Методическая статья

Модель агрегированной биопленки муковисцидоза для изучения экспрессии генов, связанных с инфекцией

1.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/67477

⸱

18 апреля 2025 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Clinical Infection, Microbiology and Immunology, University of Liverpool, 2Division of Molecular Microbiology, School of Life Sciences, University of Dundee

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

В этом исследовании описывается основа для разработки модели агрегированной полимикробной биопленки и оптимизации протокола экстракции РНК для оценки экспрессии гена Pseudomonas aeruginosa, отражающей среду легких при муковисцидозе. Приложения включают оценку антимикробных эффектов и изучение альтернатив антибиотикам при состояниях, связанных с муковисцидозом.

Аннотация

Стандартные методы доклинических испытаний новых антимикробных препаратов, используемых для лечения хронических инфекций легких у людей с муковисцидозом, не отражают условия окружающей среды враждебной легочной ниши. Современные редукционистские условия тестирования могут привести к прогрессированию соединений в доклиническом конвейере без доказательств их активности в условиях, подходящих для ниши легких при муковисцидозе. Некоторые подходы, используемые для изучения традиционных противомикробных препаратов, могут не подходить для альтернатив антибиотикам, включая антивирулентные терапевтические средства, такие как антикворумные чувствительные агенты и ингибиторы сидерофоров. В этом протоколе задокументирована агрегированная биопленочная модель Pseudomonas aeruginosa для сравнения резистентности и связанной с инфекцией экспрессии генов в одновидовых и многовидовых культурах (Staphylococcus aureus и Candida albicans), изучения снижения колониеобразующих единиц (КОЕ) и изменений в экспрессии генов с использованием algD в качестве примера. Модель была оптимизирована для небольших статических объемов бактериальных культур, чтобы позволить изучать новые соединения на этапе открытия процесса разработки лекарств, где количество соединений может быть ограничено. Одновидовые биопленки P. aeruginosa образовывали в синтетической среде для лечения муковисцидоза 2 (SCFM2) в течение 24 ч перед обработкой меропенемом в различных концентрациях (1, 16 и 256 мкг/мл) в течение последующих 24 ч. Полимикробные биопленки были получены путем совместного выращивания золотистого стафилококка и Candida albicans в SCFM2, затем инокуляции P. aeruginosa в течение дополнительных 24 ч и обработки меропенемом. Отсутствие прямой связи между показателями эффективности соединений в доклинических испытаниях и результатами клинических испытаний ставит под сомнение применимость современных инструментов лабораторного скрининга. Эта модель позволяет нам понять влияние соответствующих факторов на экспрессию генов P. aeruginosa, включая гены, способствующие резистентности и вирулентности, тем самым преодолевая этот разрыв.

Введение

Муковисцидоз (МВ) является наиболее распространенным аутосомно-рецессивным заболеванием среди европеоидных популяций1. Мутации в гене трансмембранного регулятора проводимости муковисцидоза (CFTR) приводят к целому ряду клинических симптомов, включая перепроизводство слизи в дыхательных путях. Нарушение транспорта ионов приводит к обезвоживанию этой слизи, в результате чего она не очищается должным образом мукоцилиарной системой, что повышает восприимчивость к хроническим легочным инфекциям1. Микробиология легких при муковисцидозе состоит из отдельной группы условно-патогенных микроорганизмов, среди которых Haemophilus influenzae и Staphylococcus aureus считаются первичными организмами, инфицирующими легкие младенцев и детей с муковисцидозом, с последующим снижением численности этих организмов и последующей колонизацией Burkholderia spp., или Pseudomonas aeruginosa во взрослом возрасте1,2,3,4. В дополнение к бактериальным видам, грибковые микроорганизмы также распространены в среде легких CF, при этом Candida spp и Aspergillus spp являются одними из наиболее часто выделяемых видов грибов3,4,5. Несмотря на то, что эти организмы играют важную роль в развитии легочных инфекций при муковисцидозе, достижения в технике культивирования и методах, не зависящих от культуры, показали, что инфекции легких при муковисцидозе редко ограничиваются одним видом бактерий, тем самым подчеркивая сложную, полимикробную природу класса легких муковисцидоза ="xref6.

Несмотря на эти знания, современные методы in vitro и in vivo для разработки и тестирования антибиотиков для использования при хронических легочных инфекциях не имеют полного сходства с нишей легких CF7, с акцентом на определение минимальной ингибирующей концентрации (MIC) препарата против одновидовых культур. Это позволяет в ограниченном объеме учитывать инфекционное микроокружение, которое является ключевым компонентом патологии легких при МВ 8. Таким образом, методы обычно включают рост бактерий в виде планктонных культур, состояние роста, которое, вероятно, не отражает состояние бактерий в легких при муковисцидозе. Это особенно важно для P. aeruginosa, который обычно проявляется в виде агрегатов биопленки, которые часто дополнительно содержат другие виды бактерий и грибов9. Такие факторы создают трудности при тестировании антибиотиков на хронические инфекции легких и подчеркивают несоответствие между методами тестирования чувствительности к антибиотикам и антимикробной активностью в среде легких CF9,10. Эти проблемы усугубляются при скрининге альтернатив антибиотикам, таких как антивирулентная терапия, где анализы MIC не являются индикатором активности и не дают понимания взаимодействий хозяина и патогена11.

Альгинат, внеклеточный полисахарид, является ключевым компонентом биопленок P. aeruginosa в нише легких и повышает толерантность бактерий к антибиотикам и иммунным агентам, а также улучшает поверхностную адгезию12. Альгинат является привлекательной мишенью для разработки антивирулентной терапии, и было разработано несколько терапевтических средств, нацеленных на биосинтез альгината, например, на algD, ключевой ген в биосинтезе альгината13,14. Такие терапевтические средства могут быть использованы в сочетании с антибиотикотерапией у людей с муковисцидозом для разрушения биопленок P. aeruginosa, переводя бактерии в планктонное состояние. Это повышает эффективность антибиотика, так как нарушение биопленочного внеклеточного матрикса позволяет антибиотику достигать бактериальной мишени15. Однако, несмотря на доказательства активности in vitro, действие этих терапевтических средств в нише легких при муковисцидозе остается неясным.

Представленная здесь модель агрегированной биопленки решает эти проблемы путем добавления S. aureus и C. albicans, которые являются общими коколонизаторами с P. aeruginosa в легких при муковисцидозе. Это также позволяет P. aeruginosa расти в агрегатах биопленки, как это видно в дыхательной среде. Использование среды, имитирующей мокроту Synthetic Cystic Fibrosis Media 2 (SCFM2) в качестве питательной среды для роста, позволяет добавить влияния хозяина, включая муцин, внеклеточную (e)ДНК и аминокислотный профиль, который повторяется, наблюдаемый в классе CF lung16.

Чтобы еще больше отразить состояние легких при муковисцидозе, биопленки подвергаются воздействию меропенема, антибиотика, который часто назначают людям с муковисцидозом в периоды легочного обострения. Использование антибиотика в рамках данной модели рекомендуется в качестве средства воспроизведения клинических состояний, при которых может быть назначен антивирулентный агент, например, в качестве комбинированной терапии в сочетании с лечением антибиотиками для управления респираторными симптомами во время обострения. Кроме того, включение меропенема позволяет оценить транскрипционный ответ P. aeruginosa на воздействие антибиотиков в условиях, связанных с инфекцией. Эта модель может быть использована для получения информации о том, какие факторы будут подходящими мишенями для лекарств в легких при муковисцидозе. Модель также может быть изменена для включения других соответствующих антибиотиков, таких как тобрамицин, и для оценки экспрессии других генов, представляющих интерес.

Здесь эта агрегированная полимикробная модель используется для оценки влияния присутствия Staphylococcus aureus и Candida albicans и различных концентраций меропенема (1, 16 и 256 мкг/мл) на экспрессию algD P. aeruginosa. Меропенем назначают в первую очередь для лечения инфекций легких, вызванных P. aeruginosa, и не оказывает прямого влияния на S. aureus или C. albicans, где МПК для обоих этих видов составляет >256 мкг/мл.

Эта работа улучшит понимание того, как релевантные факторы, такие как факторы хозяина в SCFM2 и коколонизирующие микроорганизмы, могут влиять на экспрессию генов, связанных с инфекцией P. aeruginosa, и обеспечит основу для разработки и тестирования антивирулентных терапевтических средств для использования при хронических респираторных инфекциях муковисцидоза.

Протокол

1. Получение одновидовых биопленок

  1. Оживите P. aeruginosa PAO1 из замороженных культур бусин путем нанесения одной бусины на агар Lysogeny Broth (LB) и инкубации в течение 24 часов при 37 °C.
  2. Приготовьте на ночь культуры PAO1, взяв одну колонию из прожилочной пластины и добавив ее в 5 мл LB среды. Инкубировать в течение ночи (18 часов), затем разбавить до наружного диаметра600 0,05 (эквивалентно 1 x 108 КОЕ/мл) и далее развести 1:100 в SCFM2, приготовленном в соответствии с Palmer, et al.16.
  3. Добавьте 180 мкл инокулюма в лунки 96-луночного микротитровального планшета с круглым дном. Подготовьте биопленки в биологическом тройном экземпляре для подсчета колониеобразующими единицами (КОЕ). В общей сложности 3 репликации на биологическую реплику выполняются только для количественной ПЦР. В 3 отдельные лунки добавьте 180 мкл стерильного SCFM2 для использования для контроля среды.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пластины с круглым дном были выбраны в отличие от традиционных пластин с плоским дном из-за их превосходства в обеспечении однородного воздействия всей биопленки на окружающую среду для роста17.
  4. Дайте биопленкам сформироваться в течение 24 часов, инкубируя при 37 °C и встряхивая при 75 об/мин.

2. Получение многовидовых биопленок

  1. Оживите P. aeruginosa PAO1 и S. aureus SH1000 из замороженных культур бусин, как описано выше. Оживите C. albicans CAF2.1 из замороженных культур бусин путем нанесения одной бусины на агар декстрозы Saboraud и инкубации в течение 24 часов при 37 °C.
  2. Приготовьте ночные культуры SH1000 и CAF2.1, взяв одну колонию из полосовой пластины и добавив 5 мл LB (отдельные ночные культуры для каждого организма). Выдерживать в течение ночи в течение 18 часов. Стандартизируйте ночные культуры S. aureus SH1000 и C. albicans CAF2.1 в LB до значений OD600 0,1, что соответствует 1 x 109 и 1,2 x 107 КОЕ/мл соответственно17,18.
  3. Разбавьте S. aureus и C. albicans с образованием одного инокулюма, содержащего оба вида в концентрациях 1 x 106 и 1 x 105 КОЕ/мл, соответственно, в SCFM2.
  4. Добавьте 162 мкл инокулюма в лунки 96-луночного микротитровального планшета. Инокулируйте биопленки в биологическом трипликате для подсчета колониеобразующими единицами (КОЕ). В общей сложности 3 репликации на биологическую реплику выполняются только для количественной ПЦР. В 3 отдельные лунки добавьте 180 мкл стерильного SCFM2 для использования для контроля среды.
  5. Дайте биопленкам сформироваться в течение 24 часов, инкубируя при 37 °C и встряхивая при 75 об/мин.
  6. Приготовьте ночную культуру PAO1, взяв одну колонию из полосовой пластины и добавив ее к 5 мл LB среды. Инкубируйте в течение ночи (18 часов), затем добавьте наружный диаметр600 0,05 (эквивалентно 1 x 108 КОЕ/мл) и дополнительно разбавьте до 1 x 105 КОЕ/мл в SCFM2.
  7. Добавьте 14,2 мкл инокулюма PAO1 в лунки 96-луночного микротитровального планшета, в результате чего конечный инокулюм PAO1 составит 1 x 104 КОЕ/мл.<бр/> ПРИМЕЧАНИЕ: Такое изменение концентрации инокулята между различными видами необходимо для того, чтобы гарантировать, что S. aureus и C. albicans не будут вытеснены P. aeruginosa и все они могут быть восстановлены путем точечного осаждения из 24-часовой биопленки, где отсутствуют антибиотики.
  8. Дайте полимикробным биопленкам сформироваться в течение 24 часов, инкубируя при 37 °C и встряхивая при 75 об/мин.

3. ДНКазная и антибактериальная обработка одновидовых и многовидовых биопленок

  1. Добавьте 2 мкл ДНКазы I непосредственно в лунки, содержащие биопленки, в конечной концентрации 50 мкг/мл, инкубируйте в течение 1 ч при 37 °C и встряхивайте при 75 об/мин.<бр/> ПРИМЕЧАНИЕ: Он добавляется для разжижения вязких биопленок, чтобы обеспечить лучшее проникновение противомикробных препаратов, отражая дозировку рДНКазы (рекомбинантной ДНКазы человека), которую многие люди с муковисцидозом принимают в качестве стратегии лечения легочных обострений.
  2. Приготовьте бульон меропенема с антибиотиком до 2,56 мг/мл, используя в качестве разбавителя дистиллированную воду. Серийно разбавляют в 2 раза до достижения концентраций 0,01 мг/мл - 2,56 мг/мл.
  3. Добавьте по 20 мкл каждого раствора меропенема в биопленки для достижения диапазона дозировок от 1 мкг/мл до 256 мкг/мл. Добавьте 20 мкл дистиллированной воды в отрицательные контрольные биопленки вместо антибиотика.
  4. Запечатайте 96-луночный микротитровальный планшет прозрачной пленкой и инкубируйте при 37 °C в течение 24 часов, встряхивая при 75 об/мин.

4. Перечисление жизнеспособных клеток и метаболической активности

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги относятся только к биопленкам, предназначенным для количественного определения КОЕ.

  1. Добавьте 10 мкл целлюлазы (100 мг/мл, 0,05 М цитратный буфер) в биопленки и инкубируйте при 37 °C в течение 1 ч, встряхивая при 140 об/мин. Целлюлаза регулярно используется для разрушения целлюлозных скелетов в биопленках19,20,21. При необходимости разрушайте биопленки путем пипетирования вверх и вниз до тех пор, пока не исчезнут видимые комки.
  2. Добавьте 10 мкл 0,02% раствора резазурина для оценки метаболической активности исследуемых биопленок и контрольных биопленок и инкубируйте при 37 °С в течение 1 ч, встряхивая при 140 об/мин.
  3. Измерьте флуоресценцию каждой лунки с использованием длины волны возбуждения 540 нм и длины волны излучения 590 нм в считывателе микропланшетов.
  4. Скорректировать фоновую флуоресценцию путем вычитания значений флуоресценции из образцов пустых сред и рассчитать процентное снижение как (среднее значение Fобработанных антибиотиками биопленок/среднее значениеотрицательного контроля F) x 100 %.
  5. Перечислите содержимое лунок, содержащих как разрушенные биопленки, так и планктонные клетки, путем последовательного разбавления и точечного нанесения на селективный агар следующим образом:
    Селективный агар Pseudomonas с добавлением 1% глицерина и добавкой CN для перечисления P. aeruginosa
    Маннитовый солевой агар для перечисления S. aureus|
    Дрожжевой пептон декстрозы агар с добавлением пенициллина (250 Ед/мл), стрептомицина (250 мкг/мл), гентамицина сульфата (30 мкг/мл) и ванкомицина (3 мкг/мл) для подсчета C. albicans.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все содержимое лунок перечислено в связи с трудностями отделения свободно плавающей агрегатной биопленки от планктонных клеток. Однако такой подход более точно отражает условия, присутствующие в легких при муковисцидозе. После инкубации на крышке может присутствовать конденсат. Чтобы обеспечить отсутствие загрязнения между лунками, установите точечную пластину стерильных элементов управления на селективный агар.
  6. После точечного нанесения на селективный агар планшеты инкубируют в течение 24 ч при 37 °C перед подсчетом.

5. Подготовка биопленок для экстракции РНК

ПРИМЕЧАНИЕ: Все шаги, начиная с этого момента, относятся только к биопленкам, предназначенным для анализа ОТ-кПЦР.

  1. Извлеките 96-луночный микротитровальный планшет, содержащий биопленки, из инкубатора при температуре 37 °C и перенесите их в микроцентрифужную пробирку объемом 1 мл. При переносе убедитесь, что репликации биопленки объединены для каждого выполненного биологического повтора. Это гарантирует, что биомассы достаточно для экстракции РНК.
  2. Центрифугируйте пробирки объемом 1,5 мл, содержащие биопленки, при давлении 16 000 x g в течение 5 минут. Если экстракция РНК выполняется в тот же день, перейдите к шагу 6.2.1. Если экстракция РНК не проводится в тот же день, удалите надосадочную жидкость и храните гранулу в 250 мкл раствора для стабилизации РНК при температуре -20 °C. Это решение использовалось для хранения бактериальных гранул в нескольких исследованиях22,23.

6. Выделение РНК

  1. Извлекайте бактериальные РНК, одновидовые и многовидовые биопленки с помощью коммерческого набора. Подготовьте буферы в соответствии с инструкциями производителя.
  2. Удалите надосадочную жидкость и выбросьте ее. Если гранула хранилась в стабилизирующем растворе, разморозьте ее до комнатной температуры и центрифугируйте при 16 000 x g в течение 5 минут. Повторно суспендируйте гранулу в 600 μл реагента для экстракции РНК, затем вручную разрушьте ее с помощью иглы 0,2 мм, прикрепленной к шприцу объемом 2 мл (аспират в 5-10 раз или до полного разрушения гранулы).
  3. Выполните этапы очистки РНК в соответствии с инструкциями производителя.
  4. Количественное определение РНК с помощью УФ-спектроскопа, набора для анализа РНК BR и пробирок. Определяемые пределы РНК с помощью набора для анализа составляют 10 - 1200 нг/мкл, следовательно, минимально допустимый выход РНК для этого протокола составляет 10 нг/мкл.
    1. Установите необходимое количество пробирок для образцов и стандартов (требуется 2 стандарта).
    2. Приготовьте рабочий раствор, добавив 199 мкл буфера и 1 мкл реагента на количество проб (+ 2 стандартных и 2 для погрешности).
    3. Добавьте 190 мкл рабочего раствора и по 10 мкл Стандарта 1 и Стандарта 2 в отдельные пробирки.
    4. Добавьте 199 мкл рабочего раствора и 1 мкл образца РНК в отдельные пробирки. Вортекс в течение 30 с, а затем хранить в темном месте в течение 5 минут.
    5. На флуориметре выберите РНК > РНК широкого спектра действия и следуйте инструкциям.
    6. Оцените качество РНК с помощью спектрофотометра. Очистите спектрофотометр, нанеся на спектрофотометр 1 мкл воды, свободной от ДНКазы/РНКазы. Сотрите воду с помощью безворсовой салфетки и установите соотношение поглощения 260/280 нМ. Пипеткой нанесите 1 мкл РНК на спектрофотометр. Если РНК чистая, то будет наблюдаться один пик между 260 и 280 нМ, и будет показано соотношение ~ 2,0.
  5. Преобразуйте извлеченную РНК в комплементарную ДНК (кДНК) с помощью набора для синтеза кДНК. Для любых образцов РНК, превышающих 50 нг/л, сначала разбавьте до 50 нг/мкл с помощью воды, не содержащей ДНКазы/РНКазы.
    1. С помощью пробирок приготовьте реакционную смесь кДНК в соответствии с таблицей 1.
    2. Поместите пробирки в термоамплификатор при следующих условиях: 25 °C в течение 5 мин, 42 °C в течение 30 мин, 85 °C в течение 5 мин. Либо используйте кДНК немедленно, либо храните ее в замороженном виде при температуре -20 °C.

7. qPCR

  1. Проведите кПЦР с использованием мастер-микса для кПЦР. Используйте следующие праймеры algD и гена домашнего хозяйства (16S) (Таблица 2).
    Примечание: Праймеры были разработаны с использованием онлайн-инструмента NCBI-primer Blast с привязкой ко всей последовательности генома P. aeruginosa, а затем синтезированы через коммерческого поставщика. Праймеры были проверены на специфичность в полимикробных биопленках путем сопоставления последовательностей с помощью инструмента NCBI-primer Blast.
  2. Разбавьте праймеры до 4 мкМ (4 пм/мкл), разбавив 20 мкл праймера в 480 мкл воды, не содержащей ДНКазы/РНКазы. Их можно заморозить для многократного использования.
  3. Приготовьте рабочий раствор мастер-смеси для количественной ПЦР в соответствии с инструкциями в таблице 3.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рабочий раствор algD содержит достаточно раствора для 3 биологических повторов и 3 технических повторов на концентрацию меропенема, 6 отрицательных контрольных значений и 2 погрешности. Рабочие растворы 16S содержат достаточное количество раствора для 2-кратной нормы известной концентрации РНК и 2-кратной погрешности.
  4. Добавьте 18 мкл рабочего раствора algD в соответствующие реакционные пробирки для количественной ПЦР. Это будет включать в себя в общей сложности 36 пробирок для анализа экспрессии algD и 6 пробирок для отрицательного контроля.
  5. Добавьте по 2 мкл РНК в каждую из реакционных пробирок для количественной ПЦР или 2 мкл воды, не содержащей ДНКазы/РНКазы, в отрицательный контроль.
  6. Добавьте 18 мкл рабочего раствора 16S в соответствующие реакционные пробирки для количественной ПЦР. Это будет включать в себя в общей сложности 2 трубки. Добавьте 2 мкл РНК известной концентрации в реакционные пробирки для количественной ПЦР.
  7. КПЦР проводят в соответствии со следующими условиями: 2 мин при 95 °C, 15 с при 95 °C (40 циклов), 1 мин при 60 °C.
  8. Проанализируйте результаты количественной ПЦР с помощью метода 2-ΔΔCt, как описано ранее24. При анализе экспрессии algD используйте экспрессию algD на уровне 0 мкг/мл в качестве контроля для соответствующих биопленочных композиций и учитывайте экспрессию изменения кратности, относящуюся к необработанным культурам

Результаты

Результаты, представленные на рисунке 1A, подчеркивают устойчивость одновидовых биопленок Pseudomonas при воздействии меропенема, так как при всех протестированных дозировках не наблюдалось значительного снижения. В отрицательном контроле, который не подвергался воздействию меропенема, выход составил 8,31 ± 0,07 Log10CFU/mL, в то время как наибольшее снижение количества жизнеспособных клеток наблюдалось при 16 µg/mL, что привело к выходу 8,06 ± 0,10 Log10CFU/mL. Однако такой уровень резистентности является ожидаемым, поскольку в литературе показано, что биопленки P. aeruginosa гораздо более устойчивы к меропенему, чем их планктонные аналоги: для бактерицидного действия против биопленок требуется концентрация >256 µg/mL25,26, в то время как для планктонных клеток МПК составляет 2 µg/mL.

Рисунок 1B демонстрирует средний процент снижения метаболической активности монокультур биопленок P. aeruginosa при каждой концентрации антибиотика по сравнению с контрольной биопленкой, которая не подвергалась воздействию меропенема. Снижение флуоресценции соответствует снижению метаболической активности, что принимается в качестве косвенного показателя сокращения количества жизнеспособных клеток. Культуры, обработанные меропенемом, показали повышенную метаболическую активность (обозначенную отрицательным процентом снижения), что указывает на отсутствие (или очень ограниченную) бактерицидную активность.

Повышение метаболической активности без увеличения выхода КОЕ может указывать на метаболический ответ бактерий на воздействие антибиотика. Между одновидовыми и многовидовыми биопленками (Рисунок 2), общий рост P. aeruginosa отличались лишь незначительно: выход жизнеспособных клеток из моновидового биопленочного сообщества составил 0,74 ± 0,17 Log10количество КОЕ/мл было выше, чем в полимикробной биопленке при отсутствии антибиотика. S. aureus был выделен из полимикробного биопленочного сообщества в концентрации 6,95 ± 0,11 Log10КОЕ/мл, и C. albicans был выделен в количестве 1,66 ± 2,88 Log10КОЕ/мл. C. albicans, однако он присутствует только в тех образцах, куда не добавляли меропенем, и не был обнаружен ни в одном биопленочном сообществе, в которое вводился данный антибиотик. Поскольку меропенем не оказывает прямого воздействия на Candida, что было продемонстрировано в предыдущих анализах МИК, проведенных в лаборатории на C. albicans монокультура, в которой значение МПК меропенема составляло >256 µg/mLвероятно, это бактериальный стрессовый ответ других совместно обитающих видов, S. aureus и P. aeruginosa, к воздействию антибиотика, которое создает неблагоприятные условия для грибка.

Поскольку биопленки P. aeruginosa, как в монокультуре, так и при совместной колонизации с другими патогенами, не демонстрируют снижения восстановления жизнеспособных клеток при концентрациях меропенема до 256 µg/mL, это подчеркивает необходимость поиска альтернативных методов лечения, таких как антивирулентная терапия, для борьбы с подобными хроническими инфекциями в клинической практике; такие методы могут применяться в сочетании с антимикробными препаратами для эффективного снижения бактериальной нагрузки.

Экспрессия algD в P. aeruginosa PAO1 в одновидовых биопленках
Экспрессию algD в P. aeruginosa PAO1, подвергнутых воздействию различных концентраций меропенема (1, 16 и 256 µg/mL) при культивировании в среде SCFM2, оценивали с помощью RT-qPCR с использованием SYBR-Green. Затем анализ уровня экспрессии проводили методом 2-ΔΔCt, используя 16S в качестве контрольного гена (Рисунок 3). Экспрессия algD существенно не различалась при использовании разных концентраций меропенема, что позволяет предположить, что при росте в виде одновидовой биопленки экспрессия algD у PAO1 не подвергается сильному влиянию присутствия меропенема.

Экспрессия algD в P. aeruginosa PAO1 в многовидовых биопленках
Экспрессия algD также оценивалась у P. aeruginosa PAO1, выращенной в биопленках, состоящих из S. aureus SH100 и C. albicans CAF2.1, чтобы определить, влияет ли присутствие совместно колонизирующих организмов на экспрессию algD или на ответ PAO1 на меропенем. При воздействии меропенема в диапазоне 0–16 µg/mL значимых различий в экспрессии algD не наблюдалось. Однако при 256 µg/mL экспрессия algD была значительно выше по сравнению с другими концентрациями антибиотика (0 µg/mL против 256 µg/mL p = 0.0075, 1 µg/mL против 256 µg/mL p = 0.035, 16 µg/mL против 256 µg/mL p = 0.0048) и примерно в 7 раз превышала контрольный уровень (Рисунок 4). Это подчеркивает, что при совместном росте с S. aureus и C. albicans наблюдается повышенная экспрессия algD при максимальной концентрации меропенема по сравнению с ростом P. aeruginosa в монокультуре, что указывает на увеличение продукции альгината в полимикробных условиях. Несмотря на выявленные различия в экспрессии algD между одновидовыми и многовидовыми биопленками, остается неясным, обусловлено ли это повышение экспрессии присутствием конкретного вида (S. aureus или C. albicans ) или же взаимодействием обоих микроорганизмов.

Эти результаты подчеркивают важность понимания влияния терапевтических средств и окружающей среды на экспрессию генов, особенно в контексте будущего тестирования препаратов, нацеленных на факторы вирулентности.

Столбчатые диаграммы ингибирования роста бактерий P. aeruginosa, S. aureus и C. albicans в зависимости от концентрации.
Рисунок 1: Одновидовые биопленки, состоящие из Pseudomonas aeruginosa PAO1. Биопленки культивировали в течение 24 ч в SCFM2, обрабатывали DNase I в концентрации 50 µg/mL в течение 1 ч, а затем подвергали воздействию меропенема в различных концентрациях в течение еще 24 ч. (A) Среднее значение Log10CFU/mL. Пунктирная линия обозначает снижение на 2 логарифмических единицы (что эквивалентно снижению на 99 %) восстановления P. aeruginosa по сравнению с отрицательным контролем. (B>) Процент снижения относительных единиц флуоресценции. Пунктирная линия обозначает 50-процентное снижение флуоресценции; первая точка выше этой линии считается значением MIC50. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Графики зависимости бактериального роста (A) и снижения флуоресценции (B) от концентрации меропенема.
Рисунок 2Многовидовые биопленки, состоящие из Pseudomonas aeruginosa PAO1, Staphylococcus aureus SH1000 и Candida albicans CAF2.1Биопленки культивировали в течение 24 ч в среде SCFM2, после чего подвергали воздействию 50 µg/mL ДНКазой I в течение 1 часа, а затем обрабатывали меропенемом в различных концентрациях в течение последующих 24 часов. Пунктирная линия обозначает снижение на 2 порядка (что эквивалентно снижению на 99 %) в *P. aeruginosa* восстановление по сравнению с отрицательным контролем. Значимость определяли с помощью двухфакторного анализа отклонений (ANOVA), где **** p < 0.0001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Столбчатая диаграмма относительной экспрессии в зависимости от концентрации (µg/ml), показывающая результат статистического анализа (ns).
Рисунок 3: Экспрессия algD в моновидовых биопленках, состоящих из P. aeruginosa PAO1. Биопленки культивировали в течение 24 ч в среде SCFM2, обрабатывали 50 µg/mL DNase I в течение 1 ч и подвергали воздействию различных концентраций меропенема (0, 1, 16, 256 µg/mL). Экспрессию генов анализировали методом 2-ΔΔCt. В качестве референсного гена использовали 16S . Значимость определяли с помощью критерия множественных сравнений Тьюки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Столбчатая диаграмма относительной экспрессии в зависимости от концентрации; статистическая значимость; анализ экспрессии генов.
Рисунок 4: Экспрессия algD выделенного из многовидовых биопленок, состоящих из P. aeruginosa PAO1, S. aureus SH1000 и C. albicans CAF2.1. Биопленки культивировали в среде SCFM2, обрабатывали DNase I в концентрации 50 µg/mL в течение 1 ч, а затем обрабатывали меропенемом в различных концентрациях (0, 1, 16, 256 µg/mL) еще в течение 24 ч. Экспрессию генов анализировали с помощью метода 2-ΔΔCt. В анализе использовали ген домашнего хозяйства 16S . **p < 0.01 по результатам теста Тьюки для множественных сравнений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть этот рисунок в большем размере.

Объем на одну реакцию синтеза кДНК (μL)
5X реакционная смесь iScript4
обратная транскриптаза iScript1
Вода, свободная от ДНКаз/РНКаз14
2,5 нг РНК1
Общий объем реакции 20

Таблица 1: Рабочие растворы мастер-микса для синтеза кДНК. Компоненты и объемы, необходимые для одной реакции синтеза кДНК.

ГенПрямой праймерОбратный праймер
algDCGCCGAGATGATCAAGTACATGTAGTAGCGCGACAGGTTG
16SACCGCATACGTCCTACGGCGAAGACCTTCTTCACACACG

Таблица 2: algD и 16S прямые и обратные праймеры для кПЦР.

Объем на одну реакцию (µL)algD рабочий объем (µL)16S рабочий объем (µL)
GoTaq qPCR Master Mix (2X)1044040
Прямой праймер1444
Обратный праймер1444
Вода, свободная от ДНКаз и РНказ626424
Общее количество 1879272

Таблица 3: Рабочие растворы мастер-микса для qPCR. Компоненты и объемы, необходимые для приготовления растворов мастер-микса для qPCR algD и 16S.

Дополнительный рисунок 1: Многовидовые биопленки, состоящие из Pseudomonas aeruginosa LESB58, Staphylococcus aureus SH1000 и Candida albicans CAF2.1. Биопленки культивировали в течение 24 ч (n = 3) в среде SCFM2, обрабатывали ДНКазой I в концентрации 50 µg/mL в течение 1 ч, а затем обрабатывали меропенемом в различных концентрациях еще в течение 24 ч. Пунктирная линия обозначает снижение выхода P. aeruginsoa на 2 порядка (что эквивалентно снижению на 99%) по сравнению с отрицательным контролем. Статистический анализ проводили с помощью двухфакторного ANOVA. *p=0.0242, ** p=0.0013, **** p <0.0001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот рисунок.

Обсуждение

Эти результаты показывают, что, несмотря на его частое использование в лечении легочных обострений у людей с муковисцидозом, меропенем не оказывал существенного влияния на рост P. aeruginosa в одновидовой или многовидовой модели биопленки. Небольшое увеличение восстановления P. aeruginosa наблюдалось в обеих моделях после обработки меропенемом 128 мкг/мл и 256 мкг/мл, как и у S. aureus в многовидовой биопленке; Однако этот рост был незначительным. Снижение содержания C. albicans при воздействии меропенема может быть связано с неблагоприятными условиями для грибка, создаваемыми бактериями в ответ на стресс противомикробных препаратов. Не наблюдалось существенных различий в экспрессии algD между концентрациями меропенема при выращивании P. aeruginosa в виде одновидовой биопленки. Тем не менее, экспрессия algD была значительно выше в многовидовых биопленках при обработке меропенемом 256 мкг/мл, что позволяет предположить, что продукция альгината может быть увеличена в этих условиях. Наблюдаемые различия в экспрессии algD между составами биопленки и концентрациями меропенема показывают, как присутствие соответствующих факторов может влиять на экспрессию генов, связанных с инфекцией, и подчеркивают важность учета использования противомикробных препаратов и статуса полимикробной инфекции при разработке и тестировании альтернатив антибиотикам.

Несмотря на полезность моделей, есть несколько соображений для обеспечения успешного применения. Установление S. aureus и C. albicans в биопленках имеет важное значение до инфицирования P. aeruginosa, поскольку существует риск того, что S. aureus и C. albicans будут вытеснены грамотрицательными. В этой модели биопленки C. albicans является плохим партнером из-за значительно более низких показателей выживаемости по сравнению с S. aureus и P. aeruginosa, даже в отсутствие антибиотиков. Это говорит о том, что дрожжи либо вытесняются за ресурсы, либо подвергаются негативному влиянию межвидовых взаимодействий внутри биопленки27,28. Отсутствие C. albicans в присутствии меропенема, несмотря на то, что антибиотик не обладает прямой противогрибковой активностью, поддерживает идею о том, что стрессовая реакция S. aureus на меропенем может создать среду, которая негостеприимна для C. albicans29,30. Тем не менее, важно отметить, что выбор штамма может повлиять на количество C. albicans, которое может быть выделено из модели полимикробной биопленки. Различные тенденции наблюдаются при использовании P. aeruginosa LESB58 вместо PAO1 (дополнительный рисунок 1). При использовании LESB58 C. albicans может быть восстановлен при всех концентрациях меропенема и фактически демонстрирует небольшое увеличение, поскольку концентрация P. aeruginosa снижается в результате действия противомикробного препарата, что позволяет изменить состав сообщества. Однако, несмотря на эти различия, PAO1 используется в этой модели из-за того, что он является лабораторным эталонным штаммом, что обеспечивает согласованную и хорошо охарактеризованную основу для сравнительных исследований. Такая согласованность имеет решающее значение для воспроизводимости и для получения надежных выводов о взаимодействиях внутри биопленки.

Извлечение большого количества РНК из бактерий, выращенных в SCFM2, может быть сложной задачей из-за вязкой природы среды. Таким образом, разрушение биопленки иглами диаметром 0,2 мм перед экстракцией РНК является важным шагом для увеличения выхода РНК и обеспечения достаточных концентраций (≥10 нг/мкл) для ОТ-кПЦР. РНК очень чувствительна к деградации31, поэтому после экстракции убедитесь, что все последующие действия, в которых используется РНК, выполняются на льду. Регулярное замораживание-размораживание праймеров РНК, кДНК и количественной ПЦР может увеличить вероятность деградации продукта. Поэтому его следует максимально ограничить. Еще одной распространенной проблемой при применении этих моделей является риск загрязнения во время экстракции РНК или количественного анализа ПЦР. Этот риск можно свести к минимуму, распыляя на оборудование раствор для деградации ДНК перед экстракцией РНК и используя наконечники для пипеток без ДНКазы/РНКазы на протяжении всей процедуры. Регулярная замена воды, не содержащей ДНКазы/РНКазы, также поможет снизить риск загрязнения при количественном анализе ПЦР.

В этом протоколе было решено сосредоточить внимание на algD как на гене, представляющем интерес из-за его необходимости в производстве альгината, который описывается как ключевой фактор вирулентности P. aeruginosa как при острых, так и при хроническихинфекциях. Таким образом, альгинат все чаще изучается в качестве мишени для антивирулентной терапии 33,34. Хотя эта модель использовалась для оценки экспрессии algD, она может быть применена для оценки экспрессии других генов P. aeruginosa для различных мишеней антивирулентных препаратов. Меропенем был использован в этом исследовании в связи с данными, свидетельствующими о том, что антибиотик влияет на экспрессию генов биосинтеза альгината, особенно при выращивании P. aeruginosa в присутствии C. albicans35. Кроме того, меропенем часто клинически назначают для лечения и контроля респираторных инфекций P. aeruginosa, что подчеркивает его значимое применение в данной модели. Тем не менее, добавление различных антибиотиков или даже двойное лечение также возможно с помощью этих моделей. Включение антибиотиков в эту модель также позволило бы использовать эту модель для изучения эволюционных изменений в механизмах бактериальной резистентности, таких как развитие порин-опосредованной резистентности P. aeruginosa к карбапенемам37. Эта модель полимикробной биопленки может быть адаптирована для включения других соответствующих видов, например, комменсальных бактерий, таких как Rothia sp. и Streptococcus sp., или заменена другими микробами, вызывающими инфекцию, такими как Aspergillus sp., чтобы отразить требования исследуемого лекарственного препарата.

Ранее были разработаны модели полимикробной биопленки, имитирующие легкие с муковисцидозом38. Описанная здесь модель основана на предыдущей работе с целью увеличения производительности за счет использования установки, пригодной для микробных культур в небольших объемах. Это полезно для тестирования новых соединений там, где доступный материал может быть ограничен. Поскольку модель является мелкомасштабной и статичной, можно выращивать биопленки с различной доступностью кислорода, чтобы более точно отражать микроаэрофильную среду в легких39,40. Для простоты воспроизведения и по соображениям экономической эффективности, биопленки, о которых сообщалось в этом исследовании, выращивали аэробным способом.

Несмотря на ценные выводы, полученные в результате этого исследования, необходимо признать несколько ограничений. Во-первых, отсутствие клеток-хозяев ограничивает его полезность для изучения факторов вирулентности, которые имеют прямую клеточную мишень млекопитающих. В этом документе описываются проблемы создания моделей in vitro , пригодных для изучения факторов вирулентности, и подчеркивается необходимость дальнейшей разработки моделей, которые воспроизводят враждебную среду хронических инфекций. Кроме того, несмотря на то, что альгинат считается фактором вирулентности, он является ключевой особенностью биопленок и производится P. aeruginosa как в лаборатории, так и в окружающей среде. Использование моделей in vitro для изучения антибиопленочных агентов может быть менее сложным, чем использование моделей для изучения других антивирулентных терапий, таких как антиэкзотоксины, где мишень оказывает прямое действие на эукариотические клетки41.

В то время как выбор штамма P. aeruginosa PAO1 подходит для воспроизводимости и стандартизации модели in vitro , может быть желательно включить изоляты хронической инфекции. Будущие эксперименты с использованием этой модели со штаммом, выделенным из образцов пациентов, должны быть проведены для наблюдения за влиянием противомикробных препаратов на штаммы, адаптированные к дыхательной нише.

Использование SCFM2 в качестве имитатора мокроты в этой модели in vitro позволяет проводить стандартизированное и воспроизводимое наблюдение за поведенческими изменениями агрегированных биопленок, культивируемых в среде, соответствующей дыхательным путям, во время курса лечения антибиотиками. SCFM2 был выбран по сравнению с оригинальной версией SCFM из-за включения внеклеточной ДНК (eDNA) и муцина, которые являются важными факторами в поддержке образования биопленок. Тем не менее, важно отметить, что существуют и другие варианты синтетических сред мокроты, такие как SCFM3, который содержит p-аминобензойную кислоту, NAD+, аденин, гуанин, ксантин и гипоксантин42, и SCFM4, который является железодефицитной версией. Кроме того, использование синтетических сред мокроты, таких как среда легких при муковисцидозе (CFLM) и синусовая среда муковисцидоза (CFSM), разработанная Ruhluel и коллегами43, позволит разделить дыхательные пути для визуализации поведения и эффекта антивирулентной терапии на полимикробные биопленки в различных средах.

В то время как AlgD является ключевым ферментом в биосинтетическом пути альгината, сам по себе уровень его экспрессии не следует воспринимать как показатель производства альгината. Другие факторы, такие как посттранскрипционные и посттрансляционные модификации, а также регуляторные механизмы, могут влиять на количество производимого альгината, что приводит к снижению образования биопленки, повышению восприимчивости к стрессу окружающей среды и повышению чувствительности к антибиотикам при снижении выработки альгината 12,14. В настоящее время разрабатывается несколько антивирулентных препаратов, нацеленных на альгинатный белок, причем данная модель не подходит для определения их эффективности и где было бы более целесообразно непосредственно измерять продукцию альгината или функциональное считывание44. Кроме того, некоторые антивирулентные терапии могут быть нацелены на различные стадии биосинтеза или регуляции альгината, поэтому измерение продукции альгината напрямую фиксирует суммарный эффект терапии на фактор вирулентности44. Тем не менее, некоторые из антивирулентных терапий в текущих исследованиях нацелены на ключевые альгинатные гены, и модели экспрессии генов, подобные этим, были бы уместны для изучения эффектов таких терапий. Подобные методы также могут быть легко адаптированы для высокопроизводительного скрининга, что позволяет быстро оценить несколько образцов или условий, что полезно в крупномасштабных исследованиях, включающих первоначальный скрининг потенциальных антивирулентных соединений.

В целом, одновидовые и многовидовые модели биопленки представляют собой ценные инструменты для изучения экспрессии генов P. aeruginosa, связанных с инфекцией, в условиях, подходящих для муковисцидоза. Широкомасштабное внедрение модуляторной терапии произвело революцию в сфере здравоохранения при муковисцидозе. Однако, несмотря на множество клинических преимуществ модуляторов муковисцидоза, исследования показали, что клональные линии Pseudomonas постоянноциркулируют, подчеркивая, что новые методы лечения инфекций легких P. aeruginosa всееще необходимы. Несмотря на обсуждаемые ограничения, применение этих моделей может быть полезным на этапе открытия процесса разработки лекарств для оценки эффективности соединений в нише легких муковисцидоза и взаимодействия новых антивирулентных соединений с известными антибиотиками в этой среде.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

HL, DN, and JF получили грантовую поддержку для Центра стратегических исследований (SRC) Научно обоснованная доклиническая основа для разработки антимикробных терапевтических средств при муковисцидозе (PIPE-CF; Проект No. SRC 022) от Британского фонда муковисцидоза и Фонда муковисцидоза США. TH поддерживается аспирантурой MRC Discovery Medicine North Doctoral Training Partnership. Мы выражаем благодарность за финансирование CF Trust and CF Foundation (SRC022) и схеме MRC DiMEN DTP

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Дышащая уплотнительная мембрана для многолуночных планшетов Сигма Олдрич 
Горелка
Целлюлаза (100 мг/мл)Cambridge Bioscience Добавка HY-B2220-5g
CN Сигма Олдрич 1.07624
Набор для мини-подготовки РНК Direct-zolZymo ResearchR2050
Dnase I Thermo Fisher ScientificEN0521
Вода без ДНКазы/рназыVWRJ60610. XC
Гентамицина сульфат (30 &; g/mL)Сигма Олдрич G3632
Глицерин (1 %)Thermo Fisher Scientific15514029
GoTaq qPCR Master Mix Promega A6101
Комплект синтеза iScript Cdna Bio-Rad1708890
пенициллин (250 Ед/мл)Научные лабораторные принадлежностиP3032-10MU
Qubit 4 ФлуориметрThermo Fisher ScientificQ33238
Набор для анализа РНК кубита BR Thermo Fisher ScientificQ10210
Трубки для кубитовThermo Fisher ScientificQ32856
Раствор резазурина (0.02 %)Thermo Fisher ScientificR12204
RNAlater SolnInvitrogenAM7021
Стрептомицин (250 &; g/mL)Сигма Олдрич S9137
(мы использовали термоамплификатор T100)Biorad1861096
реагент TRIzol Инвитроген15596026
ванкомицин (3 &; g/mL)Сигма Олдрич 
Z763624БунзенаТермоамплификатор 1709007

Ссылки

  1. Blanchard, A. C., Waters, V. J. Opportunistic pathogens in Cystic Fibrosis: Epidemiology and pathogenesis of lung infection. J Pediatric Infect Dis Societ. 11 (Supplement_2), S3-S12 (2022).
  2. Kordes, A., et al. Genetically diverse Pseudomonas aeruginosa populations display similar transcriptomic profiles in a cystic fibrosis explanted lung. Nat Comm. 10 (1), 3397(2019).
  3. Chotirmall, S. H., Greene, C. M., McElvaney, N. G. Candida species in cystic fibrosis: A road less travelled. Med Mycol. 48 (Supplement_1), S114-S124 (2010).
  4. Françoise, A., Héry-Arnaud, G. The microbiome in Cystic fibrosis pulmonary disease. Genes (Basel). 11 (5), 536(2020).
  5. Haiko, J., Saeedi, B., Bagger, G., Karpati, F., Özenci, V. Coexistence of Candida species and bacteria in patients with cystic fibrosis. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 38 (6), 1071-1077 (2019).
  6. Filkins, L. M., O’Toole, G. A. Cystic fibrosis lung infections: polymicrobial, complex, and hard to treat. PLoS pathogens. 11 (12), e1005258(2015).
  7. Barton, T. E., Frost, F., Fothergill, J. L., Neill, D. R. Challenges and opportunities in the development of novel antimicrobial therapeutics for cystic fibrosis. J Med Microbiol. 71 (12), (2022).
  8. Akkerman-Nijland, A. M., et al. The pharmacokinetics of antibiotics in cystic fibrosis. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 17 (1), 53-68 (2021).
  9. Lindgren, N. R., McDaniel, M. S., Novak, L., Swords, W. E. Acute polymicrobial airway infections: analysis in cystic fibrosis mice. Microbiology (Reading). 169 (1), 001290(2023).
  10. Hurley, M. N., Ariff, A. H. A., Bertenshaw, C., Bhatt, J., Smyth, A. R. Results of antibiotic susceptibility testing do not influence clinical outcome in children with cystic fibrosis. Journal of Cystic Fibrosis. 11 (4), 288-292 (2012).
  11. Totsika, M. Benefits and challenges of antivirulence antimicrobials at the dawn of the post-antibiotic era. Curr Med Chem. 6 (1), 30-37 (2016).
  12. Davarzani, F., et al. Evaluation of antibiotic resistance pattern, alginate and biofilm production in clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa. Iran J Public Health. 50 (2), 341-349 (2021).
  13. Ambutsi, M., Okoth, P. Comparative genomic analysis of gene clusters of Pseudomonas aeruginosa that define specific biofilm formation in deciphering target regions for novel treatment options. Sci African. 13, e00910(2021).
  14. Dai, J., Luo, W., Hu, F., Li, S. In vitro inhibition of Pseudomonas aeruginosa PAO1 biofilm formation by DZ2002 through regulation of extracellular DNA and alginate production. Front Cell Infect Microbiol. 13, 1333773(2024).
  15. Olson, M. E., Ceri, H., Morck, D. W., Buret, A. G., Read, R. R. Biofilm bacteria: formation and comparative susceptibility to antibiotics. Can J Vet Res. 66 (2), 86-92 (2002).
  16. Palmer, K. L., Aye, L. M., Whiteley, M. Nutritional cues control Pseudomonas aeruginosa multicellular behavior in cystic fibrosis sputum. J Bacteriol. 189 (22), 8079-8087 (2007).
  17. Pascoe, B., et al. Dormant cells of Staphylococcus aureus are resuscitated by spent culture supernatant. PLoS One. 9 (2), e85998(2014).
  18. Caldeira, J., Almeida, G., Macedo, A. L., Silva, J. P. M., Albergaria, H. Saccharomycin, a biocide from S. cerevisiae that kill-off other yeasts. Ann Med. 51 (Suppl 1), 94-95 (2019).
  19. Redman, W. K., Welch, G. S., Rumbaugh, K. P. Assessing biofilm dispersal in murine wounds. J Vis Exp. (174), e62136(2021).
  20. Zhang, J., et al. Cellulase promotes mycobacterial biofilm dispersal in response to a decrease in the bacterial metabolite gamma-aminobutyric acid. Int J Mol Sci. 25 (2), 1051(2024).
  21. Kamali, E., Jamali, A., Izanloo, A., Ardebili, A. In vitro activities of cellulase and ceftazidime, alone and in combination against Pseudomonas aeruginosa biofilms. BMC Microbiol. 21 (1), 347(2021).
  22. Cao, P., et al. A Pseudomonas aeruginosa small RNA regulates chronic and acute infection. Nature. 618 (7964), 358-364 (2023).
  23. Tremblay, J., Déziel, E. Gene expression in Pseudomonas aeruginosa swarming motility. BMC Genom. 11 (1), 587(2010).
  24. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  25. Aaron, S. D., et al. Single and combination antibiotic susceptibilities of planktonic, adherent, and biofilm-grown Pseudomonas aeruginosa isolates cultured from sputa of adults with cystic fibrosis. J Clin Microbiol. 40 (11), 4172-4179 (2002).
  26. Haagensen, J., et al. Spatiotemporal pharmacodynamics of meropenem- and tobramycin-treated Pseudomonas aeruginosa biofilms. J Antimicrob Chemother. 72 (12), 3357-3365 (2017).
  27. Jing, Q., et al. Staphylococcus aureus wraps around Candida albicans and synergistically escapes from Neutrophil extracellular traps. Front Immunol. 15, 1422440(2024).
  28. Wu, Y. M., et al. Enhanced virulence of Candida albicans by Staphylococcus aureus: Evidence in clinical bloodstream infections and infected Zebrafish embryos. J Fungi. 7 (12), 1099(2021).
  29. Ruiz-Sorribas, A., Poilvache, H., Van Bambeke, F. Pharmacodynamics of Moxifloxacin, Meropenem, Caspofungin, and their combinations against in vitro polymicrobial interkingdom biofilms. Antimicro Agents Chemother. 66 (2), e02149-e02121 (2022).
  30. Pohl, C. H. Recent advances and opportunities in the study of Candida albicans polymicrobial biofilms. Front Cell Infect Microbiol. 12, 836379(2022).
  31. Aburayyan, W. S. High-throughput RNA extraction method for P. aeruginosa and S. pyogenes biofilms. J Appl Pharma Sci. 13 (3), 97-105 (2023).
  32. Ramsey, D. M., Wozniak, D. J. Understanding the control of Pseudomonas aeruginosa alginate synthesis and the prospects for management of chronic infections in cystic fibrosis. Mol Microbiol. 56 (2), 309-322 (2005).
  33. Kim, S. K., et al. Inhibition of Pseudomonas aeruginosa alginate synthesis by Ebselen oxide and its analogues. ACS Infectious Diseases. 7 (6), 1713-1726 (2021).
  34. Gao, F., et al. Protective effects of anti-alginate monoclonal antibody against Pseudomonas aeruginosa infection of HeLa cells. Micro Pathogen. 145, 104240(2020).
  35. Alam, F., Blair, J. M. A., Hall, R. A. Transcriptional profiling of Pseudomonas aeruginosa mature single- and dual-species biofilms in response to meropenem. Microbiology (Reading). 169 (1), 001271(2023).
  36. Farrington, N., et al. Molecular pharmacodynamics of meropenem for nosocomial pneumonia caused by Pseudomonas aeruginosa. mBio. 15 (2), e03165-e03123 (2024).
  37. Meletis, G., Exindari, M., Vavatsi, N., Sofianou, D., Diza, E. Mechanisms responsible for the emergence of carbapenem resistance in Pseudomonas aeruginosa. Hippokratia. 16 (4), 303-307 (2012).
  38. O'Brien, T. J., Hassan, M. M., Harrison, F., Welch, M. An in vitro model for the cultivation of polymicrobial biofilms under continuous-flow conditions. F1000Res. 10, 801(2021).
  39. Guss, A. M., et al. Phylogenetic and metabolic diversity of bacteria associated with cystic fibrosis. ISME J. 5 (1), 20-29 (2011).
  40. Vandeplassche, E., et al. Antibiotic susceptibility of cystic fibrosis lung microbiome members in a multispecies biofilm. Biofilm. 2, 100031(2020).
  41. Hibbert, T. M., Whiteley, M., Renshaw, S. A., Neill, D. R., Fothergill, J. L. Emerging strategies to target virulence in Pseudomonas aeruginosa respiratory infections. Crit Rev Microbiol. , 1-16 (2023).
  42. Turner, K. H., Wessel, A. K., Palmer, G. C., Murray, J. L., Whiteley, M. Essential genome of Pseudomonas aeruginosa in cystic fibrosis sputum. Proc Natl Acad Sci. 112 (13), 4110-4115 (2015).
  43. Ruhluel, D., O'Brien, S., Fothergill, J. L., Neill, D. R. Development of liquid culture media mimicking the conditions of sinuses and lungs in cystic fibrosis and health. F1000Res. 11, 1007(2022).
  44. Yin, R., Cheng, J., Wang, J., Li, P., Lin, J. Treatment of Pseudomonas aeruginosa infectious biofilms: Challenges and strategies. Front Microbiol. 13, 955286(2022).
  45. Ledger, E. L., et al. Impact of CFTR modulation on Pseudomonas aeruginosa infection in people with Cystic Fibrosis. J Infect Dis. 230 (3), e536-e547 (2024).
  46. Armbruster, C. R., et al. Persistence and evolution of Pseudomonas aeruginosa following initiation of highly effective modulator therapy in cystic fibrosis. mBio. 15 (5), e00519-e00524 (2024).

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Pseudomonas aeruginosaполимикробная биопленкатестирование антимикробных препаратовлечение меропенемомэкстракция РНКколониеобразующие единицыантивирулентная терапия
Модель агрегированной биопленки муковисцидоза для изучения экспрессии генов, связанных с инфекцией
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.