Моделирование потребления алкоголя грызунами с использованием двухбутылкового питья в домашней клетке и микроструктурный анализ

Краткое содержание

Этот протокол описывает стандартную парадигму питья в домашней клетке с прерывистым доступом и двумя бутылками для моделирования потребления алкоголя у крыс. Кроме того, он содержит пошаговые инструкции по дополнению стандартного протокола системой обнаружения слизывания, которая позволяет проводить микроструктурный анализ поведения при употреблении алкоголя.

Аннотация

Выбор двух бутылок в домашней клетке - одна из наиболее широко используемых парадигм для изучения потребления этанола грызунами. В простейшей форме животным предоставляется доступ к двум бутылкам для питья, одна из которых содержит обычную воду из-под крана, а другая — этанол, при этом ежедневное потребление измеряется изменением веса бутылки в течение 24 часов. Следовательно, такой подход не требует специализированного лабораторного оборудования. В то время как такая простота внедрения, вероятно, является наибольшим вкладом в его широкое внедрение исследователями доклинического алкоголя, разрешение данных об употреблении алкоголя, полученных с помощью этого подхода, ограничено количеством измерений веса бутылки (например, один раз в день). Тем не менее, желание изучить модели употребления алкоголя в контексте общего потребления, фармакологических вмешательств и нейронных манипуляций подтолкнуло к разработке домашних систем обнаружения облизывания клеток, которые могут получать данные на уровне отдельных облизываний. Несмотря на то, что некоторые из этих систем были разработаны недавно, система с открытым исходным кодом LIQ HD (Lick Instance Quantifier Home cage Device) привлекла значительное внимание в этой области благодаря своей доступности и удобству для пользователя. Несмотря на то, что эта система является захватывающей, она была разработана для использования на мышах. Здесь мы рассмотрим соответствующие процедуры для стандартного и оснащенного ликомометром питья в домашней клетке с двумя бутылками. Мы также представляем методы адаптации системы LIQ HD к крысам, включая аппаратные модификации для размещения большего размера клетки и переработанный держатель для бутылок, напечатанный на 3D-принтере, совместимый со стандартными готовыми бутылками для питья. Используя этот подход, исследователи могут изучать ежедневные модели употребления алкоголя в дополнение к уровням потребления у многих крыс параллельно, тем самым увеличивая разрешение полученных данных с минимальными вложениями дополнительных ресурсов. Эти методы предоставляют исследователям гибкость в использовании как стандартных бутылок, так и приборов, оснащенных ликемометром, для изучения нейробиологических механизмов, лежащих в основе употребления алкоголя, в зависимости от их точных экспериментальных потребностей.

Введение

Хотя умеренное употребление алкоголя исторически было связано с умеренной пользой для здоровья, недавние крупномасштабные всесторонние исследования показали, что никакое количество алкоголя не является безопасным1^,2. На самом деле, употребление алкоголя является^7-м ведущим фактором риска смерти и инвалидности во всем мире¹, при этом люди, которые пьют даже небольшое количество алкоголя, имеют повышенный риск рака, инфекционных заболеваний и травм^1,3. В Соединенных Штатах смертность от употребления алкоголя увеличилась почти на 30% в период с 2016 по 2021 год⁴. Важно отметить, что риск смерти и инвалидности монотонно увеличивается с увеличением потребления¹.

Хотя исследования на людях предоставили ценную информацию о нейробиологии употребления алкоголя и злоупотребления им, экспериментальный контроль, обеспечиваемый животными моделями, имеет решающее значение для глубокого понимания механизмов, лежащих в основе употребления алкоголя и риска злоупотребления алкоголем. Эти модели также являются ценными инструментами для разработки методов лечения, направленных на сокращение неконтролируемого потребления. Употребление алкоголя в домашней клетке с двумя бутылками на выбор является одной из наиболее широко используемых доклинических парадигм для изучения потребления алкоголя у грызунов. В значительной степени это связано с простотой его реализации, поскольку он позволяет измерять общее добровольное употребление алкоголя и предпочтения без необходимости использования специализированного исследовательского оборудования или сложных анализов. Используя этот подход, исследователи могут собирать измерения через желаемые промежутки времени (например, часы, дни, недели), вычисляя изменение веса бутылки от начала до конца сеанса питья. Вариации этого базового метода использовались многими специалистами в этой области для облегчения низкого и умеренного уровня потребления алкоголя в течение как коротких, так и длительных периодов времени. Например, непрерывные и прерывистые процедуры выбора двух бутылок были использованы для облегчения низкого и умеренного уровня потребления алкоголя, соответственно, как в классе mice5, так и в классе rats6^,7,8. Те же парадигмы могут способствовать высокому уровню потребления сортов, предпочитающих алкоголь^7,9. В качестве альтернативы, было показано, что адаптация этого метода, которая ограничивает доступ к алкоголю до 2-4 часов в день, начиная примерно через 3 часа после начала темного цикла, приводит к пьянству у мышей (т.е. Употребление алкоголя в темноте)^10,11. Дополнительные вариации этих методов были использованы в сочетании с методами, облегчающими алкогольную зависимость (т.е. хроническое прерывистое воздействие паров этанола) для изучения эскалации добровольного употребления алкоголя во время абстиненции^{12,13,14,15,16,17,18,19}.

Несмотря на широкое распространение в этой области, стандартный подход к измерению потребления алкоголя по изменению веса бутылки ограничен общим потреблением за сеанс выпивки. Следовательно, этот подход не может охватить модели употребления алкоголя, которые, как хорошо известно, влияют как на риск, так и на тяжесть расстройства, связанного с употреблением алкоголя (AUD)^20,21,22. Действительно, среднее потребление алкоголя человеком с течением времени может быть следствием нескольких эпизодов чрезмерного употребления алкоголя или многих эпизодов употребления алкоголя, каждый из которых связан с относительно низким потреблением, и эти нюансы остаются незамеченными, когда потребление измеряется как общее потребление за сеанс употребления алкоголя. Важно отметить, что значительно больше эпизодов употребления алкоголя, связанных с большими приступами употребления алкоголя (т.е. глотанием), наблюдается у людей с AUD по сравнению со здоровыми контрольными группами²³, и данные у нечеловекообразных приматов свидетельствуют о том, что индивидуумы, которые устанавливают модель потребления алкоголя, включающую большие приступы употребления алкоголя на ранних этапах их истории употребления алкоголя, подвергаются значительному риску AUD²². Более того, эпизоды употребления алкоголя, которые включают в себя большие приступы употребления алкоголя, значительно увеличивают риск заболеваемости и смертности, независимо от AUD diagnosis²¹. В целом, эти данные привели к повышению интереса к изучению моделей употребления алкоголя в дополнение к уровням общего потребления в доклинических моделях и побудили к разработке ряда систем различной сложности, способных собирать данные о питье на уровне отдельных облизываний.

Среди первых была разработка двухбутылочной системы, оснащенной распознаванием облизывания фотолуча, предназначенной для использования у мышей²⁴. Впоследствии эта система была адаптирована отдельной группой для использования в классе rats25. В последующие годы вариации на эту тему использовались для разработки подобных систем, содержащихся в специальном жилье для грызунов²⁶, которые позволяют обнаруживать облизывание отдельных животных, содержащихся в социальном жилье^27,28, и которые фиксируют как кормление, так и питьевое поведение²⁹. Среди них LIQ HD (Lick Instance Quantifier Home cage Device)³⁰ привлек значительное внимание за то, что предложил систему для использования на мышах, которая соответствует простоте внедрения и доступности системы, разработанной Godnyuck et al.²⁴. Эта система использует емкостное зондирование для непосредственного обнаружения контакта между язычком и проводящей металлической трубкой, в отличие от косвенных измерений, таких как приближение или взаимодействие сиппера, которые обеспечиваются с помощью системы обнаружения фотолуча. Авторы предоставляют данные, демонстрирующие, что их емкостная сенсорная система обеспечивает значительно большую точность и чувствительность при обнаружении лизунов, обеспечивая более сильную корреляцию между числом лизунов и изменением веса бутылки, чем обнаружение фотолуча. Авторы также демонстрируют возможность использования этой системы в сочетании с парадигмой питья в домашней клетке с непрерывным доступом к выбору двух бутылок для захвата показателей микроструктуры потребления алкоголя в дополнение к показателям общего ежедневного потребления³⁰.

Здесь мы описываем процедуры для выбора двух бутылок алкоголя в домашней клетке с использованием стандартного подхода, а также методы, которые позволяют обнаруживать облизывание (Рисунок 1). Мы также представляем методы создания и реализации LIQ HDR - адаптацию LIQ HD³⁰ для использования на крысах, которая включает в себя аппаратные модификации для размещения больших размеров клеток и переработанный 3D-печатный держатель для бутылок, совместимый со стандартными готовыми бутылками. Эти методы предоставляют исследователям гибкость в использовании либо стандартного, либо оснащенного ликометром подхода в зависимости от их экспериментальных ресурсов и потребностей в сборе данных.

Ниже приведено описание необходимых материалов и пошаговые инструкции по фиксации домашнего питья в клетке с использованием процедуры выбора двух бутылок с прерывистым доступом, адаптированной из Simms et al.⁷. В ходе этой процедуры крысам предоставляется 24-часовой доступ к двум бутылкам для питья 7 дней в неделю. По понедельникам, средам и пятницам (MWF) крысы получают одну бутылку с водой (H₂O) и другую бутылку с этанолом (EtOH). Эти бутылки убираются по вторникам, четвергам и субботам (TRS) и заменяются двумя бутылками воды. Крысы пьют из одних и тех же двух бутылок воды по субботам и воскресеньям. Обратите внимание, что эти методы при желании могут быть легко скорректированы для альтернативных графиков доступа к этанолу (например, непрерывный, запойный и т. д.). Отдельные инструкции предусмотрены для стандартных подходов и подходов, оборудованных ликомометром.

Протокол

Все репрезентативные данные были получены с использованием взрослых крыс линии Long-Evans, содержавшихся по одной в клетке, с одобрения Институционального комитета по уходу и использованию животных Чикагского университета Иллинойса и в соответствии с Руководством NIH по уходу и использованию лабораторных животных. Индивидуальное содержание необходимо для точного мониторинга потребления жидкости каждым животным. Взрослые самцы (n = 38) и самки (n = 2) крыс Long-Evans в возрасте P50–80 дней на момент прибытия проходили период акклиматизации в виварии в течение одной недели до начала эксперимента. Крысы имели ad libitum свободный доступ к стандартному корму (Teklad 7912, Envigo) и воде, если не указано иное.

1. Подготовка перед экспериментом

1. Промаркируйте поилки как H₂O или EtOH. Затем присвойте каждой крысе уникальный идентификатор, пометив одну бутылку H₂O и одну бутылку EtOH для группы MWF и две бутылки H₂O для группы TRS.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве дополнительной меры можно использовать цветную изоленту разного цвета для идентификации бутылок с H₂O и EtOH, чтобы избежать возможных ошибок при замене бутылок.
2. За 1 день до начала эксперимента наполните бутылки H₂O питьевой водой. Приготовьте раствор EtOH, смешав EtOH чистотой 190 proof с питьевой водой (20% v/v) за 1 день до даты начала эксперимента.
   ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Критически важно использовать неденатурированный EtOH, так как денатурированный EtOH ядовит.
3. Подготовьте пустую клетку на той же полке, где находятся крысы, участвующие в эксперименте. Эта клетка будет использоваться для расчета объема пролитой жидкости.
4. При использовании оснастите клетки системой LIQ HDR (см. шаг 3, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6 и Дополнительный рисунок 1).
5. До начала исследования определите точное время суток для замены бутылок. Бутылки следует заменять в одно и то же время каждый день для получения точного измерения потребления за 24 h.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Предыдущие исследования показали, что грызуны проявляют наибольшую активность в потреблении в начале темной фазы цикла^10,31. Поэтому, чтобы зафиксировать потребление в этот период высокой активности (см. шаг 2.3.1 для фиксации типа «binge-like drinking»), рекомендуется проводить замену бутылок через 30-60 min после выключения света. Во время замены бутылок используйте красные лампы, чтобы обеспечить видимость без нарушения светового цикла.

2. Ежедневные процедуры и техническое обслуживание

1. В первый день эксперимента выполните следующие действия.
   1. Уберите стандартные поилки с водой из клеток.
   2. Дополнительно: крысы часто задевают верхнюю крышку клетки при поиске пищи, что может привести к проливанию жидкости, которое невозможно будет зафиксировать с помощью поддона для сбора проливов. Использование кормушек внутри клетки может решить эту проблему. Если вы используете кормушки, уберите корм с верхней крышки клетки, установите кормушку внутрь и наполните ее комбикормом. Убедитесь, что площадь пола, отведенная для крысы, по-прежнему соответствует институциональным нормам с учетом размера клетки и кормушки.
   3. Сообщите персоналу по уходу и содержанию животных, если это применимо, что исследователи будут самостоятельно предоставлять корм и воду на протяжении всего эксперимента.
   4. Смена клеток может повлиять на сбор данных. Проводите смену клеток одновременно с измерением массы тела. Исследователям, решившим таким образом действовать, следует соответствующим образом проинформировать персонал по уходу и содержанию животных.
2. В последующие дни следуйте процедурам, изложенным ниже.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Помните, что любое перемещение клеток и бутылок может привести к проливанию жидкости. Поэтому важно перемещать их осторожно и использовать те же методы установки и снятия бутылок с поддоном для сбора проливов, что и с клетками крыс.
   1. Войдите в помещение до времени замены бутылок, чтобы оставить достаточно времени для выполнения следующих шагов, и установите новые бутылки на клетки в соответствующее время начала сессии.
   2. Снимите фильтрующие крышки с клеток. Если сегодня день MWF (понедельник, среда, пятница), перейдите к шагу 2.2.3. Если день TRS (вторник, четверг, суббота), перейдите к шагу 2.2.4.
   3. По понедельникам, средам и пятницам (MWF) снимите бутылки TRS с верхней части клеток. Взвесьте бутылки MWF (одну с EtOH и одну с H₂O). Запишите начальный вес бутылок для сегодняшней сессии питья. При необходимости добавьте корм на верхнюю крышку клетки или в кормушки. В назначенное время начала сессии установите бутылки на верхнюю крышку клетки каждой крысы скотчем вверх, чтобы животные не грызли этикетки на бутылках.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно потребление воды для TRS не записывается и не сообщается, но исследователи могут по желанию собирать эти данные, определяя вес бутылок до и после сессии, как описано ниже в шагах 2.2.3 и 2.2.4. Сторону, с которой находится бутылка с EtOH, следует менять после каждой сессии питья, чтобы избежать развития возможного предпочтения стороны, что может непреднамеренно исказить данные о потреблении.
      1. Дополнительно: Предыдущие работы показали, что многие крысы демонстрируют «запойное» питье в начале сессии^8,32,3. Большинство исследователей, фиксирующих такое поведение, регистрируют потребление в течение первых 30-60 мин сессии питья. Чтобы получить данные о потреблении во время этого возможного эпизода, следуйте описанным ниже шагам.
      2. Запустите таймер после установки бутылок в последнюю клетку. Не заходите в помещение во время работы таймера.
      3. Вернитесь в помещение по сигналу таймера. Снимите бутылки с EtOH и H₂O и запишите их вес. Верните бутылки с EtOH и H₂O в клетки.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг не требуется для фиксации эпизодов «запойного» питья при использовании системы с датчиком лизаний.
   4. По вторникам, четвергам и субботам (TRS) снимите бутылки MWF с клеток в назначенное время окончания сессии, что соответствует 24 ч после времени начала. Взвесьте каждую бутылку и запишите конечный вес бутылок для сессии питья MWF. Измерьте и запишите массу тела каждой крысы. При необходимости добавьте корм на верхнюю крышку клетки или в кормушки. Установите бутылки с H₂O TRS на верхнюю крышку клетки каждой крысы скотчем вверх, чтобы животные не грызли этикетки на бутылках.
   5. Верните фильтрующие крышки на клетки и покиньте помещение для содержания животных.
      ПРИМЕЧАНИЕ: По желанию можно закрыть поилки бутылок с EtOH, чтобы предотвратить испарение. Если смена клеток осуществляется исследовательским персоналом, выделите 1 день в неделю во время выполнения обязанностей TRS для этой задачи. Пересадите каждую крысу в чистую клетку после измерения массы тела.
3. Мойте бутылки и обновляйте жидкости на регулярной еженедельной или двухнедельной основе в соответствии с процедурами учреждения по уходу и содержанию животных. Следите за тем, чтобы эти действия не прерывали сессии питья. Например, бутылки с H₂O TRS можно мыть и наполнять после их снятия в дни MWF. Аналогично, бутылки с H₂O и EtOH MWF можно мыть и наполнять после их снятия в дни TRS.

3. Регистрация облизывания в экспериментах с выбором между двумя бутылками

ПРИМЕЧАНИЕ: Исследователи, заинтересованные в получении данных о потреблении жидкости с высоким разрешением, могут модифицировать вышеописанную процедуру, добавив в бутылки систему регистрации слизывания. LIQ HD³⁰ представляет собой недорогую систему собственной сборки (DIY), которая позволяет собирать данные такого типа у мышей. Процедуры, описанные ниже, представляют модификации, необходимые для адаптации LIQ HD для использования у крыс (обозначаемой как LIQ HDR). Список всех коммерчески доступных и индивидуально напечатанных на 3D-принтере деталей, необходимых для создания одной системы регистрации слизывания, которая может собирать данные выбора между двумя бутылками для группы до 18 крыс, приведен в Таблице материалов. STL-файлы для 3D-печати и инструкции доступны на веб-сайте автора (www.ejgloverlab.com/3dprints).

1. Настройка блоков емкостных датчиков
   ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая система LIQ HDR состоит из трех блоков емкостных датчиков, которые совместно регистрируют данные о лизании из 36 бутылочек параллельно для 18 крыс, содержащихся поодиночке. Каждый блок датчиков состоит из одного дифференциального в...²плата разводки интерфейса связи и одна сенсорная панель с 12 емкостными датчиками, которая будет подключена к ликометрам из шести отдельных клеток с помощью шести пар 2-контактных кабелей, имеющих цветовую маркировку для каждого ликометра (Рисунок 2A).
   1. Соберите материалы, необходимые для сборки всех трех блоков емкостных датчиков, как показано в Рисунок 2B, а также необходимые инструменты для пайки.
   2. Для начала сборки сенсорного блока А наденьте на кабель с 2-контактным разъемом «ма» красную термоусадочную трубку длиной 7 дюймов, затем вставьте концы красного и черного проводов в контакты №0 и №1 на плате датчика (Рисунок 2C-1), и припаяйте на месте (Рисунок 2C-2). Убедитесь, что кабель расположен с передней стороны платы датчика, как показано на рисунке, чтобы клетки в виварии были расставлены в числовом порядке слева направо; это позволит избежать перехлеста кабелей и потенциального нарушения записи (см. шаг 3.6 и Рисунок 6).
   3. Изолируйте еще пять кабелей термоусадочными трубками разных цветов и припаяйте их к контактам с № 2 по 1, как показано на рисунке (Рисунок 2C-3). Убедитесь, что все красные провода припаяны к контактам с четными номерами, которые будут подключены ко всем флаконам с левой стороны, а все черные провода припаяны к контактам с нечетными номерами, которые будут подключены ко всем флаконам с правой стороны.
   4. Для защиты покройте паяные соединения горячим клеем со всех сторон (Рисунок 2C-4). Промаркируйте коннекторы в числовом порядке, присвоив каждому ликометру уникальный идентификатор (Рисунок 2C-4).
   5. Для сборки сенсорного блока A соедините сенсорную плату A с коммуникационным разветвителем EndPoint с помощью 4-контактного кабеля длиной 50 мм, а затем соедините EndPoint с выходом 3,3 В преобразователя уровней с 5 В на 3 В с помощью 4-контактного кабеля длиной 10 мм (Рисунок 2D-1). Несмотря на то, что и плата датчика, и плата разводки интерфейса связи имеют по два идентичных 4-контактных разъема, крайне важно убедиться, что схема подключения точно соответствует указанной (Рисунок 2D-1 и Рисунок 2F) для использования корпусов датчиков, напечатанных на 3D-принтере, и предлагаемой конфигурации вивария (см. этап 3.6 и Рисунок 6). Поместите сенсорный блок A внутрь напечатанного на 3D-принтере корпуса (Рисунок 2D-2). Осторожно закройте крышку, стараясь не передавить кабель преобразователя уровней (Рисунок 2D-3).
   6. Измените I²Адреса сенсорных плат B и C задаются путем припаивания перемычки от вывода ADDR к выводу 3Vo или SDA, как показано на (Рисунок 2E).
   7. Припаяйте шесть цветомаркированных кабелей с разъемами «ма» к сенсорным платам B и C в том же порядке, который использовался для платы A. Маркируйте каждый разъем соответствующим идентификационным номером ликометра. Подключите плату B к промежуточному узлу связи (MidPoint), а плату C — к конечному узлу (EndPoint) с помощью 4-контактных кабелей длиной 50 мм (Рисунок 2F).
   8. Поместите сенсорные блоки B и C в соответствующие напечатанные на 3D-принтере корпуса. Соедините все три сенсорных блока последовательно с помощью кабелей Ethernet, чтобы завершить установку датчиков (Рисунок 2G).
2. Настройка интерфейса микроконтроллера
   ПРИМЕЧАНИЕ: Интерфейс микроконтроллера LIQ HDR (Дополнительный рисунок 1А) совпадает с описанием для LIQ HD³⁰ с незначительными модификациями. В приведенных ниже процедурах представлен общий обзор этапов, необходимых для настройки интерфейса, с модификациями, описанными в пунктах 3.2.6 и 3.2.8. Для получения более детальных пошаговых инструкций исследователям рекомендуется обратиться к оригинальному протоколу и видеоуроку, размещенным на странице автора в GitHub.³⁰.
   1. Подготовьте материалы и инструменты для пайки, необходимые для сборки интерфейса микроконтроллера (Дополнительный рисунок 1B). На тыльной стороне сенсорного экрана (Дополнительный рисунок 1C-1), создайте перемычку из припоя между контактными площадками подсветки (Дополнительный рисунок 1C-2).
   2. На тыльной стороне платы расширения для регистрации данных перережьте дорожку перемычки контакта CS (Дополнительный рисунок 1D-1). На передней стороне регистратора данных припаяйте короткий соединительный провод от вывода CS к выводу №7 (Дополнительный рисунок 1D-2).
   3. Для установки соединительных колодок стекирования экранов сначала закрепите их на задней стороне экрана с сенсорным интерфейсом (Дополнительный рисунок 1E-1Установите регистратор данных поверх сенсорного экрана, зафиксируйте его лентой и припаяйте все контакты разъема к регистратору данных (Дополнительный рисунок 1E-2). Затем снимите сенсорный экран.
   4. Установите оставшийся 2x3 гребенчатый разъем на микроконтроллер (Дополнительный рисунок 1F-1), затем установите логгер данных поверх микроконтроллера, прежде чем припаивать контактные штыревые разъемы (Дополнительный рисунок 1F-2).
   5. Вставьте кнопочную батарею в регистратор данных (Дополнительный рисунок 1G-1). Установите сенсорный экран поверх регистратора данных (Дополнительный рисунок 1G-1). Вставьте карту microSD вместе с адаптером в регистратор данных (Дополнительная фигура 1G-2).
   6. Чтобы изготовить дополнительный заземляющий провод, отрежьте один штекерный разъем от соединительного провода и зачистите конец примерно на 1/4 дюйма (Дополнительная фигура 1H-1). Припаяйте отрезок зачищенного одножильного провода к перемычке и изолируйте место пайки термоусадочной трубкой (Дополнительный рисунок 1H-2).
   7. Подключите 4-контактные перемычки и дополнительный заземляющий провод к микроконтроллеру (черный — GND, красный — 5V, желтый — вывод №21, синий — вывод №20, Дополнительная фигура 1I-1). Зафиксируйте соединения с помощью горячего клея (Дополнительный рисунок 1I-2). При необходимости обмотайте соединительные провода термоусадочной трубкой (Дополнительный рисунок 1I-2).
   8. Поместите полностью собранный интерфейс микроконтроллера в напечатанный на 3D-принтере корпус, пропустив 4-контактные перемычки и заземляющий провод через отверстие в верхней части (Дополнительный рисунок 1J).
   9. Следуйте оригинальному протоколу установки программного обеспечения интерфейса микроконтроллера³⁰.
3. Сборка ликометров LIQ HDR
   ПРИМЕЧАНИЕ: Специально изготовленное изделие 3D-печати для фиксации флаконов предназначено для использования со стандартным флаконом для питья грызунов с диаметром поилки 8 мм (см. Таблица материалов Рисунок 3A). Этот держатель для флаконов может быть легко адаптирован для использования с аналогичными флаконами и капиллярными трубками (сипперами) с минимальными модификациями или вовсе без них.
   1. Соберите материалы, детали, распечатанные на 3D-принтере, и инструменты для пайки, необходимые для сборки одного ликометра, как показано в Рисунок 3BОбратите внимание, что каждая система LIQ HDR рассчитана максимум на 18 ликометров для 36 бутылок.
   2. Чтобы удлинить кабель с мужским разъемом, зачистите оба его конца на длину примерно 1/4 дюйма, а также концы черного и красного проводов удлинителя (Рисунок 3C-1).
   3. Припаяйте удлинительные провода к соединительному кабелю (Рисунок 3C-2) и изолируйте паяные соединения термоусадочной трубкой (Рисунок 3C-3). Покройте кабель с разъемом «па» термоусадочной трубкой, цвет которой соответствует цвету кабеля с разъемом «ма» на сенсорном блоке (Рисунок 3C-4).
   4. Для обеспечения соответствия схеме подключения платы датчиков (Рисунок 2), пропустите красный и черный провода через левый и правый внутренние кабельные каналы держателя флакона соответственно (Рисунок 3D-1).
   5. Припаяйте каждый провод к самому краю 1 ¾ медная токопроводящая лента шириной [X] дюйма (Рисунок 3D-2) и сложите медные ленты пополам (Рисунок 3D-3).
   6. Отклейте медную ленту и с помощью пинцета осторожно поместите ее внутрь кронштейна заборного устройства (Рисунок 3E-1) перед тем как плотно прикрепить его к внутренним стенкам кронштейна для заборного устройства (Рисунок 3E-2). Убедитесь, что сторона медной ленты, пригодная для пайки, приклеена к стенке ближе к средней линии держателя флакона, как показано (Рисунок 3E-2). Просуньте заборную трубку через кронштейн, чтобы плотно прижать ленту к стенке и заполнить кронштейн.
   7. Для укрепления стороны пайки медной ленты, которая обладает меньшей адгезией и склонна к отслаиванию, нанесите каплю горячего клея на место пайки (Рисунок 3E-3). Размажьте клей так, чтобы он покрывал как медную ленту, так и любые прилегающие открытые участки 3D-печатного изделия (Рисунок 3E-4).
   8. Проденьте кабель через внутренний канал кабельного протектора (Рисунок 3F). Обязательно выберите подходящий кабельный протектор (направленный влево или вправо) для каждого ликометра, чтобы использовать рекомендуемую конфигурацию вивария (см. шаг 3.6 и Рисунок 6)."ПРИМЕЧАНИЕ: Ликометры 5–6, 1–12 и 17–18, кабели которых в данной установке отмечены синим или фиолетовым цветом, требуют наличия кабельного протектора, направленного влево (Рисунок 4D-1), в то время как для всех остальных ликометров требуется кабельный протектор, направленный вправо (Рисунок 4D-2).
   9. Для установки кабельного зажима сначала поместите один провод в паз одной половины зажима (Рисунок 3G-1), затем наденьте вторую половину на второй провод и плотно затяните обе половины с помощью гайки (Рисунок 3G-2).
   10. Пометьте мужской разъем соответствующим идентификационным номером ликометра (Рисунок 3H). Повторяйте эти действия до тех пор, пока не будут собраны все 18 ликометров.
4. Установка ликометров LIQ HDR
   ПРИМЕЧАНИЕ: LIQ HDR предназначен для установки на стандартную клетку для крыс типа «shoebox» с металлической проволочной верхней панелью (Рисунок 4A-1).
   1. Найдите на верхней части проволочного каркаса две пары стержней с расстоянием между центрами примерно 75 мм, чтобы обеспечить установку держателя для флаконов. С помощью плоскогубцев слегка раздвиньте металлические стержни вокруг отверстий для сиперов. Изолируйте эти стержни изолентой, чтобы предотвратить контакт металла с металлом между сиперами и верхней частью каркаса (Рисунок 4А-2).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя изолента недоступна для крыс и, следовательно, не подвержена разгрызанию, мы рекомендуем утилизировать ее по окончании исследования и не использовать повторно в следующих исследованиях.
   2. Установите ликометр и лазерную акриловую панель толщиной 1/8 дюйма на верхнюю часть клетки с помощью двух комплектов винтов и гаек M5 (Рисунок 4B). Убедитесь, что отверстия для грызунов (сипперы) на ликометре и акриловой панели совмещены и что сипперы не соприкасаются с какой-либо частью верхней части клетки.
   3. Закрепите зажим для кабеля на самом внешнем стержне (~4 мм в диаметре) верхней части проволочного каркаса (Рисунок 4C). При необходимости отрегулируйте зажим кабеля, чтобы верхняя часть клетки плотно прилегала к нижней и чтобы кабель не натягивался и не перегибался. Убедитесь, что для каждого ликометра используется соответствующий протектор кабеля (Рисунок 4D и см. шаг 3.8.8).
   4. Отрегулируйте трубки пробоотборника по мере необходимости таким образом, чтобы из колпачка выступало всего около 2 см трубки (Рисунок 4E-1). Для установки флаконов вставьте заборную трубку через держатель заборной трубки в держателе флаконов до упора (Рисунок 4E-2). Только самый кончик заборной трубки должен выступать за пределы акриловой панели (Рисунок 4E-3). Крайне важно, чтобы никакая другая часть трубки поилки не была открыта, чтобы избежать ложноположительных случаев слизывания, вызванных непищевым поведением, например, когда крыса касается трубки поилки или играет с ней. Крышка фильтра должна плотно прилегать к верхней части проволочной клетки и зажиму для кабеля, не смещая сам кабель (Рисунок 4F).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для полного огораживания сипперных трубок большей длины можно использовать более толкую акриловую панель или стопку из нескольких панелей толщиной 1/8 дюйма. Это необходимо для экспериментов, требующих более глубокого проникновения трубок в клетку, например, при измерении потребления воды молодыми крысами, которым может быть трудно дотянуться до короткого сиппера.
5. Установка и использование блокираторов системы забора проб (сипперов)
   ​ПРИМЕЧАНИЕ: блокиратор заборного устройства (Рисунок 5A...предназначено для того, чтобы ограничить доступ крысы к ниппелю во время замены бутылок и обеспечить точную калибровку ликкометра в начале каждого сеанса питья.
   1. Соберите детали, напечатанные на 3D-принтере, а также винт M5, гайку и шайбу для одного блокиратора заборного устройства (sipper blocker), как показано на Рисунок 5B.
   2. Вставьте SIPPER_Gear в SIPPER_Base (Рисунок 5C-1). Убедитесь, что шестерня SIPPER_Gear ориентирована точно так же, как показано на врезке с 3D-рендерингом. Вставьте червячный винт SIPPER_Worm в отверстие в верхней части основания SIPPER_Base. Поворачивайте винт по часовой стрелке во время вставки, пока головка не окажется вровень с основанием (Рисунок 5C-2).
   3. Прикрутите гайку SIPPER_Nut к концу червячного винта (Worm) со стороны основания (Base).Рисунок 5C-3). Используйте пинцет, чтобы затянуть гайку, поворачивая червячный диск. Вставьте круглые узкие шейки блоков SIPPER_Blockers в прорези шестерни (Рисунок 5C-4).
   4. Установите собранный блокиратор заборного устройства на верхнюю часть клетки с помощью комплекта винтов M5 (Рисунок 5D). Убедитесь, что оба блокиратора пробоотборника совпадают с отверстиями пробоотборника.
   5. Чтобы заблокировать доступ к заборным устройствам, поверните червячный диск по часовой стрелке, чтобы опустить блокираторы до полного перекрытия отверстий заборных устройств (Рисунок 5E).
   6. Чтобы обеспечить доступ к поилкам, поворачивайте диск против часовой стрелки до тех пор, пока блокираторы не окажутся в вертикальном положении перпендикулярно верхней части клетки (Рисунок 5F-1). Вручную поднимите каждый рычаг блокиратора до тех пор, пока головки не окажутся чуть ниже верхней части проволочного каркаса. Поверните блокираторы 90° таким образом, головки расположены параллельно металлическим стержням в верхней части клетки, а плечи зафиксированы (Рисунок 5F-2). Продолжайте поворачивать ручку против часовой стрелки до тех пор, пока оба блокиратора не поднимутся над верхней частью клетки (Рисунок 5F-3) и заборные трубки полностью доступны (Рисунок 5F-4).
6. Использование системы LIQ HDR в виварии
   ПРИМЕЧАНИЕ: Следующая конфигурация вивария оптимизирована для регистрации выбора одного из двух флаконов с водой с использованием одного интерфейса микроконтроллера, подключенного к 18 стандартным клеткам для крыс типа «shoebox». Все электронные компоненты, включая интерфейс микроконтроллера, сенсорные блоки и различные кабели, закреплены настенных металлических сетчатых полках, на которых расположены клетки (Рисунок 6A). Для адаптации к условиям вивария и потребностям пользователя могут потребоваться некоторые модификации.
   1. Закрепите каждый сенсорный блок на полках вивария с помощью специально изготовленного 3D-печатного крепежного винта (Рисунок 6B). Убедитесь, что каждый сенсорный блок установлен непосредственно под клеткой с ликометром желтого цвета, чтобы избежать излишнего натяжения кабеля (Рисунок 6A).
   2. Расположите и закрепите каждый кабель с разъемом «ма», следя за тем, чтобы они не перекрывали друг друга и не имели чрезмерных перегибов в местах пайки, так как это может привести к плохому детектированию лизания (Рисунок 6B). При использовании металлических стеллажей с перекладинами этого можно легко добиться, закрепив соединительные кабели стяжками к отдельным перекладинам полки, как показано на рисунке.
   3. Установите интерфейс микроконтроллера рядом с сенсорным блоком A, используя тот же напечатанный на 3D-принтере крепежный винт, и вставьте его 4-контактный разъем в порт ввода 5 В преобразователя уровней с 5 В на 3 В, подключенного к сенсорному блоку A (Рисунок 6C).
   4. С помощью изоленты закрепите дополнительный заземляющий провод к источнику заземления, например, к металлическому стеллажу (Рисунок 6D).
   5. Расположите каждую клетку в соответствии с цветом и идентификатором установленного ликометра согласно Рисунок 6A изображено таким образом, чтобы минимизировать перехлест и натяжение кабелей.
   6. Надежно подсоедините все штекерные разъемы кабелей ликометра к соответствующим гнездовым разъемам кабелей датчиков (Рисунок 6E). Подключите блок питания, чтобы включить интерфейс микроконтроллера (Рисунок 6F).
   7. На главной странице графического интерфейса пользователя (GUI) (Рисунок 6G), нажмите на Символ настройки для открытия страницы «Настройки». Пользователи могут изменять время включения и выключения освещения в соответствии с графиком вивария, чтобы дисплей интерфейса автоматически приглушался с началом темного цикла (Рисунок 6H-1).
   8. Кран Редактирование настроек датчика (Рисунок 6H-1) настроить порог касания (Touch Threshold) на 8 и порог отпускания (Release Threshold) на 2; по нашему опыту, такие параметры обеспечивают наиболее стабильное детектирование лизаний у крыс при использовании данной установки (Рисунок 6H-2). Однако следует отметить, что пользователям может потребоваться поэкспериментировать с различными настройками в случае внесения каких-либо изменений в текущую систему.
   9. Снять флажок Автокалибровка если данные собирались только в течение 24 часов или менее (Рисунок 6H-2).

4. Ежедневные процедуры для двухбутылочного выбора напитков в домашней клетке с использованием детекции облизывания

1. Следуйте этапам, описанным в шаге 2 для стандартных процедур двухбутылочного выбора, с учетом следующих модификаций.
2. По понедельникам, средам и пятницам, перед установкой бутылок для кормления в эти дни, используйте блокираторы поилок, чтобы закрыть отверстия поилок во всех клетках (см. шаг 3.5.5 и Рисунок 5E).
3. Перед началом записи выберите правильный Экспериментальная часть на главной странице графического интерфейса пользователя (GUI) будет указано, какой флакон с EtOH следует использовать в этот день (Рисунок 6G).
4. После установки всех флаконов с MWF нажмите Пожалуйста, предоставьте текст для перевода. на главной странице (Рисунок 6G) для начала калибровки датчиков, во время которой пользователям рекомендуется отойти от системы и убедиться, что крысы не слизывают воду из поилок (Рисунок 6I-1). Калибровка занимает несколько секунд, после чего система переходит на главную страницу записи, где отображается совокупное количество слизываний для каждого флакона каждого ликзометра (Рисунок 6I-2).
5. Поднимите все блокираторы поилок выше верхнего края клетки, чтобы обеспечить доступ к поилкам (см. шаг 3.5.6 и Рисунок 5F), и осторожно верните все крышки фильтров, как описано выше (см. этап 3.4.4 и Рисунок 4F).
6. Кран Обновить для обновления количества слизываний на экране, которое не обновляется в режиме реального времени автоматически (Рисунок 6I-2).
7. По вторникам, четвергам и субботам постукивайте Сохранить & Выход чтобы остановить запись и вернуться на главную страницу (Рисунок 6I-2) перед извлечением флаконов с MWF.
8. Для извлечения SD-карты с целью передачи данных нажмите Извлечь SD-карту перед извлечением SD-карты (Рисунок 6G). Вставьте SD-карту в любой компьютер и скопируйте/вставьте .csv-файл с данными, имеющий название в виде даты включения бутылки, на этот компьютер (Рисунок 6K). Чтобы повторно установить SD-карту для следующей записи, вставьте карту в интерфейс и нажмите Установка SD-карты (Рисунок 6J).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется ежедневно создавать резервные копии файлов данных.
9. Рекомендуется ограничить измерение массы тела одного разом в неделю, если это совместимо с моделью животного и протоколом использования животных, и проводить данную процедуру в день, назначенный для смены клеток, чтобы свести к миниму ненужное беспокойство ликометров и датчиков. Перед перемещением клеток отсоедините все штекеры ликометров от соответствующих разъемов датчиков. После взвешивания каждой крысы поместите ее в чистую клетку. Перенесите ликометр на верхнюю часть новой клетки и при необходимости снова подключите каждый ликометр к соответствующему датчику.
10. Для экспериментов по изучению влияния вмешательства (например, инъекции препарата) на потребление EtOH и микроструктуру питья по возможности планируйте такие вмешательства до начала сеанса питья. В случаях, когда это невозможно, исследователи могут приостановить детекцию лизаний, нажав на... Пауза (Рисунок 6I-2) и возобновите сбор данных, нажав Резюме после завершения вмешательства. Мы рекомендуем взвешивать флаконы во время каждого перерыва в сессии потребления напитка, чтобы зафиксировать изменения в потреблении EtOH до и после вмешательства, а также учесть возможный разлив жидкости при снятии верхней части клетки для доступа к животному.
11. По завершении исследования все компоненты клетки должны быть тщательно продезинфицированы перед использованием с новыми животными для ограничения передачи контаминантов между особями. Рекомендуется осторожно обработать ликометр 70%-м раствором EtOH с помощью распылителя и протирания, стараясь не повредить внутренние электрические компоненты. Блокиратор поилки и акриловую панель можно промыть в теплой мыльной воде.

5. Анализ данных

1. Перед оценкой зависимых переменных скорректируйте данные о потреблении с учетом утечки, которая неизбежно происходит при ежедневной замене флаконов. Для этого вычислите среднее изменение веса флаконов с EtOH и H₂O в контрольных клетках для утечки за весь период исследования.
2. Исключите любые значения, превышающие два стандартных отклонения от среднего для каждого флакона. После исключения этих выбросов вычтите полученные средние значения из изменений веса флаконов с EtOH и H₂O, зафиксированных в клетках с животными. Вычитая эту величину, исследователи могут быть уверены, что средняя потеря в результате утечки данного раствора не учитывается в показателях потребления. Вычитание среднего количества утечки может привести к отрицательному значению для некоторых животных в отдельные дни. Приведите такие значения к нулю и интерпретируйте их как отсутствие потребления данного раствора.
3. Основными зависимыми переменными в экспериментах с выбором из двух флаконов при питье являются потребление EtOH (г/кг) и предпочтение (%). Рассчитайте потребление на основе изменения веса флакона с EtOH (г) и нормируйте по массе тела (кг), выполнив следующие шаги:
   1. Переведите изменение веса флакона (г) в изменение объема (мл), используя следующее уравнение:
      
      Плотность чистого этанола составляет 0,789 г/мл. Таким образом, расчетная плотность 20% EtOH составляет 0,1578 г/мл. Плотность H₂O составляет 1 г/мл, следовательно, расчетная плотность 80% H₂O = 0,80 г/мл. Следовательно, каждый мл 20% раствора EtOH (v/v) состоит из 0,1578 (EtOH) + 0,80 (H₂O) = 0,9578 г/мл. Таким образом, окончательное уравнение при использовании концентрации 20% (v/v) EtOH выглядит следующим образом:
      
   2. Рассчитайте дозу потребленного этанола, используя уравнение ниже. Для расчета потребленного этанола в пересчете на массу тела животного используйте показатели массы тела, полученные на той же неделе, что и данные о потреблении.
      
   3. Рассчитайте предпочтение, используя следующее уравнение:
      
4. Подобно своему аналогу для мышей³⁰, система LIQ HDR фиксирует ряд переменных микроструктуры питья, включая продолжительность одного слизывания, количество эпизодов питья, продолжительность эпизода, количество слизываний за эпизод и общую продолжительность слизываний за эпизод (Рисунок 6K). Эпизод питья определяется как серия слизываний, которая начинается с как минимум 3 слизываний, совершенных менее чем за 1 сек, и заканчивается после того, как прошло 3 сек без дополнительных слизываний. Эти показатели затем могут быть использованы для расчета средней продолжительности одного слизывания, средней продолжительности одного эпизода, среднего количества слизываний за эпизод, средней частоты слизываний, расчетного интервала между слизываниями и расчетного интервала между эпизодами питья.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Интерфейс микроконтроллера предоставляет эти данные микроструктуры с разрешением 1 мин в файле .csv (Рисунок 6K). Исследователи могут использовать приложение для анализа, прилагаемое к оригинальному протоколу LIQ HD³⁰, или предпочитаемую платформу для постобработки данных, чтобы собрать и обобщить данные в соответствии с целями исследования. Данные микроструктуры обычно суммируются за весь 24-часовой период для сравнения усредненных различий на макроуровне или в интервалах от 30 мин до 1 ч для изучения вариаций паттернов питья в течение светового и темного циклов.

Результаты

Стандартные данные по потреблению EtOH при прерывистом двухбутылочном выборе в домашних клетках
Используя стандартную процедуру (Рисунок 7A), исследователи могут зафиксировать потребление за 24 ч (Рисунки 7B-D), а также эпизодическое потребление («бинж-дринкинг»), если взвешивание бутылок проводится вскоре после начала сессии питья (Рисунки 7E-F). Рассчитывая потребление этанола относительно потребления воды, исследователи также могут получить данные о предпочтении во всех измеренных временных точках (Рисунки 7D,F). Как показано на Рисунке 7C, у крыс часто наблюдается период эскалации потребления этанола в течение первых нескольких дней доступа к двум бутылкам. Затем следует плато, во время которого потребление остается относительно стабильным. Хотя этот паттерн неизменно наблюдается у самцов крыс^{7,32,3,34,35,36}, у самок он проявляется не всегда. Вместо этого в некоторых исследованиях сообщается о стабильных уровнях потребления этанола на протяжении всего периода исследования у самок крыс^37,38. Кроме того, некоторые данные свидетельствуют о том, что потребление этанола может дополнительно возрастать при более длительных периодах доступа^36,39. Ежедневное потребление может значительно варьироваться между особями. Тем не менее, средний показатель ежедневного потребления хорошо характеризуется для линий, наиболее часто используемых в исследованиях алкоголя, и может служить эталоном при анализе сгруппированных данных^{7,8,3,34,35,39}.

Как показано на Рисунке 7E, многие крысы потребляют значительную часть своей суточной дозы этанола вскоре после начала сеанса питья^8,3. Такой паттерн потребления этанола, напоминающий запойное пьянство, часто сопровождается выраженным предпочтением этанола перед водой (Рисунок 7F). Однако исследователям не следует удивляться, если предпочтение за 24 ч не превышает 50%. Это особенно характерно для аутбредных линий или линий грызунов, не проявляющих предпочтения к алкоголю, а также для исследований, ограниченных относительно короткими периодами доступа к двум бутылкам на выбор^7,32,3,35,37.

Валидация LIQ HDR для анализа микроструктуры потребления при двухбутылочном выборе
Добавление системы LIQ HDR к стандартной парадигме двухбутылочного выбора для крыс позволяет исследователям точно и прецизионно прогнозировать потребление, используя зарегистрированные данные о питье. Это подтверждается наличием сильной и значимой корреляции между кумулятивным количеством зарегистрированных лизков и изменением веса бутылок как с EtOH (R² = 0.7789, F_(1,13) = 398.1, p < 0.01), так и с H₂O (R² = 0.7910, F_(1,17) = 42.9, p < 0.01) в течение 24 ч (Рисунок 8A). Это также справедливо для дней, когда крысы получали две бутылки с H₂O (R² = 0.875, F_(1,18) = 1484, p < 0.01; Рисунок 8B).

LIQ HDR также позволяет проводить точный анализ паттернов потребления напитков с высоким временным разрешением, которое недоступно при использовании стандартной парадигмы выбора между двумя бутылками. Используя этот подход, исследователи получают возможность изучать различия в паттернах потребления разных растворов, в зависимости от светового цикла, пола, групп препаратов и других факторов. Для иллюстрации: группировка среднего количества лизков по 30-минутным интервалам позволяет легко анализировать средние паттерны потребления за 24 h. Как и ожидалось, этот анализ показывает значительно более высокий уровень потребления как EtOH, так и H₂O во время темного цикла, когда крысы бодрствуют, по сравнению со светлым циклом, когда крысы обычно спят (Рисунок 8C). Используя аналогичный подход, исследователи могут изучать групповые различия в паттернах потребления. Например, микроструктуру потребления у самцов и самок крыс можно сравнить, проанализировав среднее количество лизков EtOH (Рисунок 8D) или воды (Рисунок 8E) в течение 24 h. Чтобы изучить «фронтальное» потребление (front-loading) и/или потребление по типу «запоя» (binge-like drinking), исследователи могут повысить разрешение анализа, сосредоточившись на потреблении, происходящем вскоре после начала сессии, используя более короткое окно группировки для обобщения данных. Это позволяет исследователям изучать периоды запойного потребления без необходимости взвешивания бутылок несколько раз в течение 24 h. Как показано на Рисунке 8C (вставка), этот анализ выявляет, что большая часть потребления, зафиксированная при взвешивании бутылки через 30 min после начала сессии, приходится на первые 5 min, а не распределяется на весь 30-минутный период. Такие данные могут помочь в определении оптимальных моментов времени для забора проб крови с целью измерения концентрации этанола в крови (BEC). Действительно, аналогичный паттерн фронтального потребления наблюдался в отдельный день потребления, в течение которого паттерны потребления с высоким разрешением фиксировались в период всего 15 min (Рисунок 8F). Среднее количество лизков, зарегистрированных во время этой сессии, достоверно предсказывало изменение веса бутылки (EtOH: R² = 0.6316, F_(1,10) = 17.15, p = 0.0020; H₂O: R² = 0.8601, F_(1,10) = 61.47, p < 0.001; Рисунок 8G). Более того, значения BEC в пробах крови, полученных через 15 min после начала сессии, хорошо коррелировали с количеством зарегистрированных лизков (R² = 0.4327, F_(1,10) = 7.627, p = 0.0201; Рисунок 8H) даже при относительно низких уровнях потребления EtOH.

LIQ HDR фиксирует различные показатели микроструктуры питья, которые регистрируются и рассчитываются в режиме реального времени во время сеансов питья и сохраняются в 1-минутных интервалах, аналогично детекции лизаний (Рисунок 6K). Эти показатели кратко описаны в шаге 5.4 и определены ранее³⁰. Исследователи могут проводить детальный анализ изменений в индивидуальной микроструктуре питья и изучать, каким образом и в какой степени паттерны питья влияют на различия в общем объеме потребления. Для иллюстрации: мы обнаружили, что хотя самцы и самки крыс демонстрировали схожее количество лизаний, эпизодов питья и продолжительность эпизодов (Рисунок 9A-C) при питье воды, это было связано с более высоким общим потреблением (г/кг) у самок по сравнению с самцами (t-критерий; t=2.82, df=10, p=0.0163; Рисунок 9D). Это ожидаемо, учитывая половой диморфизм в массе тела, который обеспечивает более высокие уровни потребления в пересчете на массу тела у самок, чем у самцов, при эквивалентном количестве лизаний. Примечательно, что это контрастирует со сравнением половых различий в паттернах микроструктуры для EtOH, которое выявило схожую микроструктуру питья, связанную с аналогичными уровнями потребления EtOH (Рисунки 9E-H). Эти данные позволяют предположить, что, в то время как объем одного лизания воды схож между полами, у самок крыс объем одного лизания EtOH меньше, чем у самцов. В совокупности эти микроструктурные данные подтверждают идею о том, что самцы и самки крыс, вероятно, различаются в стратегиях произвольного питья в зависимости от типа потребляемой жидкости в условиях домашней клетки. В предыдущих работах также сообщалось о половых различиях в стратегиях питья, зависящих от типа жидкости^40,41, хотя различия, наблюдавшиеся в тех исследованиях, не ограничивались только потреблением воды. Продолжительность истории питья может играть роль в различиях, наблюдаемых между исследованиями, поскольку в текущем наборе данных выбор из двух бутылок была ограничена 5 неделями, тогда как в предыдущих работах она превышала 12 недель^40,41.

Рисунок 1: Выбор между двумя бутылками с жидкостью в домашней клетке. (A) Исследователи могут измерять добровольное потребление этанола в домашней клетке и предпочтение (по сравнению с водой), используя стандартный подход, при котором потребление рассчитывается на основе изменения веса бутылки. (B) Используя LIQ HDR — недорогую самодельную систему детекции лизания в домашней клетке, разработанную для крыс, — исследователи могут получать те же показатели, что и при стандартной процедуре выбора из двух бутылок, одновременно фиксируя микроструктуру питья с высоким разрешением на протяжении всего периода записи. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Сборка блоков емкостных датчиков. (A) Электронные компоненты и схема соединений. (B) Материалы для сборки трех блоков емкостных датчиков, необходимых для создания одной системы LIQ HDR. (C) Припаяйте кабели с 2-контактными разъем-«ма» для клеток №1-6 к выводам №0-1 платы A и закрепите места пайки горячим клеем. Маркируйте кабели с помощью цветных термоусадочных трубок и присвойте каждому уникальный идентификационный номер ликометра. (D) Подключите плату A и преобразователь уровней с 5V на 3V к дифференциальному интерфейсу связи I²C EndPoint с помощью 4-контактных кабелей (1), затем поместите плату A и интерфейс связи в корпус, напечатанный на 3D-принтере (2-3). (E) Измените I²C-адреса плат B и C, припаяв перемычку от вывода ADDR к выводам 3Vo и SDA соответственно. (F) Припаяйте кабели с 2-контактными разъемами-«ма» к платам датчиков B и C, подпишите их соответствующими ID ликометров и подключите плату B к интерфейсу связи MidPoint, а плату C — к EndPoint с помощью 4-контактных кабелей. (G) Поместите блоки датчиков B и C в соответствующие корпуса, напечатанные на 3D-принтере, и последовательно соедините все три блока кабелями Ethernet. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Сборка ликкометра LIQ HDR. (A) 3D-визуализация компонентов, размещаемых внутри клетки. (B) Материалы для сборки одного двухбутылочного ликкометра. Обратите внимание, что одна система LIQ HDR рассчитана на 18 двухбутылочных ликкометров. (C) Удлините 2-контактный штекерный кабель с помощью пары черного и красного проводов, зафиксировав цветовую маркировку термоусадочными трубками. (D) Пропустите черный и красный провода через левое (L) и правое (R) отверстия в держателе бутылок (1) и припаяйте концы к медным лентам (2-3). (E) Прикрепите медные ленты к внутренним стенкам кронштейнов поильника (1-2) и закрепите их горячим клеем (3-4). (F) Пропустите кабель через защитный кожух. (G) Установите зажим для кабеля. (H) Промаркируйте разъем соответствующим идентификационным номером ликкометра. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Установка ликометра. (A) Используйте изоляционную ленту, чтобы изолировать металлические стержни вокруг отверстий для пилок на верхней крышке металлической клетки. (B) Установите ликометр и акриловую панель на крышку клетки с помощью двух комплектов винтов M5 и гаек. (C) Закрепите зажим для кабеля на самом крайнем стержне сетчатой крышки клетки. (D) Обязательно используйте соответствующий протектор кабеля (левый L или правый R) для каждой клетки. (E) Убедитесь, что из бутылочных поилок выступает всего ~2 cm (1), чтобы при установке бутылок на клетку (2) только самые кончики поилок выходили за пределы акриловой панели и были доступны крысам. (F) Верхняя часть фильтра должна прилегать к зажиму для кабеля, не задевая сам кабель. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 5: Установка и использование блокиратора поилок. (A) 3D-визуализация блокиратора поилок. (B) Специальные детали для одного блокиратора поилок, изготовленные с помощью 3D-печати. (C) Сборка напечатанных на 3D-принтере деталей. (D) Установка собранного блокиратора поилок на верхнюю часть клетки с помощью винта M5, гайки и шайбы. (E) Поворот диска по часовой стрелке для перекрытия доступа к поилкам. (F) Поворот диска против часовой стрелки для снятия блокираторов с поилок (1), поднятие блокираторов и поворот на 90° (2), а затем дальнейший поворот диска против часовой стрелки до тех пор, пока блокираторы не окажутся выше верхней части клетки (3-4). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 6Обустройство вивария и работа с графическим интерфейсом пользователя. (A) Рекомендуемая конфигурация вивария и схема электропроводки. (Б) Закрепите каждый сенсорный блок на стеллаже, после чего разложите и зафиксируйте кабели сенсоров на стеллаже. (C) Закрепите интерфейс микроконтроллера на стеллаже и соедините его 4-контактный перемыкатель с преобразователем уровней 5В–3В, подключенным к сенсорному блоку А. (D) Закрепите дополнительный провод заземления с помощью изоленты. (E) Подключите кабели датчиков к соответствующим кабелям ликометра. (F) Подключите блок питания, чтобы включить интерфейс микроконтроллера. (G) Главная страница графического пользовательского интерфейса (GUI). (H) Кран Настройки отрегулируйте время ВКЛЮЧЕНИЯ/ВЫКЛЮЧЕНИЯ освещения в соответствии с графиком освещения вивария (1) и коснитесь Настройки датчика для регулировки порогов прикосновения и отпускания у крыс (2). (I) Для записи данных выберите Боковая сторона флакона с EtOH на главной странице, кран Пожалуйста, предоставьте исходный текст для перевода. для калибровки датчиков (1) и начала записи (2). Нажмите Обновить чтобы обновить число слизываний, отображаемое на экране, и нажмите Сохранить & Выход для остановки записи. (J) Кран Извлеките SD-карту на главной странице, чтобы извлечь SD-карту и перенести данные. Нажмите Монтирование SD-карты после установки SD-карты. (K) Снимок экрана репрезентативный файл с необработанными данными, иллюстрирующий способ сохранения данных о микроструктуре интерфейсом микроконтроллера с интервалом дискретизации в 1 минуту. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 7: Репрезентативные данные по выбору напитка из двух бутылок, полученные с использованием стандартной процедуры. В парадигме потребления EtOH в домашней клетке с выбором из двух бутылок и прерывистым доступом, (A) крысы получают 20% (v/v) раствор EtOH (оранжевый) и H₂O (синий) по понедельникам, средам и пятницам (ПСП), и две бутылки с H₂O по вторникам, четвергам и в выходные. (B) Показатели ежедневного потребления жидкости показывают, что, хотя крысы поддерживают относительно стабильный уровень общего потребления жидкости (mL) на протяжении всего периода исследования, (C) у крыс часто наблюдается рост потребления EtOH в течение первых нескольких сеансов питья, после чего уровни потребления выходят на плато. (D) Эта закономерность роста и стабилизации аналогично отражается в предпочтении EtOH. Исследователи также могут зафиксировать потребление EtOH, напоминающее биндж-питие (E) , если вес бутылок измеряется через первые 30-60 min после начала сеанса. (F) Это часто связано с высоким предпочтением EtOH по сравнению с H₂O. Закрашенные планки погрешностей представляют ± SEM (n = 32 для самцов и n = 16 для самок). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 8: LIQ HDR точно фиксирует потребление с высоким временным разрешением. Точность и достоверность системы LIQ HDR подтверждаются, в частности, наличием значимой положительной корреляции между количеством лизаний и изменением веса флакона в дни, когда крысы получают (A) H₂O и EtOH, а также в (B) дни, когда в обоих флаконах находится H₂O. (C) Различия в паттернах питья между H₂O (синий) и EtOH (оранжевый) на протяжении 24-часового периода питья можно легко оценить, объединив среднее количество лизаний в 30-минутные интервалы. Вставка соответствует среднему количеству лизаний в 5-минутных интервалах в течение первых 30 мин доступа к флаконам (выделено серым), в течение которых крысы часто демонстрируют выраженное поведение «фронтальной загрузки» (интенсивное потребление в начале). Межгрупповые различия в паттернах питья также можно изучить с помощью аналогичного подхода, что продемонстрировано на примере микроструктуры лизаний для (D) EtOH и (E) H₂O для самцов и самок крыс за 24-часовой период. (F) Паттерны питья также могут быть оценены с высоким временным разрешением за более короткий период тестирования, (G) во время которого LIQ HDR продолжает точно отслеживать потребление и (H) предсказывать концентрацию этанола в крови (BEC) даже при относительно низких уровнях потребления EtOH. Затененные планки погрешностей представляют ± SEM (n = 6 для каждого пола). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 9: Репрезентативные данные о микроструктуре питья. LIQ HDR позволяет регистрировать показатели микроструктуры питья, включая (A) количество слизываний, (B) количество сессий питья и (C) продолжительность сессии, в дополнение к (D) измерению общего потребления воды по изменению веса бутылки. (E-H) Аналогичные показатели могут быть получены для этанола. Межгрупповые сравнения этих показателей позволяют выявить различные паттерны питья, как в данном примере, который демонстрирует половые различия в стратегиях питья в зависимости от потребляемого раствора. Сплошная линия обозначает медиану, пунктирные линии — квартили (n = 6 для каждого пола); непарный t-критерий; *p < 0.05. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительный рисунок 1: Устройство интерфейса микроконтроллера. (A) Электронные компоненты и схема соединений. (B) Материалы для сборки интерфейса микроконтроллера, необходимые для одной системы LIQ HDR. (C) На задней стороне экрана с емкостным сенсорным управлением установите перемычку между контактами подсветки. (D) На задней стороне модуля регистрации данных перережьте дорожку перемычки вывода CS (1). Припаяйте соединительный провод от вывода CS к выводу №7 (2). (E) Припаяйте штыревые разъемы к регистратору данных, используя сенсорный экран в качестве основы. (F) Установите оставшийся разъем 2x4 на микроконтроллер (1), установите регистратор данных на микроконтроллер и припаяйте разъем на месте (2). (G) Вставьте батарейку-таблетку в регистратор данных (1), установите сенсорный экран на регистратор данных и вставьте SD-карту в регистратор данных (2). (H) Чтобы изготовить дополнительный провод заземления, отрежьте один разъем «папа» от соединительного провода и припаяйте конец к зачищенному одножильному проводу. (I) Подключите 4-контактные соединительные провода и дополнительный провод заземления к микроконтроллеру (1) и закрепите их горячим клеем (2). (J) Поместите интерфейс микроконтроллера в специальный корпус, напечатанный на 3D-принтере. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Обсуждение

Текущий протокол содержит пошаговые инструкции по сбору данных о потреблении этанола с использованием процедуры прерывистого доступа в домашней клетке с двумя бутылками. Этот метод может быть реализован с относительной легкостью и практически без затрат или необходимости в специализированном исследовательском оборудовании. Используя представленные здесь процедуры для создания и внедрения LIQ HDR - системы обнаружения облизывания для использования на крысах - исследователи могут захватывать данные о микроструктуре питья с высоким разрешением в дополнение к стандартным показателям потребления и предпочтений.

График прерывистого доступа, описанный в настоящем протоколе, является широко используемой процедурой в значительной степени потому, что хорошо известно, что он приводит к более высоким уровням потребления этанола, чем многие альтернативные графики доступа к этанолу. Действительно, предыдущие исследования показали, что крысы с прерывистым доступом имеют более высокое среднесуточное потребление этанола, чем крысы с непрерывным 24-часовым доступом ^6,7. Тем не менее, в зависимости от исследовательского вопроса или других параметров экспериментального плана могут быть желательны различные графики доступа к этанолу. Исследователи могут очень легко модифицировать текущий протокол, чтобы приспособиться к различным графикам (например, непрерывный доступ, питье в темноте и т. д.), просто изменяя время и дни включения/выключения бутылки.

Несмотря на то, что выбор двух бутылок является относительно простой в реализации парадигмой, могут возникнуть проблемы, которые могут поставить под угрозу сбор данных. Поэтому крайне важно, чтобы экспериментаторы ежедневно проверяли данные, чтобы быстро выявлять потенциальные проблемы. В частности, исследователи должны обращать пристальное внимание на очень большие или очень малые изменения веса бутылки, которые могут указывать на протекающий или забитый глоток соответственно. Раннее выявление признаков этих проблем может предотвратить исключение всех данных по данному предмету из анализа. Действительно, если исследователи заметят резкие изменения (или их отсутствие) в весе бутылки в течение 24 часов, простое переключение на новую бутылку может помочь подтвердить, следует ли изъять данную бутылку из обращения. По этим причинам разумно иметь под рукой дополнительные бутылки и глотки. Однако следует отметить, что некоторые крысы от природы демонстрируют очень низкий уровень потребления этанола, например, ³⁵. Это особенно верно для крыс определенных линий, см.⁸ для обзора. Таким образом, исследователям не следует беспокоиться, если небольшая популяция животных в данном эксперименте имеет низкое потребление этанола или вообще не потребляет его. Кроме того, некоторые животные склонны играть с глотком/бутылкой таким образом, что это может способствовать разливу. Хотя и редко, но повторяющиеся случаи значительных изменений веса бутылки, которые не связаны с потреблением, могут потребовать исключения конкретного животного из эксперимента.

Наш подробный пошаговый протокол демонстрирует простоту внедрения и использования системы LIQ HDR для крыс. Исследователи, не обладающие предварительными знаниями или навыками в области микроконтроллерной электроники и программирования, могут легко адаптировать эту систему к своим экспериментальным потребностям с минимальными изменениями или без них. Наши репрезентативные данные еще раз демонстрируют его успешное применение для исследований употребления алкоголя в клетках для крыс и его мощную способность фиксировать многочисленные показатели микроструктуры питья с высоким временным разрешением. LIQ HDR включает в себя несколько конструктивных изменений относительно своей предшественницы^{мыши 30}. Это было сделано не только для успешной адаптации к использованию на крысах, но и для улучшения функциональности и пользовательского опыта. Компоненты клетки, в том числе напечатанный на 3D-принтере держатель для бутылок, блокиратор для питья и электронные компоненты, перемещены в верхнюю часть клетки для защиты от жевания, что может привести к частой и значительной потере данных и обороту оборудования. Добавление акриловой панели, вырезанной лазером, еще больше помогает предотвратить разрушение этих уязвимых компонентов. За исключением акриловой панели, которая изготовлена из того же материала, что и стандартная клетка для крыс в обувной коробке, все остальные компоненты LIQ HDR недоступны для животного изнутри клетки или доступны только на короткое время во время смены бутылки. Такая конструкция ограничивает возможность разрушения компонентов устройства и риск для животного при проглатывании непищевых предметов. В отличие от относительно трудоемких бутылок, изготовленных на заказ, используемых в дизайне LIQ HD, держатель для бутылок, напечатанный на 3D-принтере LIQ HDR, разработан таким образом, чтобы быть совместимым с коммерческими готовыми бутылками для питья грызунов. Бутылочки устанавливаются на верхней части клетки и доступны для крыс во многом так же, как бутылочки для питья применяются во время стандартного ухода и содержания. Добавление блокираторов sipper является простым, но эффективным решением, которое повышает надежность системы и предотвращает потерю ценных данных, которая в отсутствие блокиратора может произойти в результате употребления алкоголя до начала сбора данных на интерфейсе Arduino, или ошибочных измерений лизуния, которые происходят при взаимодействии крыс с сипперами во время ежедневной калибровки. В то время как значительно большие клетки для крыс требуют увеличения оригинальной конструкции оборудования в размерах, использование значительно более длинных кабелей может негативно повлиять на чувствительность и точность емкостного считывания из-за помех, а также на целостность связи I^2Cмежду последовательно подключенными сенсорными платами и интерфейсом Arduino. Мы обошли эту проблему, внедрив систему дифференциальной связи I²C для обеспечения сверхдальней передачи сигнала без потерь по кабелям Ethernet. Материалы, из которых изготовлены компоненты в клетке, обеспечивают легкую очистку и дезинфекцию между использованиями. Лизометр можно стерилизовать и протереть 70% раствором этиленоксида, при этом необходимо следить за тем, чтобы электрические компоненты, такие как проводящая медная лента, оставались неповрежденными. Неэлектрическое оборудование, находящееся в непосредственном контакте с животным, такое как блокиратор воды и акриловая панель, можно тщательно промыть теплой мыльной водой.

Надежность и эффективность любой системы обнаружения слизывания требует надлежащего строительства и установки, а также всестороннего тестирования, тщательного мониторинга ошибок и эффективного поиска и устранения неисправностей. Все компоненты своими руками должны быть изготовлены и собраны с умением и тщательностью. Это особенно важно для этапов, связанных с пайкой, которые могут потребовать практики для начинающих. Несмотря на это, перед использованием в реальных экспериментах требуется всестороннее тестирование всех лизометров. Если систему необходимо модифицировать для адаптации к индивидуальным экспериментальным потребностям, может потребоваться дополнительная тонкая настройка датчика (например, пороги касания и отпускания) для точного обнаружения облизывания. Для начинающих пользователей мы предлагаем протестировать систему в кратком пилотном исследовании с небольшой выборкой с использованием очень приятного на вкус решения, которое приведет к высокому уровню употребления алкоголя. Обнаружение облизывания можно проверить в режиме реального времени путем визуального осмотра платы датчика, поскольку светодиод мигает при каждой регистрации облизывания. Сильные, значимые и последовательные корреляции между числом лизунов и изменением веса бутылки следует использовать в качестве ориентира для правильной настройки аппаратного и программного обеспечения. Даже после того, как настройка будет завершена, мы рекомендуем начинать запись для конкретного эксперимента в день, когда крысы получают две бутылки с водой, чтобы устранить проблемы с оборудованием, которые могут быть очевидны в начале эксперимента. Также может быть полезно проверить работу лизометра в день воды, связанный со сменой клетки, поскольку для этого необходимо отсоединить лизометр и снова подключить его к датчику. Случайный отказ отдельного лизкометра или датчика, который может привести к очень очевидным отклонениям данных (например, не обнаружено ни одного или несколько облизываний, несмотря на существенное изменение веса бутылки) для одного и того же лизометра, указывает на неисправный компонент (компоненты). Мы рекомендуем заранее подготовить дополнительные компоненты для каждого элемента системы ликометра, чтобы обеспечить легкую замену в случае необходимости. Наконец, невозможно переоценить важность того, чтобы кабели датчиков не перекрывались и не изгибались чрезмерно. Это может привести к случайным случаям плохого обнаружения облизывания, о чем свидетельствует необоснованно низкое число облизывания при данном изменении веса бутылки или чрезвычайно большая продолжительность облизывания (около 60 000 мс для 1-минутной корзины), охватывающая минуты или часы. Тем не менее, небольшие потери данных неизбежны в исследованиях, которые собирают данные в течение 24 часов для многих животных в течение многих дней с использованием стандартного подхода или подхода, оснащенного ликометром. Исследователи могут исключить ошибочные данные для редких сеансов питья, когда вес бутылки и/или облизывание явно не отражают потребление (например, засорение глотка, ошибка калибровки и т. д.). В таких случаях среднее значение для данного показателя (например, потребление (г/кг), облизывание и т.д.) за период исследования для этого конкретного субъекта может быть заменено отсутствующим значением во время анализа данных. ANOVA со смешанными эффектами также можно использовать в качестве альтернативы для размещения отсутствующих точек данных.

Одним из преимуществ парадигмы выбора двух бутылок является добровольный аспект потребления этанола. Это дает отличную лицевую достоверность, особенно в свете результатов, показывающих, что употребление алкоголя экспериментатором может оказывать значительно иное воздействие на функции мозга и поведение по сравнению с добровольным самостоятельным приемом^{алкоголя.} Более того, добровольный характер парадигмы позволяет исследователям фиксировать индивидуальные различия в потреблении, аналогичные вариативности предпочтений алкоголя и моделей употребления алкоголя, наблюдаемой у людей. Эти индивидуальные различия могут предоставить исследователям прекрасную возможность соотнести потребление (потребление и/или модели) с величиной наблюдаемых патологических эффектов.

Тем не менее, следует учитывать некоторые ограничения парадигмы питья в домашних клетках с двумя бутылками. Например, хотя индивидуальная вариабельность потребления этанола может быть полезной для некоторых экспериментов, она может быть недостатком в других экспериментах, где может быть желателен постоянный уровень интоксикации или воздействия этанола. Это особенно верно для экспериментов, изучающих последствия зависимости и отказа от хронического воздействия этанола. Важно отметить, что употребление алкоголя в двух бутылках не характеризуется как модель зависимости - даже у крыс с доступом к этанолу в течение длительных периодов времени. Таким образом, при отсутствии сопутствующих симптомов абстиненции исследователи должны проявлять осторожность при интерпретации последствий длительного потребления этанола как эффектов зависимости и/или абстиненции. Действительно, возможно, если не правдоподобно, что крысы, пьющие относительно большое количество этанола во время процедуры выбора двух бутылок, проявляют симптомы абстиненции, но что крысы, пьющие меньшие объемы в течение данного 24-часового периода, не проявляют подобных признаков зависимости. Режим питья также может играть важную роль в этом рассмотрении, поскольку два животных, пьющих одно и то же количество в течение 24 часов, могут испытывать совершенно разные уровни интоксикации (т.е. BEC) в зависимости от^{характера потребления ими} этанола. Это подчеркивает полезность LIQ HDR в процедуре выбора двух флаконов, поскольку он может легко идентифицировать крыс, которые потребляют данную дозу этанола с высокой скоростью (т.е. глотком), по сравнению с теми, кто потребляет ту же дозу гораздо медленнее (т.е. глотком). Хотя это потенциально нежелательно для исследований, изучающих эффекты контролируемой дозы этанола, обнаружение изменений в привычках употребления алкоголя (например, уменьшение эпизодов запоя) после конкретного экспериментального вмешательства имеет значительную трансляционную ценность, учитывая подход к снижению вреда, который все чаще применяется в клиниках. Наконец, не требуется никаких усилий для того, чтобы животные получили доступ к этанолу в домашних клетках, включая описанную здесь. Таким образом, полезность этой парадигмы ограничена только анализом употребления алкоголя, в то время как оперантные методы предпочтительны в тех случаях, когда исследователи заинтересованы в изучении поиска алкоголя, что является важной особенностью AUD.

Таким образом, описанный здесь протокол предоставляет исследователям всю информацию и ресурсы, необходимые для измерения потребления этанола крысами в домашних условиях. Мы представляем варианты подходов с относительно низким и высоким разрешением, предоставляя исследователям гибкость в выборе метода, который наиболее подходит для их исследовательских потребностей.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
<прочный>коммерчески доступные компоненты			<сильный>Количество
12-клавишный емкостный сенсорный датчик разрыв (MPR121)	Adafruit	1982	3
2-контактная пара кабелей (шаг JST XH 2,5 мм)	Adafruit	4872	18
4-контактная перемычка на макетной плате (Qwiic)	SparkFun	PRT-17912	1
4-контактный кабель (100 мм Qwiic)	SparkFun	PRT-17259	1
4-контактный кабель (50 мм Qwiic)	SparkFun	PRT-17260	3
Переключатель уровня 5 В на 3 В прорыв	Adafruit	5637	1
Емкостный сенсорный экран (2,8 дюйма)	Adafruit	1947	1
Медная проводящая лента (1/4 дюйма)	DigiKey	4393-CFT-1/4-ND	1
Данные Щиток для лесозаготовок	Adafruit	1141	1
Дифференциал I2C коммуникационного выключателя (QwiicBus)	SparkFun	KIT-17250	1
Изолента	DigiKey	3M156004-ND	1
Термоусадочная трубка (3/16 дюйма различных цветов)	Кабельные стяжки и многое другое	HS357-S10	6
Комплект термоусадочных трубок (4 дюйма черный)	Jameco	2095963	1
Литиевая батарейка для монет (3 В 12,5 мм)	DigiKey	1908-CR1220JAUCHSB-ND	1
M5 плоская шайба	Grainger	54FN66	1
M5 шестигранная гайка	Grainger	6CA72	1
M5 машинный винт (12 мм)	Grainger	6GU88	1
M5 машинный винт (25 мм)	Grainger	6GU91	2
Перемычка	Adafruit	1957	1
Плата микроконтроллера (Arduino Mega 2560 Rev3)	DigiKey	1050-1018-ND	1
Нить PETG (2,85 мм серебро)	MatterHackers	M-DDH-UZR2	2
нить PLA (2,85 мм черный)	MatterHackers	M-SEW-RUAW	2
нить PLA (2,85 мм серебро)	MatterHackers	M-66P-6CLE	1
Блок питания (постоянный ток 9 В 1 А)	Newegg	9SIBPPKJYR5991	1
карта памяти SD/microSD (8 ГБ)	Adafruit	1294	1
Разъемы для стекирования щита	Adafruit	85	1
Твердожильный провод (22AWG красный)	Adafruit	288	1
Многожильный провод (22AWG черный)	Adafruit	2976	1
Многожильный провод (22AWG красный)	Adafruit	3068	1
Поворотная трубка с шариком	Альтернативный дизайн	TCCN8.5-ST2.5SB	38
Бутылка для воды (8 унций)	Альтернативный дизайн	WB8FS	38
Изготовленные на заказ 3D-печатные компоненты			Количество
3D-печатное дно корпуса Arduino	Н/Д	ARDUINO_Bottom.stl	1
3D-печатная крышка корпуса Arduino	Н/Д	ARDUINO_Top.stl	1
Напечатанный на 3D-принтере кабельный зажим L	Н/Д	CLIP_L.stl	18
Напечатанная на 3D-принтере гайка кабельного зажима	Н/Д	CLIP_Nut.stl	18
Напечатанный на 3D-принтере кабельный зажим R Н	/Д	CLIP_R.stl	18
Напечатанный на 3D-принтере держатель для бутылок	Н/Д	LICKOMETER_Bottle Holder.stl	19
Напечатанный на 3D-принтере протектор кабеля L	N/A	LICKOMETER_Cable Protector_L.stl	6
Напечатанный на 3D-принтере протектор кабеля R	N/A	LICKOMETER_Cable Protector_R.stl	12
Напечатанные на 3D-принтере буквы ликометра	N/A	LICKOMETER_Letters.stl	19
Напечатанный на 3D-принтере крепежный винт	N/A	Mount Screw.stl	4
Напечатанный на 3D-принтере чехол для датчика A снизу	Н/Д	SENSOR_A_Bottom.stl	1
Напечатанный на 3D-принтере чехол для датчика A сверху Н	/Д	SENSOR_A_Top.stl	1
Напечатанный на 3D-принтере корпус датчика B низ	Н/Д	SENSOR_B_Bottom.stl	1
Напечатанный на 3D-принтере чехол для датчика B сверху	Н/Д	SENSOR_B_Top.stl	1
Напечатанный на 3D-принтере чехол для датчика C низ	Н/Д	SENSOR_C_Bottom.stl	1
Напечатанный на 3D-принтере чехол для датчика C верх	Н/Д	SENSOR_B_Top.stl	1
Напечатанный на 3D-принтере корпус датчика буквы	Н/Д	SENSOR_Letters.stl	1
Напечатанный на 3D-принтере блокиратор	Н/Д	SIPPER_Blocker.stl	36
Напечатанный на 3D-принтере блокиратор	Н/Д	SIPPER_Base.stl	18
Напечатанный на 3D-принтере блокиратор свиребер Снаряжение	Н/Д	SIPPER_Gear.stl	18
Напечатанная на 3D-принтере гайка блокиратора	Н/Д	SIPPER_Nut.stl	18
Напечатанный на 3D-принтере червяк-блокиратор	Н/Д	SIPPER_Worm.stl	18
Вырезанная лазером акриловая панель Н	/Д	LICKOMETER_Acrylic Panel_Sketch.dxf	19