Методическая статья

Нокаут генов CRISPR-Cas9 на основе электропорации в клетках THP-1 и выделение клонов одиночных клеток

4.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/67469

⸱

28 февраля 2025 г.

 , 
1INSERM, CEA, Center for Immunology of Viral, Auto-immune, Hematological and Bacterial diseases (IMVA-HB/IDMIT), Université Paris-Saclay

В этой статье

Краткое содержание

Клеточная линия THP-1 широко используется в качестве модели для исследования функций моноцитов/макрофагов человека в различных областях исследований, связанных с биологией. В этой статье описывается протокол для эффективной инженерии на основе CRISPR-Cas9 и выделения клонов отдельных клеток, что позволяет получать надежные и воспроизводимые фенотипические данные.

Аннотация

Клеточная линия THP-1 при остром моноцитарном лейкозе человека (ОМЛ) широко используется в качестве модели для изучения функций макрофагов, полученных из моноцитов человека, включая их взаимодействие со значительными патогенами человека, такими как вирус иммунодефицита человека (ВИЧ). По сравнению с другими иммортализированными клеточными линиями миелоидного происхождения, клетки THP-1 сохраняют многие неповрежденные воспалительные сигнальные пути и демонстрируют фенотипические характеристики, которые больше напоминают характеристики первичных моноцитов, включая способность дифференцироваться в макрофаги при обработке форбол-12-миристат13-ацетатом (ФМА). Использование технологии CRISPR-Cas9 для конструирования клеток THP-1 с помощью таргетного нокаута гена (KO) обеспечивает эффективный подход к лучшей характеристике механизмов, связанных с иммунитетом, включая взаимодействия вируса и хозяина. В этой статье описывается протокол эффективной инженерии на основе CRISPR-Cas9 с использованием электропорации для доставки предварительно собранных рибонуклеопротеинов Cas9:sgRNA в ядро клетки. Использование нескольких sgРНК, нацеленных на один и тот же локус в немного разных позициях, приводит к делеции больших фрагментов ДНК, тем самым повышая эффективность редактирования, что оценивается с помощью анализа эндонуклеазы T7 I. Редактирование, опосредованное CRISPR-Cas9 на генетическом уровне, было валидировано секвенированием по Сэнгеру с последующим анализом выводов CRISPR Editits (ICE). Истощение белка было подтверждено иммуноблоттингом в сочетании с функциональным анализом. С помощью этого протокола было достигнуто до 100% инделов в целевом локусе и снижение экспрессии белка более чем на 95%. Высокая эффективность редактирования позволяет удобно выделять одноклеточные клоны путем ограничения разведения.

Введение

THP-1 представляет собой линию клеток, полученных из моноцитов человека, выделенную у пациента с острым лейкозом (ОМЛ), которые проявляют фенотипические особенности, очень похожие на особенности первичных моноцитов1. По сравнению с первичными моноцитарными макрофагами, которые не делятся и демонстрируют как ограниченную продолжительность жизни, так и меж- и внутридонорскую вариабельность фенотипа, клетки THP-1 могут культивироваться практически вечно и имеют более однородное поведение, что способствует воспроизводимости результатов 2,3,4,5,6 . Примечательно, что клетки THP-1 могут быть дифференцированы в макрофагоподобный фенотип с форбол-12-миристат 13-ацетатом (PMA), что делает их широко используемой моделью in vitro для исследования реакции моноцитов/макрофагов на воспалительные сигналы 7,8,9,10,11,12,13 или инфекцию клинически значимыми патогенами человека, включая ВИЧ-14,15,16. Возможность генной инженерии клеток THP-1 представляет интерес во многих областях, связанных с биологией.

Кластеризованный регулярно чередующиеся короткие палиндромные повторы — ассоциированный белок 9 (CRISPR-Cas9) — это прокариотическая адаптивная иммунная система, использующая РНК-управляемую нуклеазу для разрушения вторгшихся вирусных геномов, которая была перепрограммирована в инструмент генной инженерии17. Процесс редактирования генома протекает в три этапа: распознавание, расщепление и восстановление. Однонаправляющая РНК (sgRNA) рекрутирует нуклеазу Cas9 в определенный геномный локус путем спаривания оснований с ее направляющей последовательностью 20.о. Наличие последовательности Protospacer Neighbor Motif (PAM) непосредственно на 3' от 20-.о. геномной последовательности-мишени запускает Cas9-опосредованное раскручивание и расщепление на обеих цепях ДНК между позициями 17 и 18 (3-.о. 5' PAM). Полученный двухцепочечный разрыв (DSB) обрабатывается двумя основными путями ремонта. В отсутствие матрицы репарации, имеющей гомологию с поврежденным локусом, подверженный ошибкам путь негомологичного соединения концов (NHEJ) приведет к случайным вставкам нуклеотидов и/или делециям (инделам), что потенциально может привести к мутациям сдвига рамки считывания и/или введению преждевременных терминирующих кодонов (PTC). В свою очередь, ПТС-содержащие мРНК подвергаются деградации по нонсенс-опосредованному пути распада мРНК (NMD), что в конечном итоге нарушает экспрессию/функцию белка 18,19,20. В качестве альтернативы, зависимый от шаблона путь Homology-Directed Repair (HDR) может работать и верно восстанавливать DSB. Этот механизм был использован для достижения точного редактирования генов, включая подстановку и замену оснований. Стоит отметить, что статус клеточного цикла является важным фактором, влияющим на выбор пути репарации DSB. Действительно, NHEJ активен на всех стадиях клеточного цикла, в то время как HDR в основном ограничен фазами S/G221.

Клетки THP-1 растут в суспензии и, как известно, их трудно трансфицировать плазмидной ДНК, что также может изменить их жизнеспособность и/или способность к дифференцировке. Трансдукция лентивирусными векторами на основе ВИЧ-1, кодирующими как Cas9, так и sgРНК, часто используется для нокаутирования (KO) гена, представляющего интерес24. Интеграция кассеты Cas9/sgRNA в клеточный геном обеспечивает пролонгированную экспрессию и эффективный KO, но также является постоянным источником побочных эффектов25. В качестве альтернативы, предварительно собранные рибонуклеопротеины Cas9:sgRNA (RNP) доставляются с помощью электропорации — метода, предполагающего временное образование пор как в плазматических, так и в ядерных мембранах после применения электрических импульсов. Сохранение жизнеспособности клеток является важной задачей при реализации этого подхода.

Здесь была создана клеточная линия THP-1, стабильно экспрессирующая GFP (THP-1_GFP), которая послужила инструментом для создания протокола для достижения эффективного редактирования на основе CRISPR-Cas9. После разработки стратегии инактивации гена EGFP с использованием трех sgРНК одновременно (многонаправленный подход) эффективность KO в нескольких условиях электропорации была определена с использованием экспрессии GFP в качестве считывания. Параллельно осуществлялся мониторинг пролиферации клеток. Редактирование генов было подтверждено анализом на эндонуклеазу T7 I (T7EI) и секвенированием по Сэнгеру с последующим анализом с помощью алгоритма Inference of CRISPR Edits (ICE)26. Параметры, которые приводили к снижению экспрессии GFP до 95%, при этом клетки THP-1 восстанавливали нормальные темпы роста после электропорации, были успешно использованы для инактивации эндогенного гена (SAMHD1) и получения клонов THP-1 в одной клетке.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Подробная информация о реагентах и оборудовании, использованных в этом исследовании, приведена в Таблице материалов.

1. Проектирование направляющих с помощью CRISPOR (Рисунок 1.1)

ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение SnapGene Viewer может быть использовано на этапах 4, 7 и 10 для аннотирования целевого сайта редактирования и местоположения гибридизации ПЦР-праймера в интересующем гене.

  1. Зайдите на сайт Ensembl (www.ensembl.org). В поле Поиск выберите вид и введите название интересующего гена. Нажмите « Перейти». Выберите результат, который соответствует гену (а не транскрипту).
  2. Нажмите « Показать таблицу транскриптов », а затем выберите идентификатор транскрипта , соответствующий золотой маркировке «Кодирующий белок» в столбце «Биотип ». Оказавшись на странице расшифровки, нажмите на Exons в левом меню.
  3. Прокрутите вниз и нажмите « Последовательность загрузки». Убедитесь, что в поле Формат файла выбран FASTA. В разделе Настройки - Включенные последовательности снимите флажки со всех параметров, кроме параметра Геномная последовательность.
    Введите число "500" в последовательности флангов на любом конце поля расшифровки . Нажмите на кнопку «Предварительный просмотр», выберите всю последовательность (только нуклеотиды без заголовка) и скопируйте ее (Ctrl+C).
  4. Откройте SnapGene Viewer и нажмите « Новый файл > ДНК». Вставьте последовательность (Ctrl+V) в поле Создать последовательность . Снимите отметку с опции Обнаруживать общие объекты и выберите Линейный в топологии.
    Переименуйте файл и нажмите « Создать». В левом меню снимите флажок Показывать ферменты (первый значок). В нижней части окна выберите вкладку Последовательность .
    Примечание: Этот шаг позволяет получить полную последовательность генов, включая экзоны, интроны и фланкирующие последовательности 500.о. (опционально). Эта последняя информация полезна для разработки ПЦР-праймеров для амплификации целевого сайта, расположенного внутри первого экзона.
  5. Вернитесь на веб-сайт Ensembl, прокрутите вверх по предварительному просмотру файла и нажмите «Назад». Теперь измените Формат файла на RTF. В разделе Настройки - Включенные последовательности снимите все флажки, кроме экзонов. В поле Показать варианты выберите Нет. Нажмите « Скачать » в верхней части страницы.
  6. Откройте скачанный файл (с помощью Word), который содержит последовательность экзонов и показывает кодирующую последовательность синим цветом, начиная с начальной ATG. Выберите экзон, на который будет направлено редактирование с помощью CRISPR-Cas9 (рекомендации см. ниже), выберите его и скопируйте (Ctrl+C).
    1. Целевой экзон является либо ранним экзоном, либо экзоном, кодирующим функционально важный домен белка. Стоит отметить, что установление PTC в позднем экзоне, близком к 3'-UTR, скорее всего, не приведет к выявлению NMD, что приведет к экспрессии С-терминально усеченного белка. И наоборот, введение ПТК в ранний экзон, проксимальнее нативного сайта инициации, связано с риском незаконной трансляции (ITL, также известной как альтернативная инициация трансляции (ATI)), что приводит к неожиданной экспрессии N-терминально усеченного белка, который начинается на сайтах инициации трансляции (TIS) в кадре после первого кодона ATG. Чтобы снизить этот последний риск, рекомендуется оценить возникновение альтернативной ТИС с использованием ATGpr27 (atgpr.dbcls.jp) и/или NetStart 1.028 (services.healthtech.dtu.dk/services/NetStart-1.0/).
    2. Убедитесь, что целевой экзон содержит кодирующую последовательность. Тем не менее, может оказаться полезным выбрать отжиг sgRNA с областью 5'UTR выше исходного ATG для включения ее в удаленный фрагмент.
    3. В идеале целевой экзон должен быть общим для всех белок-кодирующих вариантов транскрипта гена. Проверьте, так ли это, с помощью программы просмотра данных генома (www.ncbi.nlm.nih.gov/gdv/) NCBI, выполнив поиск по интересующему вас гену.
      При нажатии на название гена (зеленого цвета) в окне отображения будут показаны варианты транскриптов (фиолетовым цветом). Экзоны представлены в виде прямоугольника.
  7. В SnapGene Viewer нажмите Ctrl+F, Ctrl+V, а затем Enter для поиска последовательности экзона. Нажмите Ctrl+T, чтобы добавить новую функцию, назовите ее, измените тип на "exon" и нажмите OK.
  8. Перейдите на веб-сайт CRISPOR (http://crispor.gi.ucsc.edu/) и вставьте последовательность экзонов в Шаге 1. Сначала выберите референсный геном на шаге 2, а затем тип PAM для мишени на шаге 3, обычно 20.н. для SpCas9. Нажмите «ОТПРАВИТЬ».
  9. Выберите две гРНК так, чтобы они были разделены на расстояние до 150.н., затем выберите третью гРНК между ними. Вот несколько рекомендаций по выбору sgRNA:
    1. Показатель специфичности MIT связан с побочными эффектами. Более высокий балл указывает на меньшее количество потенциальных нецелей. В правом столбце отображаются три прогнозируемых нецелевых сайта, ранжированных от наиболее до наименее вероятных, а также их местоположение (в экзоне, интроне или межгенной области). Полный список прогнозируемых нецелевых сайтов можно получить, нажав кнопку «Показать все». Если возможно, выбирайте sgРНК с оценкой MIT >80, отдавая приоритет тем, у которых нет нецелевых показателей, по 0, 1 или 2 несоответствиям. Кроме того, следует избегать sgРНК с немишенями в экзоне, которые имеют наибольший потенциал влияния на фенотип.
    2. Для получения прогнозируемой эффективности обратитесь к шкале Doench '16. Обратите внимание, что высокий балл по шкале Доенча '16 просто указывает на то, что sgRNA с большей вероятностью будет эффективна. Фактическая эффективность должна быть определена экспериментально. По этой причине всегда полезно выбрать несколько sgRNA, даже если они не предназначены для совместного использования.
    3. Слишком высокое или слишком низкое содержание GC, а также определенные мотивы могут нанести ущерб эффективности sgРНК, и их следует избегать. Эти параметры выделяются CRISPOR.
  10. Повторите шаг 1.7, чтобы добавить последовательность sgRNA и связанную с ней последовательность PAM к последовательности гена в SnapGene Viewer. В то же время вставьте последовательность sgRNA (без PAM) в текстовый файл или файл Excel, чтобы сохранить ориентацию 5'-3', необходимую при заказе олигонуклеотида.
  11. Для амплификации целевого участка с помощью ПЦР разработайте вокруг него пару праймеров. Размер ампликона должен составлять от 800 до 1000.о. Для разработки праймеров для этого протокола (https://eu.idtdna.com/pages/tools/primerquest) использовался PrimerQuest. В качестве альтернативы CRISPOR предоставляет список праймеров для амплификации целевой области генома, а также нецелевых участков. После отображения полного списка потенциальных нецелевых площадок (шаг 1.9.1) нажмите на «Нецелевые грунтовки » в правом нижнем углу.

2. Подготовка реагентов и клеток к электропорации (рис. 1.2)

  1. Подготовьте 24-луночный культуральный планшет для восстановления клеток после электропорации, заполнив лунки 500 мкл среды RPMI 1640 с добавлением 20% термоинактивированной (56 °C, 30 мин), отфильтрованной (0,20 мкм) фетальной бычьей сыворотки (FBS). Не стоит добавлять антибиотики. Держите планшет во влажном инкубаторе при температуре 37 °C и 5%CO2 в течение 24 часов до электропорации.
  2. Если гРНК поставляются сухими, регидратируйте их с помощью TE-буфера (10 мМ Трис, 1 мМ ЭДТА, pH 8,0) до конечной концентрации 100 мкМ (т.е. 10 мкл TE-буфера на 1 нмоль сгРНК). Вихрь в течение 30 с, инкубировать при 4 °C в течение ночи для полной регидратации и, после короткой гомогенизации пипеткой, хранить стоковый раствор sgRNA при -20 °C. В зависимости от конечного объема вносите аликвоты, чтобы избежать многократных циклов заморозки-оттаивания.
  3. Готовьте рабочий раствор sgRNA в конечной концентрации 30 мкМ путем разбавления 100 мкМ стокового раствора в воде, не содержащей нуклеаз. Вихрь в течение 30 с и инкубировать 5 мин при комнатной температуре.
  4. Соберите РНК Cas9:sgRNA в молярном соотношении 1:9 путем одновременного разведения 1 мкл каждой из трех 30 мкМ сгРНК и 0,5 мкл 20 мкМ растворов Cas9 в 3,5 мкл ресуспензионного буфера R, входящего в комплект для электропорации (конечный объем 7 мкл для одного экспериментального условия; масштаб соответственно). Вортексируйте на короткое время и выдержите 5 минут при комнатной температуре.
  5. Тем временем готовят неотредактированный контроль, добавляя 0,5 мкл 20 мкМ Cas9 к 6,5 мкл ресуспензионного буфера R. Vortex кратковременно инкубируют и инкубируют в течение 5 мин при комнатной температуре.
  6. Добавьте 5 мкл ресуспендирующего буфера R во все образцы для получения конечного объема 12 мкл на каждое условие электропорации.
  7. Подготовьте ячейки THP-1 к электропорации.
    1. Для оценки концентрации и жизнеспособности с помощью теста исключения трипанового синего цвета. Разведите клетки 1:2 в 0,4% растворе для окрашивания трипановым синим. После 30 с инкубации хорошо гомогенизировать и добавить 10 μL в стенку счетной камеры с улучшенной сеткой Neubauer. Посчитайте три больших квадрата и разделите счет на 100, чтобы получить концентрацию клеток (x106 клеток/мл).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Здоровье клеток влияет на их чувствительность к электропорации. Следует соблюдать осторожность, чтобы провести культивирование клеток в оптимальных условиях. Время вне инкубатора должно быть ограничено, а все реагенты и растворы должны быть заранее подготовлены и прогреты.
    2. Для каждого условия соберите объем, эквивалентный 0,2 x 106 ячеек, и центрифугируйте (336 x g, 5 мин, 20 °C).
    3. Отсадите надосадочную жидкость с помощью пипетки и повторно суспендируйте гранулу в 500 мкл PBS. Снова центрифуга (336 x g, 5 мин, 20 °C).
    4. Осторожно отасканируйте надосадочную жидкость с помощью пипетки и ресуспендируйте клеточную гранулу THP-1 12 мкл раствора РНП (шаг 2.6).

3. Настройка системы электропорации и нуклеофекция (рис. 1.3)

  1. Поместите пипетку под шкаф биобезопасности, вставьте в опору трубку для электропорации и добавьте 3 мл буфера E, входящего в комплект для электропорации.
  2. После включения устройства электропорации с помощью сенсорного экрана можно задать следующие параметры электропорации: Напряжение = 1 500 В, Продолжительность = 10 мс, Число = 3.
  3. Оснастите электропорационный пипетку наконечником и отаскайте 10 мкл раствора RNP/THP-1 (шаг 2.7.4). Вставьте пипетку в электропорационную трубку и нажмите кнопку «Пуск » на экране электропораторного устройства. Дождитесь появления сообщения Complete и извлеките пипетку из пробирки.
  4. Переложите ячейки в лунку предварительно нагретой 24-луночной пластины и аккуратно гомогенизируйте. Поставьте тарелку обратно во увлажненный инкубатор и дайте им спокойно отдохнуть в течение 72 часов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следите за тем, чтобы при пипетировании суспензии RNP/THP-1 не образовывались пузырьки, так как они будут мешать процедуре электропорации. Если при отсутствии видимой электрической дуги появляется сообщение об ошибке, извлеките электропорационный пипетку из трубки и снова нажмите кнопку «Пуск ». Однако, если наблюдается электрическая дуга в виде короткой яркой искры, это может указывать на наличие пузырьков. Процедура электропорации, скорее всего, не удастся, даже при отсутствии сообщения об ошибке.

4. Восстановление THP-1 через 72 ч после электропорации (Рисунок 1.4)

  1. Подсчитайте количество клеток для оценки концентрации (шаг 2.7.1) через 72 ч после электропорации.
  2. Если клеток достаточно (т.е. ≥0,6 х 106 клеток/мл), разбавьте их по меньшей мере в 2 фактора с помощью RPMI с добавлением 20% FBS и 1% пенициллин-стрептомицина и доведите концентрацию в пределах 0,3-0,5 x 106 клеток на мл. В противном случае дайте клетке восстановиться еще 72 ч.
  3. Пропускайте и усиливайте ячейки до тех пор, пока их не будет достаточно для валидации KO. В то же время можно начинать выделение клонов одиночных клеток (шаг 7).

5. Валидация редактирования генов с помощью анализа на несоответствие T7EI (Рисунок 1.5)

ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ может недооценивать эффективность редактирования, учитывая, что T7EI распознает несоответствия размером более 1.о. Таким образом, анализ T7EI не является полезным для скрининга гомозиготных клеточных популяций (т.е. клонов одиночных клеток), если он не модифицирован соответствующим образом (шаг 5.7).

  1. Оцените концентрацию клеток (шаг 2.7.1) и извлеките объем, эквивалентный 0,1 x 106 клеток в пробирке объемом 1,5 мл. Центрифуга (336 x g, 5 мин, 20 °C), отсадить надосадочную жидкость и повторно суспендировать гранулу в 500 мкл PBS. Снова центрифугируйте и с помощью пипетки аспирируйте как можно больше надосадочной жидкости, не нарушая гранулу. Заморозьте образец и храните при температуре -20 °C.
  2. Извлеките геномную ДНК, которая будет служить матриксом для амплификации ПЦР.
    1. Повторно суспендируйте гранулу 50 мкл раствора для экстракции ДНК, гомогенизируйте и перенесите весь объем в ПЦР-пробирку объемом 0,2 мл. Вортекс и центрифуга кратковременно (импульс в течение 3 с).
    2. Поместите трубку в термоамплификатор и нагрейте ее до 65 °C в течение 15 минут, а затем до 98 °C в течение 10 минут.
    3. Разбавьте извлеченную ДНК 90 μл сверхчистой воды. Кратковременное проведение вихревой и центрифуги (5 000 x g, 3 с).
  3. Разведите праймер для ПЦР (см. Таблицу материалов) в ультрачистой воде до конечной концентрации 10 мкМ (т.е. 10 пмоль/мкл).
  4. Приготовьте смесь для ПЦР (в соответствии с ПРИМЕЧАНИЕМ ниже) в ПЦР-пробирке объемом 0,2 мл (конечный объем = 50 мкл для одного условия). Как правило, будет как минимум два условия: нокаут и неотредактированный контроль только с Cas9.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Очищенная геномная ДНК: 10 μл; Прямой и обратный праймер (10 мкМ): по 2,5 мкл каждый, конечная концентрация 500 нМ; Реакционный буфер (5x): 10 μл. Вортекс хорошо перед добавлением. Смешайте dNTP (по 25 мМ каждого): 0,6 μл, конечная концентрация 0,3 мМ для каждого dNTP. ДНК-полимераза: 0,5 μл; Сверхчистая вода: 23,9 μл. Вортекс и центрифуга кратковременно (импульс в течение 3 с).
  5. Поместите пробирки в термоамплификатор и запустите программу ПЦР со следующими настройками:
    ПРИМЕЧАНИЕ: Один цикл при 95°С в течение 5 мин, затем 30 циклов [98°С в течение 20 с (стадия денатурации), X °С в течение 15 с (стадия отжига), 72°С в течение 45 с (стадия удлинения)], затем один заключительный цикл при 72°С в течение 2 мин. По окончании амплификации удалите пробирки, заворот и кратковременно центрифугируйте (импульс в течение 3 с). Температура отжига (X) — это температура плавления (Tm) грунтовок при температуре минус 5 °C.
  6. Для поликлональной отредактированной популяции: в новую пробирку объемом 0,2 мл добавьте 17,5 мкл ампликона ПЦР и 2 мкл NEBuffer 2 (10x) для получения конечного объема 19,5 мкл. Вортекс и кратковременно центрифугируйте (импульс в течение 3 с). В качестве альтернативы, чтобы провести скрининг клонов одиночных клеток, смешайте 1:1 продукты ПЦР как из отредактированных, так и из неотредактированных контрольных клеток (шаг 5.6) (дополнительный рисунок 1).
  7. Для формирования гетеродуплекса поместите трубки в термоамплификатор и выполните следующую программу: один цикл при 95 °C в течение 10 минут, один с нарастанием -2 °C/с от 95 до 85 °C, один с нарастанием -0,3 °C/с от 85 до 25 °C и один заключительный цикл охлаждения при 10 °C в режиме HOLD.
  8. После образования гетеродуплекса добавьте в пробирку 0,5 мкл раствора T7EI. Выдерживать при 37 °C в течение 30 минут.
  9. Приготовьте 1,2% агарозный гель:
    1. Прогрузите агарозу в стеклянной бутылке и добавьте соответствующий объем 1x TAE буфера (40 мМ трис-ацетата, 1 мМ ЭДТА, pH 8,3). Поместите его в микроволновую печь, следя за тем, чтобы не закрутить крышку плотно. Нагрейте несколько раз до полного растворения кристаллов агарозы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости смешайте раствор. Не допускайте его закипания, иначе объем уменьшится, изменив концентрацию агарозы.
    2. Добавьте разбавленное в масштабе 1/20 000 гелевое пятно DNA и хорошо перемешайте.
    3. Вылейте раствор агарозы в форму, добавьте гребень и дайте застыть при комнатной температуре.
  10. Подготовьте образцы для гель-электрофореза, смешав 5 мкл продуктов разложения T7EI (шаг 5.9) или непереваренный продукт ПЦР с 5 мкл воды и 2 мкл 6-кратного красителя, загружающего ДНК. Загрузите образцы и лестницу для определения размеров и мигрируйте при напряжении 80 В в течение 45 минут (время может быть адаптировано в зависимости от ожидаемого размера фрагментов ДНК). После завершения миграции получите изображение геля с помощью соответствующей системы визуализации.

6. Валидация редактирования генов с помощью анализа секвенирования по Сэнгеру (Рисунок 1.6)

  1. Чтобы охарактеризовать генетическую модификацию, очистите продукты ПЦР (шаг 5.4) и, после секвенирования по Сэнгеру, проанализируйте результаты с помощью инструмента ICE (https://www.synthego.com/products/bioinformatics/crispr-analysis).
  2. Контролируйте, может ли белок производиться, несмотря на модификации.
    1. Скачайте результаты ICE и откройте файл contribs.txt.
    2. Сравните отредактированные последовательности с аналогом WT. Картографируйте инделы и убедитесь, что они возникли в целевой области генома. Оцените их размер. Если длина инделя не кратна трем, произойдет сдвиг кадра, и, возможно, будет введен PTC. Ожидается, что мутировавшая мРНК подвергнется NMD-опосредованной деградации.

7. Выделение клонов одиночных клеток путем предельного разведения (рис. 1.7)

ПРИМЕЧАНИЕ: Выделение одноклеточных клонов не является обязательным. Однако, если вы решите это сделать, важно охарактеризовать несколько клонов и сравнить их фенотип с исходной поликлональной популяцией.

  1. Берут пробу клеточной суспензии, разбавляют ее на 1/2 питательной средой и оценивают концентрацию (шаг 2.7.1). Разбавление повышает точность подсчета.
  2. Выполните от 2 до 3 этапов серийного разведения для достижения концентрации 7 клеток/мл. Дозируйте 100 мкл клеточной суспензии на лунку в 96-луночный планшет с круглым дном (т.е. 0,7 клеток на лунку). Дайте ячейке декантировать в течение нескольких часов, прежде чем рассматривать пластины под микроскопом, чтобы выявить лунки, содержащие одну клетку.
  3. Регулярно контролируйте образование и рост колоний и при необходимости переносите клетки в культуральную тарелку или колбу большего размера.

8. Функциональная характеристика клеток THP-1 KO SAMHD1 методом рестрикционного анализа ВИЧ-1

  1. Затравите THP-1 в 24-луночный культуральный планшет с 0,25 x 106 клеток на лунку в 300 мкл RPMI с добавлением 10% FBS, 1% пенициллин-стрептомицина (полный RPMI) и содержащий 300 нг/мл PMA для дифференцировки. Держите планшет во влажном инкубаторе (37 °C, 5%CO2) в течение 24 часов.
  2. Замените среду на готовую среду RPMI без PMA и поместите планшет обратно в инкубатор еще на 24 часа.
  3. С помощью вакуумного насоса отсасывайте всю питательную среду. Добавьте 250 мкл VSVg-псевдотипированного вирусного стокового раствора HIV-1-GFP (MOI = 0,5 IFU/клетка). Включите неинфицированный контроль. Поместите планшет при температуре 4 °C на 2 часа, чтобы синхронизировать инфекцию.
  4. Промойте ячейки один раз с помощью RPMI. Добавьте 500 мкл полного RPMI в каждую лунку и инкубируйте в течение 48 ч в стандартных условиях (время можно регулировать).
  5. После удаления питательной среды промойте клетки один раз холодом 1x PBS. Затем добавьте 100 мкл 0,05% трипсина-ЭДТА в каждую лунку. Поместите планшет в инкубатор при температуре 37 °C до тех пор, пока клетки полностью не отделятся (достаточно 5 минут), прежде чем добавлять 200 мкл полного RPMI для инактивации фермента. Перелейте 250 мкл из каждой лунки в 96-луночный планшет с круглым дном (убедитесь, что проточный цитометр принимает культуральные планшеты).
  6. Центрифугируйте планшет (757 x g, 3 мин, замедление = 6, 20 °C) и аспирируйте надосадочную жидкость с помощью многоканальной пипетки. Повторно суспендируйте гранулу со 100 мкл 4% PFA и инкубируйте при 4 °C в течение 10 минут. Добавьте 100 мкл холодного 1X PBS.
  7. Проанализируйте частоту инфекции, представленную GFP-положительными клетками, с помощью проточной цитометрии (предлагаемую стратегию гейтирования см. на дополнительном рисунке 2 ).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Была сгенерирована клеточная линия THP-1, стабильно экспрессирующая репортерный белок GFP (THP-1_GFP) (рисунок 2A) и использована в качестве инструмента для создания протокола для эффективного CRISPR-Cas9-опосредованного издания гена. С этой целью с помощью веб-инструмента 29 CRISPOR (рис. 2B) были разработаны 3 sgРНК, нацеленные на ген EGFP (рисунок2B), которые одновременно комплексировались с Cas9 в молярном соотношении 9:1 для...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Здесь описан протокол для получения успешного CRISPR-опосредованного редактирования клеточной линии THP-1. Этот подход основан на переносе предварительно собранных sgRNA/Cas9 RNP путем электропорации/нуклеофекции. Эта стратегия была выбрана для ограничения побочных эффектов, которые потенциально возникают при лентивирально-опосредованной интеграции кассеты sgRNA/Cas9, что приводит к стойкой экспрессии нуклеазы. Множественные sgРНК, нацеленные на интересующий ген, были выбраны для достиже...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У всех авторов нет конфликта интересов.

Благодарности

Мы благодарны JP Concordet (MNHN, U1154/UMR7196, Париж), Г. Боссису (IGMM, Монпелье) и Д. Шлютеру (Ганноверская медицинская школа, Германия) за обмен протоколами и обсуждение. Этот проект получил финансирование в рамках программы исследований и инноваций Европейского Союза «Горизонт 2020» (грантовое соглашение No 101017572 для AZ) и ANRS (грант ECTZ162721 для AZ). Исследовательская инфраструктура модели инфекционных заболеваний и инновационных методов лечения (IDMIT) поддерживается «Программой инвестирования в авенир (PIA)» в соответствии с ANR_11_INSB_0008.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,2 & микро; m шприц фильтрClearLine146560_
0.4 % трипановый синийBeckman Coulter383200_
1.5 мл трубкаEppendorf3810X_
24-луночная пластинаCorning353047_
6x TriTrack DNA Loading DyeThermo scientificR1161_
75 cm² Колба для культур Вентилируемый колпачокCorning353136_
8-полосковые ПЦР-пробирки с колпачкамиТехнологии Life AM12230_
96-луночные планшеты Плоское дноCorning353072_
96-луночные планшеты Круглое дноCorning353077_
AgaroseEuromedexD5_
ATGpr__https://atgpr.dbcls.jp/
Система визуализации ChemiDocBIO-RAD12003153_
Счетное стеклоNanoEntekDHC-N04_
CRISPOR__http://crispor.gi.ucsc.edu/
DPBSGibco14190094_
EnsemblEMBL-EBI_https://www.ensembl.org/index.html
Плод крупного рогатого скота СывороткаSigma-AldrichF7524_
FlowJoBD Life Sciencesv10.10_
GeneRuler 100 bp Plus DNA LadderThermo scientificSM0323_
Genome Data ViewerNCBI_https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gdv/
GraphPad PrismDotmatics_Version 9.3.1
Herculase II Fusion DNA PolymerasesAgilent600679_
ICE CRISPR Analysis ToolSynthego_https://www.synthego.com/products/bioinformatics/crispr-analysis
Image Lab TouchBIO-RAD_Version 2.4.0.03
NEBuffer 2New England BiolabsB7002SВ комплекте с T7EI M0302S
Neon Kit, 10 & микро; LInvitrogenMPK1025KНабор для электропорации, содержащий наконечники, трубки, буфер R и E
Neon Transfection SystemInvitrogenMPK5000_
NetStart 1.0__https://services.healthtech.dtu.dk/services/NetStart-1.0/
Nuclease-free WaterSynthego__
PCR primer (EGFP)Eurofins_Fw : GGAATGCAAGGTCTGTTGAATG ; Rev : CACCTTGATGCCGTTCTTCT
ПЦР праймер (SAMHD1)Eurofins_Fw : CGGGATTGATTTGAGGACGA ; Rev : GGGTGGCAAGTTAGTGAAGA
Пенициллин-стрептомицин (10,000 Ед/мл)Gibco15140122_
PFAElectron Microscopy Sciences15714_
PMASigma-AldrichP8139_
PrimerQuestIDT_https://eu.idtdna.com/pages/tools/primerquest
QIAquick PCR Purification KitQiagen28104_
QuickExtract Решение для экстракции ДНКBiosearchTechnologies QE09050_
RPMI 1640, GlutaMAXGibco61870010_
SnapGene ViewerDotmatics_Version 7
SpCas9 2NLS НуклеазаSynthego__
SYBR Safe DNA Gel StainInvitrogenS33102_
Synthetic sgRNA (EGFP)Synthego_#1 : CGCGCCGAGGUGAAGUUCGA ; #2 : UUCAAGUCCGCCAUGCCCGA ; #3 : CAACUACAAGACCCGCGCCG
Синтетическая sgRNA (SAMHD1)Synthego_#1 : AUCGCAACGGGGACGCUUGG ; #2 : GCAGUCAAGAACCUCGGCGC ; #3 : CCAUCCCGACUACAAGACAU
Шприц Plastipak Luer LockBD301229_
T100 Термический амплификаторBIO-RAD1861096_T7
эндонуклеаза Iновая England BiolabsM0302S_
TAE буфер UltraPure, 10xInvitrogen15558026400 мМ трис-ацетат, 10 мМ ЭДТА
ТГП-1 клеткиATCCTIB-202_
Trypsin-EDTA (0,05 %)Gibco25300054_
ZE5 Анализатор клетокBIO-RAD12014135_

Ссылки

  1. Tsuchiya, S., et al. Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1). Int J Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).
  2. Danis, V. A., Millington, M., Hyland, V. J., Grennan, D. Cytokine production by normal human monocytes: inter-subject variation and relationship to an IL-1 receptor antagonist (IL-lRa) gene polymorphism. Clin Exp Immunol. 99, https://academic.oup.com/cei/article/99/2/303/6484286 (1995).
  3. Bol, S. M., et al. Donor variation in in vitro HIV-1 susceptibility of monocyte-derived macrophages. Virology. 390 (2), 205-211 (2009).
  4. Appleby, L. J., et al. Sources of heterogeneity in human monocyte subsets. Immunol Lett. 152 (1), 32-41 (2013).
  5. O'Neill, M. B., et al. Single-cell and bulk RNA-sequencing reveal differences in monocyte susceptibility to Influenza A virus infection between Africans and Europeans. Front Immunol. 12, 768189(2021).
  6. Wen, Y., et al. Comparability study of monocyte-derived dendritic cells, primary monocytes, and THP1 cells for innate immune responses. J Immunol Methods. 498, 113147(2021).
  7. Inagaki, Y., et al. Interferon-g-induced apoptosis and activation of THP-1 macrophages. Life Sci. 71 (21), 2499-2508 (2002).
  8. Boonkaewwan, C., Toskulkao, C., Vongsakul, M. Anti-inflammatory and immunomodulatory activities of stevioside and its metabolite steviol on THP-1 cells. J Agric Food Chem. 54 (3), 785-789 (2006).
  9. Chanput, W., et al. β-Glucans are involved in immune-modulation of THP-1 macrophages. Mol Nutr Food Res. 56 (5), 822-833 (2012).
  10. Cui, J., et al. USP3 inhibits type I interferon signaling by deubiquitinating RIG-I-like receptors. Cell Res. 24 (4), 400-416 (2014).
  11. Chen, S., et al. SAMHD1 suppresses innate immune responses to viral infections and inflammatory stimuli by inhibiting the NF-κB and interferon pathways. Proc Natl Acad Sci USA. 115 (16), E3798-E3807 (2018).
  12. Pradhananga, S., Spalinskas, R., Poujade, F. A., Eriksson, P., Sahlén, P. Promoter anchored interaction landscape of THP-1 macrophages captures early immune response processes. Cell Immunol. 355, 104148(2020).
  13. Mezzasoma, L., Talesa, V. N., Romani, R., Bellezza, I. Anp and BNP exert anti-inflammatory action via npr-1/cgmp axis by interfering with canonical, non-canonical, and alternative routes of inflammasome activation in human THP1 cells. Int J Mol Sci. 22 (1), 1-17 (2021).
  14. Martinat, C., et al. SUMOylation of SAMHD1 at Lysine 595 is required for HIV-1 restriction in non-cycling cells. Nat Commun. 12 (1), 4582(2021).
  15. Rensen, E., et al. Clustering and reverse transcription of HIV-1 genomes in nuclear niches of macrophages. EMBO J. 40 (1), e105247(2021).
  16. Ikeda, T., et al. APOBEC3 degradation is the primary function of HIV-1 Vif determining virion infectivity in the myeloid cell line THP-1. mBio. 14 (4), e0078223(2023).
  17. Jinek, M., et al. A programmable dual RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337, 816-821 (2012).
  18. Kurosaki, T., Maquat, L. E. Nonsense-mediated mRNA decay in humans at a glance. J Cell Sci. 129 (3), 461-467 (2016).
  19. Tuladhar, R., et al. CRISPR-Cas9-based mutagenesis frequently provokes on-target mRNA misregulation. Nat Commun. 10 (1), 4056(2019).
  20. Embree, C. M., Abu-Alhasan, R., Singh, G. Features and factors that dictate if terminating ribosomes cause or counteract nonsense-mediated mRNA decay. J Biol Chem. 298 (11), 102592(2022).
  21. Xue, C., Greene, E. C. DNA repair pathway choices in CRISPR-Cas9-mediated genome editing. Trends Genet. 37 (7), 639-656 (2021).
  22. Schnoor, M., et al. Efficient non-viral transfection of THP-1 cells. J Immunol Methods. 344 (2), 109-115 (2009).
  23. Tang, X., et al. A method for high transfection efficiency in THP-1 suspension cells without PMA treatment. Anal Biochem. 544, 93-97 (2018).
  24. Ji, W., Zhang, L., Liu, X. Protocol using lentivirus to establish THP-1 suspension cell lines for immunostaining and confocal microscopy. STAR Protoc. 4 (1), 102032(2023).
  25. Guo, C., Ma, X., Gao, F., Guo, Y. Off-target effects in CRISPR/Cas9 gene editing. Front Bioeng Biotechnol. 11, (2023).
  26. Synthego Performance Analysis, ICE Analysis. 3.0, Synthego. https://www.synthego.com/help/citing-ice (2019).
  27. Salamov, A. A., Nishikawa, T., Swindells, M. B. Assessing protein coding region integrity in cDNA sequencing projects. Bioinformatics. 14, 384-390 (1998).
  28. Pedersen, A. G., Nielsen, H. Neural network prediction of translation initiation sites in eukaryotes: Perspectives for EST and genome analysis. Proc Int Conf Intell Syst Mol Biol. 5, 226-233 (1997).
  29. Concordet, J. P., Haeussler, M. CRISPOR: Intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Res. 46 (W1), W242-W245 (2018).
  30. Laguette, N., et al. SAMHD1 is the dendritic- and myeloid-cell-specific HIV-1 restriction factor counteracted by Vpx. Nature. 474 (7353), 654-657 (2011).
  31. Hrecka, K., et al. Vpx relieves inhibition of HIV-1 infection of macrophages mediated by the SAMHD1 protein. Nature. 474 (7353), 658-661 (2011).
  32. Seki, A., Rutz, S. Optimized RNP transfection for highly efficient CRI SPR/Cas9-mediated gene knockout in primary T cells. J Exp Med. 215 (3), 985-997 (2018).
  33. Batista Napotnik, T., Polajžer, T., Miklavčič, D. Cell death due to electroporation - A review. Bioelectrochemistry. 141, 107871(2021).
  34. Perretta-Tejedor, N., Freke, G., Seda, M., Long, D. A., Jenkins, D. Generating mutant renal cell lines using CRISPR technologies. Methods Mol Biol. 2067, 323-340 (2020).
  35. Sentmanat, M. F., Peters, S. T., Florian, C. P., Connelly, J. P., Pruett-Miller, S. M. A survey of validation strategies for CRISPR-Cas9 editing. Sci Rep. 8 (1), 888(2018).
  36. Makino, S., Fukumura, R., Gondo, Y. Illegitimate translation causes unexpected gene expression from on-target out-of-frame alleles created by CRISPR-Cas9. Sci Rep. 6, 39608(2016).
  37. Bowling, A., et al. Downstream alternate start site allows N-terminal nonsense variants to escape NMD and results in functional recovery by readthrough and modulator combination. J Pers Med. 12 (9), 1448(2022).
  38. Inácios, Â, et al. Nonsense mutations in close proximity to the initiation codon fail to trigger full nonsense-mediated mRNA decay. J Biol Chem. 279 (31), 32170-32180 (2004).
  39. Li, J., et al. Efficient inversions and duplications of mammalian regulatory DNA elements and gene clusters by CRISPR/Cas9. J Mol Cell Biol. 7 (4), 284-298 (2015).
  40. Guo, Y., et al. CRISPR inversion of CTCF sites alters genome topology and enhancer/promoter function. Cell. 162 (4), 900-910 (2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

T7

Похожие статьи