	2.21	2.13
Тепловой стресс	РНК NP	821.5	2.2	2.15
	РНКPL	174.3	2.19	2.21
Выздоровление	РНК NP	797.2	2.17	2.16
	РНКPL	300.9	2.19	2.18

Таблица 1: Содержание и свойства неполисомальных и полисомальных РНК. В этой таблице были проанализированы содержание и свойства РНК. Содержание РНК нормализовали после экстракции модифицированными методами.

Обсуждение

В этом протоколе изложен простой и стандартизированный метод измерения эффективности трансляции сеянцев арабидопсиса. Важнейшими этапами этого протокола являются обеспечение стабильности РНК с помощью вторичного центрифугирования и экстракции РНК реагентом, а также тщательная подготовка градиента сахарозы. Кроме того, мы предлагаем критические шаги для нормализации и количественного определения неполисомальной и полисомальной РНК с помощью метода нормализации спайков. Очень важно, что все процедуры должны проводиться на льду с использованием буферов и инструментов, не содержащих РНКазы. Кроме того, обеспечьте точное приготовление концентрации сахарозы и сведите к минимуму встряхивание, чтобы уменьшить ее влияние на градиент. В предыдущих исследованиях 24,25,26 исследования реакций на стресс в основном были сосредоточены на транскрипционном и фенотипическом анализе. С помощью анализа полисомного профиля мы можем дополнительно исследовать регуляцию трансляционных процессов в растениях в условиях стресса или других раздражителей окружающей среды.

Понимание трансляционных процессов включает в себя не только проведение экспериментов по профилированию полисом, но и дополнение их экспериментами по мечению азидогомоаланином (AHA). Мечение AHA-кислотами используется для исследования синтеза белка и трансляционной активности²⁷. Метод заменяет остатки метионина во вновь синтезированных белках на AHA, аналог метионина, содержащий азидную группу. Клетки интегрируют AHA-кислоту во вновь синтезированные белки во время трансляции. Впоследствии, используя методы, основанные на химии азидов, такие как клик-химия, белки, содержащие AHA, могут быть селективно помечены и обнаружены, что позволяет проводить количественный анализ и визуализацию активно транслирующихся белков²⁸. Комбинируя мечение AHA-кислот с профилированием полисом, исследователи могут получить более глубокое представление о динамике синтеза белка в^{растительных} клетках.

С помощью этого метода выделения полисомальных РНК и нормализации спайков мы также можем использовать выделенную РНК для анализа секвенирования РНК. Анализируя полисомно-связанную мРНК, мы можем определить, какие мРНК активно претерпевают трансляцию. Кроме того, сравнение стационарной мРНК с мРНК, связанной с полисомами, позволяет нам идентифицировать гены, которые сверхэкспрессируются на уровне трансляции или транскрипции. Уровень экспрессии стационарной мРНК отражает транскрипционную активность, в то время как связанная с полисомами мРНК указывает на гены, активно претерпевающие трансляцию. На эффективность перевода влияют раздражители окружающей среды и посттрансляционные модификации 7,8,9,16. Таким образом, данный метод обеспечивает всестороннее понимание того, является ли целевой белок, представляющий интерес, эффективной трансляцией. Однако предел этого метода заключается в том, что во время процедуры экстракции все равно произойдет потеря РНК. Относительная экспрессия РНК с шипами, полученная с помощью qRT-PCR, также может привести к небольшим ошибкам измерения. Необходимы дальнейшие исследования и валидация с использованием протеомики или вестерн-блоттинга для изучения функциональных аспектов целевого белка.

Подводя итог, можно сказать, что этот протокол представляет собой простой метод, который обеспечивает простой подход с четкими результатами для оценки эффективности перевода. Важно отметить, что его применимость выходит за рамки рассады, подвергшейся термическому стрессу, и распространяется на рассаду, подвергшуюся воздействию различных других раздражителей окружающей среды.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
1,5 мл пробирка eppendorf	Labcon	3012-870-000-9	Экстракция РНК
13,2 мл центрифужная пробирка	Beckman Coulter	331372	ультрацентрифугированием
Бромфенол синий	Honeywell	32712	Полисомный профиль
Хлороформ	Honeywell	32211	Экстракция РНК
Циклогексимид (CHX)	Sigma-Aldrich	SI-C7698	Полисомный профиль
Диэтилпирокарбонат (DEPC)	Sigma-Aldrich	D5758	Экстракция РНК
Этанол	Sigma-Aldrich	32221	Экстракция РНК
GeneChip Эукариотический поли-А Набор для контроля РНК	Инвитроген	900433
нормализация Глицерин	Honeywell	15523
Нормализация гепарина	Сигма-Олдрич	SI-H3149	Полисомный профиль
HiScript III RT SuperMix для набора для количественной ПЦР	Vazyme	R323-01
Нормализация KCl	J.T.Baker	3040-01	Профиль полисом
MgCl2	Sigma-Aldrich	SI-M8266	Профиль полисом
MS базальная среда	Phyto	M524	Пиковая таблица культуры растений
Шприцевой насос	Brandel	SYN4007LS	профиль полисомы
(PTE)	Sigma-Aldrich	P2393	Профиль
полисомРНКазин	Promega	N251B
Дезоксихолат натрия (DOC)	Sigma-Aldrich	SI-D6750	Полисомный профиль
Сахароза	Sigma-Aldrich	S5391	Полисомный профиль
SYBR Green Supermix	Bio-Rad	BP170-8882	Нормализация
TRI реактив	MRC	TR118	РНК экстракция
Tris-HCl	J.T.Baker	4109-06	Полисомный профиль
, ультрацентрифуга	Beckman Coulter	Optima L-100K	, ультрацентрифуга
UV/VISDETECTOR	Brandel	UA-6	полисомный профиль