Быстрый и простой рабочий процесс для количественной оценки внешних структур взрослой дрозофилы

Краткое содержание

В этой статье мы представляем быстрый, недорогой рабочий процесс визуализации глаз взрослых дрозофил с высоким разрешением для количественной оценки паттернов и дефектов роста. Мы описываем наш протокол подготовки образцов путем точечного монтажа, получения изображений с высоким разрешением и анализа изображений.

Аннотация

Сложный глаз дрозофилы представляет собой точно структурированную ткань, которая выявила молекулярные механизмы и биологические процессы, управляющие морфогенезом. Это простая структура повторяющихся единичных глаз, называемая омматидией, которая используется для характеристики генетических взаимодействий и функций генов. Мутации, влияющие на архитектуру глаза, могут быть легко обнаружены и проанализированы; Следовательно, эта система часто используется в учреждениях с ограниченными ресурсами. Дальнейший фенотипический анализ часто включает в себя сканирующий электронный микроскоп (СЭМ) для получения изображений с большим увеличением, пригодных для количественного анализа. Тем не менее, СЭМ дороги и требуют дорогостоящих реагентов; пробоподготовка занимает дни; И, зачастую, им нужен штатный персонал для подготовки образцов и обслуживания приборов. Это ограничивает их полезность в учреждениях с ограниченными ресурсами или во время жесткой бюджетной экономии. В энтомологии использование технологии цифровой визуализации с высоким разрешением является обычной практикой для идентификации и характеристики видов. В данной статье описывается метод, который сочетает в себе стратегии и позволяет получать цифровую визуализацию структур взрослых дрозофил с высоким разрешением и количественный анализ с использованием открытого программного обеспечения ImageJ. Рабочий процесс представляет собой быструю и удобную для студентов альтернативу, которая устраняет ограничения недостаточно финансируемых и необеспеченных ресурсами исследовательских учреждений с помощью экономически эффективного и быстрого подхода к количественному фенотипическому анализу.

Введение

Drosophila melanogaster является мощным генетическим модельным организмом, который десятилетиями использовался для выяснения молекулярных сигнальных путей и клеточного поведения. Многие из эволюционно консервативных сигнальных путей, которые необходимы для многоклеточного развития, были впервые идентифицированы, а механизм их действия определен у дрозофилы. Около 65-75% всех генов, ассоциированных с заболеванием человека, имеют ортологи у дрозофил ^1,2. Глаз взрослой дрозофилы является важной моделью, которая позволила провести беспристрастный генетический скрининг, способствовавший открытию важных консервативных генов, вовлеченных в заболевания человека, включая рак ^3,4,^{нейродегенерацию} 5 и метаболические^{расстройства.}

Глаз дрозофилы состоит из ~800 единичных глаз, называемых омматидиями, которые точно расположены в гексагональном узоре по всей^{поверхности глаза} взрослого человека. Каждый омматидий состоит из восьми фоторецепторных нейронов, которые занимают определенное место в асимметричной трапеции. Они поддерживаются четырьмя ненейральными колбочками и двумя первичными пигментными клетками, которые выделяют хрусталик и псевдоколбочку для фокусировки света на светочувствительные рабдомеры фоторецепторных нейронов. Соседние омматидии разделены одним рядом интеромматидиальных решетчатых клеток, состоящих из вторичных пигментных клеток, третичных пигментных клеток и механосенсорных щетинных комплексов ^8,9,10.

Нарушения в развитии глаз у взрослых людей проявляются в виде увеличения или уменьшения размера глаз, аномального количества или структуры хрусталиков или щетины, или в виде «шершавого глаза», при котором обычно инвариантный гексагональный узор нарушается таким образом, что ряд омматидий больше не может быть прослежен по поверхности глаза. Эти фенотипы могут быть оценены на уровне валовой ткани с помощью препарирующих микроскопов. Детальный анализ фенотипов традиционно включает в себя сканирующую электронную микроскопию с последующим количественным анализом изображений¹¹. Тем не менее, сканирующая электронная микроскопия требует дорогостоящих инструментов, дорогостоящих реагентов, подготовки образцов, которая занимает несколько дней, и часто для обслуживания штатного персонала.

Рисунок 1: Рабочий процесс визуализации структур взрослой дрозофилы . (А) Соберите и закрепите взрослых дрозофил в 70% этаноле. (B) Подготовьте образцы для визуализации путем точечного монтажа и крепления к штифтам. (C) Получение изображений с высоким разрешением с помощью фокус-стекинга и интеграции. (D) Количественная оценка изображений с использованием ФИДЖИ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

В этой статье представлен рабочий процесс, который относительно недорогой, имеет короткое время подготовки образца, может быть легко установлен на 3-футовом лабораторном столе, не требует опасных материалов и может стать долгоживущим дополнением к исследовательским лабораториям дрозофил (Рисунок 1). Точечный монтаж — это энтомологический метод, используемый для сушки на воздухе и сохранения мелких мягкотелых насекомых, таких как дрозофила¹². Этот метод основан на сочетании объективов микроскопа с цифровыми зеркальными камерами высокого разрешения для эффективного увеличения от 10x до 1000x. Ограниченная глубина резкости, присущая макрофотографии, преодолевается с помощью фокусного стекинга: сшивания серии изображений с фокальной плоскостью, проходящей через интересующий образец¹³. Этот метод дает изображения с высоким разрешением, пригодные для количественной оценки фенотипов, и может быть легко адаптирован для других представляющих интерес структур, таких как крыло, нога, грудная клетка и брюшная полость. Для анализа изображений используется бесплатная программа анализа изображений FIJI (NIH ImageJ). Эта методология делает подготовку образцов, визуализацию и анализ с высоким разрешением доступными для студентов бакалавриата и ученых в учреждениях с ограниченными ресурсами.

Протокол

1. Сбор и фиксация взрослых дрозофил

1. Установите скрещивание дрозофил или выберите штаммы и поместите их во флаконы с кормом для мух. Инкубируйте флаконы при желаемой температуре (обычно 25 °C) до тех пор, пока мухи не разовьются, а взрослые особи не приблизятся (~10-14 дней при 25 °C).
2. Обезболите мух CO₂ и поместите их на подушечку CO₂ .
3. Отсортируйте мух по перышку и выберите особей с желаемым фенотипом (например, с прямыми крыльями). Сделайте сортировщик перьевых мух, обрезав гусиное перо так, чтобы оно поместилось на коническом конце серологической пипетки объемом 1 мл.
4. Приготовьте микроцентрифужную пробирку объемом 1,7 мл с 1 мл 70% этанола. Поместите выбранных мушек в микроцентрифужную пробирку и положите на лед. Храните микроцентрифужные пробирки при температуре 4 °C в течение ночи (Рисунок 2A).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не храните мух в этаноле более 24 часов. Длительное хранение мух в 70% этаноле приведет к потере пигмента глаз и тела.

2. Пробоподготовка методом точечного монтажа

ПРИМЕЧАНИЕ: Дрозофилы - это мягкотелые насекомые, которые становятся хрупкими и разрушаются при сушке на воздухе; Таким образом, этот протокол требует, чтобы образцы были сфотографированы в тот же день, когда они были смонтированы. Работайте небольшими группами по ~5 мушек за раз, чтобы предотвратить потерю пробы. Увеличивайте количество образцов в наборе в зависимости от эффективности. Образцы, которым требуется больше времени перед визуализацией, могут быть обезвожены за счет увеличения концентрации гексаметилдисилазана (HMDS)¹⁴.

1. Вырежьте небольшие треугольные точки (7,1 мм x 2,7 мм) из архивного картона весом 65 фунтов с помощью специализированного точечного дырокола. Подготовьте точки, согнув наконечник (самый узкий 25%) под углом 90° с помощью щипцов Dumont #5 с тонким наконечником (Рисунок 2B).
2. С помощью щипцов Dumont #5 с тонким наконечником удалите мух из микроцентрифужных пробирок (шаг 1.4). Аккуратно промокните мух безворсовой лабораторной салфеткой, чтобы удалить излишки этанола. Расположите каждую муху с левой стороны на карточке под микроскопом для препарирования.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Удалите мух из трубки, держась за анатомическую структуру, которая не является областью интереса - при визуализации головы мы держим образцы за крыло или ногу. Не держите образцы за брюшную полость, так как эта структура используется для приклеивания мушки к точке карты.
3. Приготовьте клей для кожи, доведя его консистенцию до нужной вязкости. Смешайте 1-2 капли клея для кожи с 1-2 каплями деионизированной (DI) воды и смешайте с помощью пипетки для переноса на карточке. Возьмите подготовленную картонную точку на широком конце щипцами и нанесите небольшое количество разбавленного клея на согнутый кончик острия, смочив его в смеси клея и воды (рисунок 2C).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Клей должен быть растекающимся, но не жидким.
4. Приложите согнутый кончик точки к передней стороне правой брюшной полости вокруг сегментов живота 2-3 (рисунок 2В). Прежде чем клей высохнет, внесите небольшие коррективы в ширинку так, чтобы передняя и задняя ось мушки была перпендикулярна изогнутому кончику острия.
5. Вставьте монтажный штифт No 3 в широкий конец точки для карты (Рисунок 2D) и закрепите его на блоке для прикалывания насекомых (Рисунок 2E). Пометьте каждый контакт или ряд контактов соответствующим генотипом.

Рисунок 2: Подготовка образцов. (A) Взрослые дрозофилы сортируются на основе фенотипических маркеров и собираются в помеченные микроцентрифужные пробирки, содержащие 70% этанола на льду. Мух хранят при температуре 4°C в течение ночи. (B) Бумажные точки для карт подготавливаются путем сгибания узкого конца на 90° от остальной части карты с помощью пары щипцов #5. (C) Мухи извлекаются из трубок и на короткое время дают высохнуть на воздухе. Клей для шкуры наносят на маленький, загнутый конец подготовленной картонной точки и приклеивают к взрослой мухе по 2-3 брюшных сегмента. (D) Образцы крепятся с идентификационной этикеткой на штифт из нержавеющей стали #3 из нержавеющей стали. (E) Закрепленные образцы хранятся на доске образца до тех пор, пока они не будут готовы к получению изображения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

3. Получение изображений с высоким разрешением с фокусным стекированием

1. Получайте фотографии глаз мух с высоким разрешением с помощью собранной и настроенной системы визуализации с фокусным стекированием, собранной и настроенной.
   1. Снимайте фотографии с помощью корпуса цифровой зеркальной камеры с телеобъективом 70–200 мм, подключенным к объективу 20-кратного микроскопа Apo с помощью адаптера для объектива 77 мм.
   2. Следите за тем, чтобы образец освещался вспышкой через рассеиватель (рис. 3).
   3. Управляйте позиционированием по оси Z с помощью контроллера Stackshot и Macro Rail.
   4. Подключите камеру, вспышку и моторизованную сцену к сверхпрочному штативу из анодированного алюминия.
2. Расположите каждый точечный образец на универсальном сценическом подвесе так, чтобы голова была направлена так, чтобы глаз был обращен к линзе. Отрегулируйте положение головы, осторожно перемещая голову с помощью щипцов.
   ВНИМАНИЕ: Большие и быстрые регулировки могут привести к случайному обезглавливанию.
3. Когда камера подключена к ноутбуку, отрегулируйте параметры съемки в программном обеспечении. Фотографируйте образцы с 20-кратным увеличением со следующими настройками: мощность вспышки 1/32, выдержка 1/200, диафрагма F2.8 и ISO 400. Убедитесь, что все функции автофокусировки и стабилизации изображения отключены.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эти настройки уравновешивают оптимальную освещенность вспышки, выдержку и глубину резкости. Их нужно будет настроить для других увеличений и/или комбинаций линз.
4. Задайте место для сохранения полученной стопки изображений (10-50 изображений) в нужную папку с файлами. Убедитесь, что объем хранилища достаточен для изображений (~8,5 МБ на изображение).
5. Отрегулируйте параметры стека фокусировки на блоке управления Stackshot в режиме «Автоматическое расстояние ».
   1. Установите размер шага на 5 μм и рассчитайте количество шагов, установив начальное и конечное положения стека фокусировки.
   2. Просмотрите образец в режиме LiveView и с помощью фотокамеры в режиме автоматической съемки, чтобы определить начальное и конечное положения.
   3. Переместите рельс так, чтобы ближайшая часть образца оказалась в фокусе (установите начальное положение), затем переместите туда, где в фокусе находится самый дальний интересующий объект (установите конечное положение).
6. Вернитесь в режим ручной съемки и начните получение изображения с блока управления Stackshot.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Время получения изображения зависит от размера образца. Чем больше глубина резкости, необходимая для больших образцов, тем больше срезов включается в стек изображений, что продлевает общее время съемки.
7. Откройте файлы в указанном программном обеспечении для совмещения фокуса. Сгенерируйте сложенное изображение, нажав «Сложить» | Align & Stack All (PMax).
8. Сохраните итоговое изображение на жестком диске компьютера в виде файла .tif, нажав Файл | Сохраните выходное изображение.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от разрешения файла образа и количества отображаемых образцов для резервного копирования образа могут потребоваться внешние жесткие диски большого размера (1 ТБ). В этом протоколе размер стековых образов составляет примерно 100 МБ каждый до сжатия.

Рисунок 3: Получение изображений. (A) Устройство обработки изображений с частями со следующей маркировкой: a) Корпус цифровой зеркальной камеры; б) телеобъектив; в) 20-кратный объектив и адаптер для микроскопа Apo; г) Вспышка; д) линзовые и купольные рассеиватели; f) Stackshot Controller, Macro Rail и Rotary Stage; ж) Универсальный сценический кардан; з) Штатив. (B) Аппарат визуализации с установленным рассеивателем света. (C) Крупный план установленного образца в положении для визуализации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

4. Рабочий процесс анализа FIJI для расчета площади глаз взрослого человека

1. Для анализа изображений можно приобрести программное обеспечение FIJI¹⁵ на веб-сайте ImageJ.net.
2. Выбирайте изображения для анализа, на которых глаз центрирован и выровнен с достаточным освещением и минимальным размытием по периферии, что указывает на правильное выравнивание по камере.
3. Откалибруйте шкалу изображения.
   1. Загрузите изображение масштабной линейки для 20-кратного увеличения, которое коррелирует с 500 мкм. В качестве альтернативы, во время получения изображения, фотографируйте линейку с теми же настройками. Откройте изображение в программе FIJI.
   2. Измерьте длину масштабной линейки (рис. 4A). Используйте инструмент Прямая линия (Straight Line Tool ), чтобы точно обвести линию. Нажмите «Анализировать» | Измерьте. Это расстояние в пикселях эквивалентно 500 мкм (рис. 4B).
   3. Рассчитайте пиксели на микрон. Используйте его для преобразования измерений в пикселях в микрометрические измерения.
4. Откройте файл изображения в стеке в FIJI (Рисунок 4C).
5. Выберите «Лупа» на панели инструментов, чтобы увеличить область фокусировки. Постарайтесь заполнить экран глазом и непосредственной кутикулой вокруг головы (Рисунок 4D).
6. Выберите инструмент «Выбор от руки » на панели инструментов. Очертите область сетчатки как можно точнее, следуя контурам самого дальнего ряда омматидий (рисунок 4E). Чтобы удалить часть выделенной области, удерживайте нажатой кнопку выбора и выберите пиксели для удаления. Чтобы добавить к выделению, удерживайте нажатыми кнопки Option и Shift и выберите пиксели для добавления.
7. Чтобы рассчитать площадь, выберите Анализ | Измерьте в верхнем меню (рис. 4F). Появится новое окно с параметрами площади, среднего, минимума и максимума . Скопируйте и вставьте эти данные в электронную таблицу для документирования и преобразования из пикселей в микрометрические измерения.
8. Выполняйте соответствующий статистический анализ.

Рисунок 4: Анализ изображения на Фиджи. (A) Масштабирование исходного изображения. Загрузите калибровочное изображение и измерьте длину стержня 500 мкм. (B) Отрегулируйте масштабирование с помощью функции «Установить масштаб ». (C) Откройте сложенное изображение. (D) Увеличьте изображение так, чтобы глаз был центрирован и почти на весь экран. (E) С помощью инструмента «Выделение от руки » обведите контуром глаз на границе между крайним рядом омматидий и окружающей кутикулой. (F) Измерьте площадь в пределах выбранной области, рассчитанную нажатием кнопки Анализ | Мера | Площадь. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Результаты

Глаз дрозофилы является отличной модельной системой для изучения структуры тканей, контроля роста и гибели клеток. Недавно мы опубликовали исследование, в котором изучалось, как внутриклеточный pH (pHi) влияет на рост тканей. Во-первых, мы создали генетическую систему, в которой сверхэкспрессия натрий-протонного обменника DNhe2 (ортолог NHE1 у млекопитающих) в развивающемся глазу вызывает дефекты паттернинга и повышенную пролиферацию. Повышенная пролиферация с более высоким pHi наблюдается у всех видов от дрожжей до млекопитающих¹⁷. Тем не менее, мы также заметили, что при повышенном pHi взрослый глаз казался меньше по размеру по сравнению с контрольной группой.

Был проведен количественный анализ области глаз взрослого человека, чтобы определить, как повышенная экспрессия DNhe2 уменьшает размер тканей в глазу дрозофилы . Сначала мы получили изображения с низким разрешением с помощью окулярного микроскопа (рис. 5A), но их качество было недостаточным для выполнения количественных измерений. В частности, края глаза не находятся в фокусе, что препятствует точному измерению области глаза.

Мы измерили площадь каждого глаза на изображениях глаз взрослой дрозофилы с высоким разрешением (рис. 5B). GMR>DNhe2-экспрессирующие мухи имели значительно меньшие глаза (в среднем 74,28^мкм2), чем генетический контроль w¹¹¹⁸ мух (в среднем 125,83^мкм2) или контрольный GMRGAL4 водителя гетерозиготных мух (в среднем 142,49^мкм2), что представляет собой уменьшение площади на 41% и 48% соответственно (рис. 5C). Это уменьшение размера глаз, несмотря на повышенную пролиферацию, может быть связано с повышенным уровнем гибели клеток.

Известные гены аутофагии, в том числе Atg1, который индуцирует образование фагофоров, были использованы в исследованиях генетического взаимодействия (рис. 5). Влияние на размер глаз взрослого человека было количественно оценено с помощью фотографии с высоким разрешением и анализа местности (рис. 5B). Размер глаз был восстановлен (129,9^мкм2 против 74,28^мкм2) у гетерозиготных по Atg1³ мух GMR>DNhe2 по сравнению с GMR>DNhe2 и был аналогичен контрольной группе (рис. 5C). В сочетании с анализом молекулярных маркеров наши результаты подтверждают повышенную гибель аутофагических клеток при более высоком pHi.

Рисунок 5: Спасение уменьшенного размера сетчатки связано с повышением внутриклеточного pH с уменьшением аутофагии. (A) Изображения глаз взрослой мухи с низким разрешением, сделанные с помощью окулярного микроскопа. (B) Изображения глаз взрослых мух с высоким разрешением, используемые для количественной оценки размера глаз для следующих генотипов: w¹¹¹⁸; GMRGAL4; GMR>DNhe2; GMRGAL4; АТГ1³; GMR>DNhe2; АТГ1³. (C) Средние измеренные размеры глаз взрослого человека составили: w¹¹¹⁸ (125,83 μm², N = 7); GMRGAL4 (142,49^мкм2, N = 9) и GMR>DNhe2 (74,28^мкм2, N = 6), GMRGAL4; Атг1³ (146,4 мкм2, N = 15); GMR>DNhe2; Atg1³ (129,9 мкм2, N = 19) и обозначается показом медианных значений с межквартильными диапазонами. Статистическую значимость определяли по непарным t-критериям с поправкой Уэлча. Данные в В и С были ранее опубликованы¹⁸. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Наши выводы подкрепляются пробоподготовкой, визуализацией с высоким разрешением и описанным здесь анализом. Эти методы позволили точно и количественно описать размеры глаз взрослой дрозофилы с различными генотипами. Мы продолжаем использовать этот подход для оценки других генетических взаимодействий, которые прояснят механизмы рН-зависимого контроля роста.

Обсуждение

Здесь мы опишем метод подготовки образцов, визуализации с высоким разрешением и анализа структур взрослых дрозофил. Глаз дрозофилы представляет собой генетически управляемую модельную систему, которая позволила получить важнейшее представление о молекулярных механизмах, лежащих в основе таких заболеваний, как рак¹⁹, нейродегенерация²⁰ и метаболические заболевания²¹. В частности, генерируются «аватары» онкологических больных, в которых генерируются трансгенные дрозофилы , несущие онкогенные мутации, и которые могут быть использованы для высокопроизводительного скрининга лекарств²². Несмотря на то, что мы фокусируемся на взрослом глазе, этот протокол может быть адаптирован для анализа других представляющих интерес структур, таких как крыло, нога, грудная клетка и брюшная полость.

Мелкая моторика требуется на нескольких критических этапах этого протокола. Пробоподготовка взрослой дрозофилы методом точечного монтажа требует терпения и практики. Новичкам мы советуем попрактиковаться в точечном монтаже перед подготовкой редких или ценных образцов. Есть несколько важных шагов, которые потребуют практики мелкой моторики и тщательного внимания.

Первыми критическими шагами в протоколе являются подготовка точек карты и нанесение клея для приклеивания точки карты к животу (шаг протокола 2.4-2.5). Важно наносить ровно столько клея, сколько нужно, потому что целевые анатомические структуры (т.е. голова) могут быть покрыты клеем, если нанести слишком много или иметь неправильную консистенцию. Образец также должен быть приклеен в соответствующем положении так, чтобы передняя и задняя ось была перпендикулярна монтажному штифту. Вторым важным шагом является позиционирование головки для визуализации с высоким разрешением (протокол шаг 3.2). Очень важно, чтобы голова была ориентирована так, чтобы глаз был обращен к объективу камеры. Для корректировки головы небольшие корректировки производятся с помощью щипцов. Мягкие и постепенные движения имеют решающее значение, так как случайное обезглавливание может произойти при больших или сильных регулировках. Еще одним шагом, на котором требуется мелкая моторика, является использование инструмента «Выбор от руки» на панели инструментов FIJI (шаг протокола 4.6). Здесь очень важно проследить как можно ближе к внешнему ряду омматидии глаза. Такая точность является ключом к точным и воспроизводимым измерениям площади глаза (Рисунок 4E).

Методы визуализации, такие как сканирующая электронная микроскопия (СЭМ), остаются основным подходом к визуализации и анализу внешних структур. Тем не менее, протоколы SEM требуют, чтобы пользователь работал с опасными химическими веществами и работал с несколькими инструментами, включая сушилки для критических точек, аппараты для нанесения покрытий методом распыления и сам SEM. Подготовка образца занимает несколько дней и требует интенсивной подготовки и навыков. Серьезной проблемой, с которой сталкиваются академические учреждения, являются финансовые вложения и обязательства по обслуживанию инструмента, и, по нашему опыту, персонал, обладающий опытом в обслуживании и эксплуатации этого оборудования, как правило, не поддерживается на институциональном уровне. Наш протокол снижает затраты и устраняет воздействие опасных химических веществ за счет визуализации с более низким разрешением по сравнению с SEM.

Система, описанная в этом исследовании, представляла собой предварительно собранный корпус, но ее модульная структура позволяет снизить стоимость за счет замены отдельных компонентов оборудованием собственного производства (например, ступенями для образцов, рассеивателями вспышки), альтернативными брендами или моделями или оборудованием, которое уже может присутствовать в лаборатории. В то время как подключение объективов микроскопа к макрокамерам становится все более популярным среди любителей и профессиональных фотографов, для различных комбинаций объективов и объективов может потребоваться некоторое количество проб и ошибок. Чтобы воспроизвести описанную здесь систему, объектив микроскопа с коррекцией на бесконечность должен быть соединен с тубусной линзой (в данном случае телеобъективом) с помощью адаптера с соответствующей резьбой. Еще одним фактором при замене компонентов является обеспечение совместимости рабочего расстояния объектива с размерами крепления камеры, крепления образца и планки макрофокусировки. Наконец, выбранное здесь программное обеспечение для фокус-стекинга является коммерческим, но существует множество недорогих или бесплатных решений для постобработки фокус-стекинга, включая плагины ImageJ.

Хотя этот протокол требует практики для освоения методов работы с образцами, он предназначен для получения и анализа изображений с высоким разрешением для детального фенотипического анализа. Представленные здесь процедуры представляют собой быструю и недорогую альтернативу традиционным методологиям визуализации. Благодаря использованию бесплатных методов цифровой визуализации для количественного анализа наша методология доступна и не требует дорогостоящих покупок программного обеспечения или обновлений. Установка для визуализации требует некоторых затрат и усилий, но как только она будет создана, она должна стать долгоживущим дополнением к лабораториям дрозофилы . Этот метод дает изображения с высоким разрешением, пригодные для количественной оценки фенотипов, и может быть легко адаптирован для других представляющих интерес структур, таких как крыло, нога, грудная клетка и брюшная полость. Эта методология делает подготовку образцов, визуализацию и анализ с высоким разрешением доступными для студентов бакалавриата и ученых в учреждениях с ограниченными ресурсами.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
1 мл серологическая пипетка	ThermoFisher Scientific	170353N
1,7 мл микроцентрифужные пробирки	Genesee Scientific	24-282LR
20x Микроскоп Apo объектив	Mitutoyo Corp.	378-804-3
Архивный картон 65 фунтов	Нина, Инк.	91901
Canon EF 70-200 мм USM II телеобъектив	Canon	3044C002
Canon EOS 6D Mark II корпус цифровой зеркальной камеры	Canon	1897C002
диффузор купольный	макроскопические решения	Диффузор PA-DIF-GIM-SM
для Mitutoyo M Plan APO Цели	Макроскопические решения	митутойо-диффузоры
<эм>дрозофила флаконы и пробки	Genesee Scientific	32-117BF
Dumont #5 щипцы с тонким наконечником	Fisher Scientific	NC9889584
гусиные перья	Amazon	B01CMMJI6U
сверхмощный анодированный алюминиевый штатив	действительно правильные вещи, LLC	TFA-32G
Kimwipes	Fisher Scientific	06-666A	безворсовая лабораторная ткань
Levenhuk M1000 Plus цифровая камера	Levenhuk	70358
No. 3 монтажный штифт	Indigo Instruments	33414-3
Nutri-Fly Bloomington Drosophila media	Genesee Scientific	66-113	корм для мух
Point-Punch	M.C. Mieth Manufacturing, Inc.	448Детальный
зажим с винтовой ручкой	Really Right Stuff, LLC	SK-Clamp	Для крепления макрорельса к штативу
Stackshot Controller и Macro Rail	Cognisys Inc.
Понижающий кольцевой адаптер	RAF Camera	763461174207	Lens адаптер для подключения объектива микроскопа к объективу фотоаппарата
Titebond Glue	Franklin	International 5013
Yongnuo YN-24-EX Macro Twin Lite Flash	Shenzhen Yongnuo Photographic Equipment Co.	YN-24EX
strong>Software
Canon EOS Utility (v. 3.16.1).	Программное обеспечение для сбора данных	Canon
Национальные институты здравоохранения		Фиджи	выпущено с открытым исходным кодом под лицензией GNU General Public License. FIJI Версия 2.14.0/1.54f
GraphPad Prism	Программное обеспечение GraphPad, Бостон, Массачусетс США		Prism Version 10.3.1
Zerene Stacker (v.1.04)	Zerene Systems, LLC		Программное обеспечение для стекирования Focus