Моделирование потребления алкоголя грызунами с использованием двухбутылкового питья в домашней клетке и микроструктурный анализ

Shikun Hou; Nathaly M. Arce Soto; Elizabeth J. Glover

doi:10.3791/67486

Методическая статья

Моделирование потребления алкоголя грызунами с использованием двухбутылкового питья в домашней клетке и микроструктурный анализ

DOI:

10.3791/67486

⸱

8 ноября 2024 г.

Shikun Hou¹ , Nathaly M. Arce Soto¹ , Elizabeth J. Glover¹

¹Center for Alcohol Research in Epigenetics, Department of Psychiatry, University of Illinois Chicago

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает стандартную парадигму питья в домашней клетке с прерывистым доступом и двумя бутылками для моделирования потребления алкоголя у крыс. Кроме того, он содержит пошаговые инструкции по дополнению стандартного протокола системой обнаружения слизывания, которая позволяет проводить микроструктурный анализ поведения при употреблении алкоголя.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Выбор двух бутылок в домашней клетке - одна из наиболее широко используемых парадигм для изучения потребления этанола грызунами. В простейшей форме животным предоставляется доступ к двум бутылкам для питья, одна из которых содержит обычную воду из-под крана, а другая — этанол, при этом ежедневное потребление измеряется изменением веса бутылки в течение 24 часов. Следовательно, такой подход не требует специализированного лабораторного оборудования. В то время как такая простота внедрения, вероятно, является наибольшим вкладом в его широкое внедрение исследователями доклинического алкоголя, разрешение данных об употреблении алкоголя, полученных с помощью этого подхода, ограничено количеством измерений веса бутылки (например, один раз в день). Тем не менее, желание изучить модели употребления алкоголя в контексте общего потребления, фармакологических вмешательств и нейронных манипуляций подтолкнуло к разработке домашних систем обнаружения облизывания клеток, которые могут получать данные на уровне отдельных облизываний. Несмотря на то, что некоторые из этих систем были разработаны недавно, система с открытым исходным кодом LIQ HD (Lick Instance Quantifier Home cage Device) привлекла значительное внимание в этой области благодаря своей доступности и удобству для пользователя. Несмотря на то, что эта система является захватывающей, она была разработана для использования на мышах. Здесь мы рассмотрим соответствующие процедуры для стандартного и оснащенного ликомометром питья в домашней клетке с двумя бутылками. Мы также представляем методы адаптации системы LIQ HD к крысам, включая аппаратные модификации для размещения большего размера клетки и переработанный держатель для бутылок, напечатанный на 3D-принтере, совместимый со стандартными готовыми бутылками для питья. Используя этот подход, исследователи могут изучать ежедневные модели употребления алкоголя в дополнение к уровням потребления у многих крыс параллельно, тем самым увеличивая разрешение полученных данных с минимальными вложениями дополнительных ресурсов. Эти методы предоставляют исследователям гибкость в использовании как стандартных бутылок, так и приборов, оснащенных ликемометром, для изучения нейробиологических механизмов, лежащих в основе употребления алкоголя, в зависимости от их точных экспериментальных потребностей.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Хотя умеренное употребление алкоголя исторически было связано с умеренной пользой для здоровья, недавние крупномасштабные всесторонние исследования показали, что никакое количество алкоголя не является безопасным1^,². На самом деле, употребление алкоголя является^7-м ведущим фактором риска смерти и инвалидности во всем мире¹, при этом люди, которые пьют даже небольшое количество алкоголя, имеют повышенный риск рака, инфекционных заболеваний и травм¹^,³. В Соединенных Штатах смертность от употребления алкоголя увеличилась почти на 30% в период с 2016 по 2021 год⁴. Важно отметить, что риск смерти и инвалидности монотонно увеличивается с увеличением потребления¹.

Хотя исследования на людях предоставили ценную информацию о нейробиологии употребления алкоголя и злоупотребления им, экспериментальный контроль, обеспечиваемый животными моделями, имеет решающее значение для глубокого понимания механизмов, лежащих в основе употребления алкоголя и риска злоупотребления алкоголем. Эти модели также являются ценными инструментами для разработки методов лечения, направленных на сокращение неконтролируемого потребления. Употребление алкоголя в домашней клетке с двумя бутылками на выбор является одной из наиболее широко используемых доклинических парадигм для изучения потребления алкоголя у грызунов. В значительной степени это связано с простотой его реализации, поскольку он позволяет измерять общее добровольное употребление алкоголя и предпочтения без необходимости использования специализированного исследовательского оборудования или сложных анализов. Используя этот подход, исследователи могут собирать измерения через желаемые промежутки времени (например, часы, дни, недели), вычисляя изменение веса бутылки от начала до конца сеанса питья. Вариации этого базового метода использовались многими специалистами в этой области для облегчения низкого и умеренного уровня потребления алкоголя в течение как коротких, так и длительных периодов времени. Например, непрерывные и прерывистые процедуры выбора двух бутылок были использованы для облегчения низкого и умеренного уровня потребления алкоголя, соответственно, как в классе mice5, так и в классе rats6^,⁷^,⁸. Те же парадигмы могут способствовать высокому уровню потребления сортов, предпочитающих алкоголь⁷^,⁹. В качестве альтернативы, было показано, что адаптация этого метода, которая ограничивает доступ к алкоголю до 2-4 часов в день, начиная примерно через 3 часа после начала темного цикла, приводит к пьянству у мышей (т.е. Употребление алкоголя в темноте)¹⁰^,¹¹. Дополнительные вариации этих методов были использованы в сочетании с методами, облегчающими алкогольную зависимость (т.е. хроническое прерывистое воздействие паров этанола) для изучения эскалации добровольного употребления алкоголя во время абстиненции¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶^,¹⁷^,¹⁸^,¹⁹.

Несмотря на широкое распространение в этой области, стандартный подход к измерению потребления алкоголя по изменению веса бутылки ограничен общим потреблением за сеанс выпивки. Следовательно, этот подход не может охватить модели употребления алкоголя, которые, как хорошо известно, влияют как на риск, так и на тяжесть расстройства, связанного с употреблением алкоголя (AUD)²⁰^,²¹^,²². Действительно, среднее потребление алкоголя человеком с течением времени может быть следствием нескольких эпизодов чрезмерного употребления алкоголя или многих эпизодов употребления алкоголя, каждый из которых связан с относительно низким потреблением, и эти нюансы остаются незамеченными, когда потребление измеряется как общее потребление за сеанс употребления алкоголя. Важно отметить, что значительно больше эпизодов употребления алкоголя, связанных с большими приступами употребления алкоголя (т.е. глотанием), наблюдается у людей с AUD по сравнению со здоровыми контрольными группами²³, и данные у нечеловекообразных приматов свидетельствуют о том, что индивидуумы, которые устанавливают модель потребления алкоголя, включающую большие приступы употребления алкоголя на ранних этапах их истории употребления алкоголя, подвергаются значительному риску AUD²². Более того, эпизоды употребления алкоголя, которые включают в себя большие приступы употребления алкоголя, значительно увеличивают риск заболеваемости и смертности, независимо от AUD diagnosis²¹. В целом, эти данные привели к повышению интереса к изучению моделей употребления алкоголя в дополнение к уровням общего потребления в доклинических моделях и побудили к разработке ряда систем различной сложности, способных собирать данные о питье на уровне отдельных облизываний.

Среди первых была разработка двухбутылочной системы, оснащенной распознаванием облизывания фотолуча, предназначенной для использования у мышей²⁴. Впоследствии эта система была адаптирована отдельной группой для использования в классе rats25. В последующие годы вариации на эту тему использовались для разработки подобных систем, содержащихся в специальном жилье для грызунов²⁶, которые позволяют обнаруживать облизывание отдельных животных, содержащихся в социальном жилье²⁷^,²⁸, и которые фиксируют как кормление, так и питьевое поведение²⁹. Среди них LIQ HD (Lick Instance Quantifier Home cage Device)³⁰ привлек значительное внимание за то, что предложил систему для использования на мышах, которая соответствует простоте внедрения и доступности системы, разработанной Godnyuck et al.²⁴. Эта система использует емкостное зондирование для непосредственного обнаружения контакта между язычком и проводящей металлической трубкой, в отличие от косвенных измерений, таких как приближение или взаимодействие сиппера, которые обеспечиваются с помощью системы обнаружения фотолуча. Авторы предоставляют данные, демонстрирующие, что их емкостная сенсорная система обеспечивает значительно большую точность и чувствительность при обнаружении лизунов, обеспечивая более сильную корреляцию между числом лизунов и изменением веса бутылки, чем обнаружение фотолуча. Авторы также демонстрируют возможность использования этой системы в сочетании с парадигмой питья в домашней клетке с непрерывным доступом к выбору двух бутылок для захвата показателей микроструктуры потребления алкоголя в дополнение к показателям общего ежедневного потребления³⁰.

Здесь мы описываем процедуры для выбора двух бутылок алкоголя в домашней клетке с использованием стандартного подхода, а также методы, которые позволяют обнаруживать облизывание (Рисунок 1). Мы также представляем методы создания и реализации LIQ HDR - адаптацию LIQ HD³⁰ для использования на крысах, которая включает в себя аппаратные модификации для размещения больших размеров клеток и переработанный 3D-печатный держатель для бутылок, совместимый со стандартными готовыми бутылками. Эти методы предоставляют исследователям гибкость в использовании либо стандартного, либо оснащенного ликометром подхода в зависимости от их экспериментальных ресурсов и потребностей в сборе данных.

Ниже приведено описание необходимых материалов и пошаговые инструкции по фиксации домашнего питья в клетке с использованием процедуры выбора двух бутылок с прерывистым доступом, адаптированной из Simms et al.⁷. В ходе этой процедуры крысам предоставляется 24-часовой доступ к двум бутылкам для питья 7 дней в неделю. По понедельникам, средам и пятницам (MWF) крысы получают одну бутылку с водой (H₂O) и другую бутылку с этанолом (EtOH). Эти бутылки убираются по вторникам, четвергам и субботам (TRS) и заменяются двумя бутылками воды. Крысы пьют из одних и тех же двух бутылок воды по субботам и воскресеньям. Обратите внимание, что эти методы при желании могут быть легко скорректированы для альтернативных графиков доступа к этанолу (например, непрерывный, запойный и т. д.). Отдельные инструкции предусмотрены для стандартных подходов и подходов, оборудованных ликомометром.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все репрезентативные данные были собраны с использованием взрослых крыс породы Лонг-Эванс с одобрения Чикагского комитета по уходу и использованию животных Университета Иллинойса в Чикаго и в соответствии с Рекомендациями NIH по уходу и использованию лабораторных животных. Для точного контроля расхода жидкости каждым субъектом требуется единый корпус. Взрослые самцы (n = 38) и самки (n = 22) крыс Лонг-Эванса имели P50-80 по прибытии и им было позволено акклиматизироваться в виварии в течение одной недели до начала эксперимента. Крысы имели свободный доступ к стандартному корму (Teklad 7912, Envigo) и воде, если не указано иное.

1. Подготовка к эксперименту

Маркируйте бутылки для питья как H,₂, O или EtOH. Затем наклейте этикетку с уникальным идентификатором для каждой крысы: одну бутылку H₂O и одну бутылку EtOH для MWF и две бутылки H₂O для TRS.
ПРИМЕЧАНИЕ: При желании используйте ленту другого цвета для идентификации бутылок H_{, 2}O и EtOH, чтобы избежать потенциальных ошибок при смене бутылки.
Наполните бутылки Н₂О питьевой водой за 1 день до даты начала эксперимента. Приготовьте раствор этиленоксида, соединив 190-градусный EtOH с питьевой водой (20% v/v) за 1 день до даты начала эксперимента.
ВНИМАНИЕ: Крайне важно, чтобы используемый EtOH не был денатурированным, так как денатурированный EtOH ядовит.
Подготовьте пустую клетку на том же стеллаже, что и крысы, участвующие в эксперименте. Эта клетка будет использоваться для расчета разлива.
Оснастите клетки системой LIQ HDR, если вы используете (см. шаг 3, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, и дополнительный Рисунок 1).
Определите точное время суток для смены бутылочки до начала исследования. Бутылки следует заменять в одно и то же время каждый день, чтобы получить точное измерение 24-часового приема.
ПРИМЕЧАНИЕ: Предыдущие исследования показали, что грызуны демонстрируют наибольшую степень потребления в начале темного цикла¹⁰^,³¹. Таким образом, для того, чтобы зафиксировать потребление алкоголя в этот высокоактивный период (см. шаг 2.3.1 для фиксации пьянства), рекомендуется менять бутылку через 30-60 минут после выключения света. Используйте красные лампы во время смены бутылки, чтобы обеспечить визуализацию без нарушения цикла света и темноты.

2. Ежедневные процедуры и обслуживание

В первый день эксперимента проделайте следующее.
1. Достаньте стандартные бутылки с водой из клеток.
2. Дополнительно: Крысы часто толкаются верхом клетки, когда они добывают пищу, что может привести к разливу, который не может быть исправлен пустой клеткой для разлива. Использование чашек для еды внутри клетки может облегчить эту проблему. Если вы используете, уберите еду с верхней части клетки, добавьте чашку для еды внутрь клетки и наполните ее чау-чау. Убедитесь, что площадь, отведенная для крысы, по-прежнему соответствует институциональным рекомендациям, основанным на размере клетки для крыс и размере чашки для еды.
3. Сообщите персоналу по уходу и животноводству, в зависимости от обстоятельств, что исследовательский персонал будет предоставлять пищу и воду на время эксперимента.
4. Изменения в каркасе могут нарушить сбор данных. Выполняйте смену клетки в тандеме с измерением массы тела. Исследователи, решившие сделать это, должны соответствующим образом проинформировать свой персонал по уходу и животноводству.
В последующие дни следуйте процедурам, описанным ниже.
ПРИМЕЧАНИЕ: Помните, что любое движение клеток и бутылок может привести к разливу. Поэтому важно быть аккуратным в движениях и использовать те же методы наложения и снятия бутылок на клетке для разлива, что и для клеток для крыс.
1. Войдите в комнату до начала смены бутылок, обеспечив достаточно времени для выполнения описанных ниже шагов, и разместите новые бутылочки на клетках в соответствующее время начала сеанса.
2. Снимите крышки фильтров с клеток. Если MWF, перейдите к шагу 2.2.3. Если TRS, переходим к шагу 2.2.4.
3. По понедельникам, средам и пятницам снимайте бутылки TRS с крышек клеток. Взвесьте флаконы MWF (одну EtOH и одну H₂O). Запишите начальный вес бутылки для сегодняшней попойки. При необходимости обеспечьте дополнительным кормом верхнюю часть клетки или стаканчики с едой. В назначенное время начала сеанса поместите бутылочки на верхнюю часть клетки каждой крысы скотчем вверх, чтобы крысы не прогрызли этикетку бутылки.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, потребление воды не регистрируется и не сообщается для TRS, но исследователи могут дополнительно собирать эти данные, получая данные о весе бутылок на входе и выключении, как описано ниже на шагах 2.2.3 и 2.2.4, если это необходимо. Сторону для бутылки с этиленоксидом следует чередовать после каждого сеанса питья, чтобы избежать развития потенциальных побочных предпочтений, которые могут непреднамеренно исказить данные о потреблении.
  1. Необязательно: Предыдущая работа показала, что многие крысы демонстрируют запойное употребление алкоголя в начале сеанса питья⁸^,³²^,³³. Большинство исследователей, зафиксировавших пьянство в течение этого времени, сообщают о приеме алкоголя в течение первых 30-60 минут сеанса употребления алкоголя. Чтобы получить данные о потреблении во время этого потенциального эпизода запоя, выполните действия, описанные ниже.
  2. Установите таймер после того, как бутылки будут прикладываться к последней клетке. Оставляйте комнату в покое в течение отведенного времени.
  3. Вернитесь в комнату, когда таймер сработает. Удалите бутылки с этиленоксидом и H₂O и запишите вес бутылок. Верните флаконы с EtOH и H₂O в клетки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг не является обязательным для захвата эпизодов запоя при использовании системы, оборудованной для обнаружения облизывания.
4. По вторникам, четвергам и субботам извлекайте бутылки MWF из клеток в назначенное время окончания сеанса, соответствующее 24 часам после времени начала. Взвесьте каждую бутылку и запишите конечный вес бутылки для сеанса питья MWF. Получите и запишите вес тела каждой крысы. При необходимости предоставьте дополнительный корм в верхнюю часть клетки или стаканчики с едой. Поместите бутылки TRS H₂O на верхнюю часть клетки каждой крысы лентой вверх, чтобы крысы не прогрызли этикетку бутылки.
5. Верните крышки фильтров в клетки и оставьте помещение для животных.
  ПРИМЕЧАНИЕ: По желанию накройте потягиватели для бутылок EtOH, чтобы предотвратить испарение. Если смена клеток выполняется исследовательским персоналом, выделите 1 день в неделю во время выполнения обязанностей TRS для выполнения этой задачи. Поместите каждую крысу в чистую клетку после получения веса тела.
Мойте бутылочки и обновляйте жидкости на регулярной еженедельной или двухнедельной основе в соответствии с процедурами ухода за животными и содержания в учреждении. Позаботьтесь о том, чтобы выполнять эти обязанности таким образом, чтобы не прерывать сеансы выпивки. Например, бутылки TRS H₂O можно мыть и наполнять после снятия на MWF. Аналогичным образом, флаконы MWF H_{, 2}O и EtOH можно мыть и наполнять повторно после извлечения на TRS.

3. Обнаружение облизывания во время экспериментов с выбором двух бутылок

ПРИМЕЧАНИЕ: Исследователи, заинтересованные в сборе данных о питье с высоким разрешением, могут изменить вышеуказанную процедуру, добавив к бутылкам возможности обнаружения облизывания. LIQ HD³⁰ - это недорогая система "сделай сам" (DIY), которая позволяет собирать данные такого типа у мышей. Описанные ниже процедуры описывают изменения, необходимые для адаптации LIQ HD для использования на крысах (называемых LIQ HDR). В Таблице материалов приведен список всех коммерчески продаваемых и изготовленных на заказ 3D-печатных деталей, необходимых для создания одной системы обнаружения облизывания, которая может собирать данные о выборе двух флаконов для 18 крыс. Файлы и инструкции для 3D-печати .stl можно найти на сайте автора (www.ejgloverlab.com/3dprints).

Настройка емкостных сенсорных блоков
ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая система LIQ HDR состоит из трех емкостных сенсорных блоков, которые вместе захватывают данные о вылизывании из 36 бутылок параллельно, что соответствует 18 крысам в одном доме. Каждый сенсорный блок состоит из одной дифференциальной коммуникационной платы I²C и одной 12-клавишной емкостной сенсорной платы, которые будут подключаться к лизометрам из шести отдельных корзин через шесть пар 2-контактных кабелей с цветовой кодировкой для каждого ликометра (Рисунок 2A).
1. Соберите материалы, необходимые для сборки всех трех емкостных сенсорных блоков, как показано на рисунке Рисунок 2B, а также необходимые инструменты для пайки.
2. Чтобы начать сборку сенсорного блока A, закройте 2-контактный кабель гнездового разъема красной термоусадочной трубкой длиной 7 дюймов, вставьте его красный и черный концы проводов в контакты #0 и #1 на плате датчика (Рисунок 2C-1) и припаяйте на место (Рисунок 2C-2). Убедитесь, что кабель находится в передней части сенсорной платы, как показано на рисунке, чтобы расположить клетки в нумеруемом порядке слева направо в виварии без перекрытия кабелей и потенциального нарушения записи (см. шаг 3.6 и рисунок 6).
3. Покройте еще пять кабелей ярко окрашенной термоусадочной трубкой и припаяйте к контакту #2-11, как показано на рисунке (Рисунок 2C-3). Убедитесь, что все красные провода припаяны к четным контактам, которые будут подключаться ко всем бутылкам с левой стороны, а все черные провода припаяны к нечетным контактам, которые будут подключаться ко всем бутылкам с правой стороны.
4. Покройте паяные соединения горячим клеем со всех сторон для защиты (Рисунок 2C-4). Обозначьте разъемы в числовом порядке, указав уникальный идентификатор для каждого ликометра (Рисунок 2C-4).
5. Чтобы собрать блок датчиков А, подключите плату датчика А к коммуникационному выключателю EndPoint с помощью 4-контактного кабеля 50 мм, а к выходу 3,3 В рычажного переключателя передач 5 В — 3 В с помощью 4-контактного кабеля 100 мм (рисунок 2D-1). Несмотря на то, что и сенсорная плата, и коммуникационная плата имеют два идентичных 4-контактных разъема, все же важно убедиться, что проводка точно такая, как показано на рисунке (Рисунок 2D-1 и Рисунок 2F), чтобы использовать напечатанные на 3D-принтере корпуса датчиков и предлагаемую настройку вивария (см. шаг 3.6 и Рисунок 6). Поместите блок датчика A внутри напечатанного на 3D-принтере корпуса (рисунок 2D-2). Аккуратно закройте верхнюю часть, стараясь не раздавить трос переключения передач (Рисунок 2D-3).
6. Измените адреса I²C сенсорных плат B и C, припаяв перемычку от контакта ADDR к контакту 3Vo или SDA, как показано на рисунке (Рисунок 2E).
7. Припаяйте шесть кабелей гнездовых разъемов с цветовой кодировкой к платам датчиков B и C в том же порядке, что и для платы A. Пометьте каждый разъем соответствующим идентификационным номером ликометра. Подключите плату B к коммуникационному разъему MidPoint и C к EndPoint с помощью 50 мм 4-контактных кабелей (рисунок 2F).
8. Разместите сенсорные блоки B и C в соответствующих 3D-печатных корпусах. Последовательно подключите все три сенсорных блока кабелями Ethernet, чтобы завершить настройку датчика (Рисунок 2G).
Настройка интерфейса микроконтроллера
ПРИМЕЧАНИЕ: Интерфейс микроконтроллера LIQ HDR (дополнительный рисунок 1A) такой же, как описан для LIQ HD³⁰ с очень незначительными изменениями. Описанные ниже процедуры представляют собой общий обзор шагов, необходимых для настройки интерфейса с изменениями, описанными в шагах 3.2.6 и 3.2.8. Исследователи могут ознакомиться с оригинальным протоколом и видеоуроком, представленным на странице автора на GitHub для получения более подробных пошаговых инструкций³⁰.
1. Соберите материалы и инструменты для пайки, необходимые для создания интерфейса микроконтроллера (дополнительный рисунок 1B). На тыльной стороне сенсорного экрана (дополнительный рисунок 1C-1) создайте перемычку для пайки поперек задней части светлых паяльных площадок (дополнительный рисунок 1C-2).
2. На тыльной стороне экрана регистрации данных разрежьте дорожку перемычки контакта CS (дополнительный рисунок 1D-1). На лицевой стороне регистратора данных припаяйте короткий провод перемычки от контакта CS к контакту #7 (дополнительный рисунок 1D-2).
3. Чтобы установить разъемы для стекирования защитного экрана, сначала установите их на заднюю часть защитного экрана (дополнительный рисунок 1E-1). Установите регистратор данных на сенсорный экран, используйте ленту для стабилизации и припаяйте все контакты разъема к регистратору данных (дополнительный рисунок 1E-2). Затем снимите сенсорный экран.
4. Установите оставшиеся разъемы 2 x 3 в микроконтроллер (дополнительный рисунок 1F-1), затем установите регистратор данных на микроконтроллер перед припаиванием контактов разъема на место (дополнительный рисунок 1F-2).
5. Вставьте батарейку типа «таблетка» в регистратор данных (дополнительный рисунок 1G-1). Установите сенсорный экран на регистратор данных (дополнительный рисунок 1G-1). Вставьте карту microSD вместе с адаптером в регистратор данных (дополнительный рисунок 1G-2).
6. Чтобы сделать дополнительный заземляющий провод, отрежьте один штекерный разъем от перемычки и зачистите конец до ~1/4 дюйма (дополнительный рисунок 1H-1). Припаяйте прядь зачищенного одножильного провода к перемычке и закройте паяное соединение термоусадочной трубкой (дополнительный рисунок 1H-2).
7. Подключите 4-контактные соединительные провода и дополнительный провод заземления к микроконтроллеру (черный - GND, красный - 5 В, желтый - контакт #21, синий - контакт #20, дополнительный рисунок 1I-1). Закрепите соединения горячим клеем (дополнительный рисунок 1I-2). При необходимости оберните перемычки термоусадочной трубкой (дополнительный рисунок 1I-2).
8. Полностью собранный интерфейс микроконтроллера находится в напечатанном на 3D-принтере корпусе с 4-контактными соединительными проводами и заземляющим проводом, продетыми через отверстие в верхней части (дополнительный рисунок 1J).
9. Следуйте оригинальному протоколу для установки программного обеспечения интерфейса микроконтроллера³⁰.
Сборка ликуметров LIQ HDR
ПРИМЕЧАНИЕ: Изготовленный на заказ 3D-принтер, на котором находятся бутылки, предназначен для использования со стандартной бутылкой для питья грызунов с диаметром трубки 8 мм (см. Таблицу материалов, Рисунок 3A). Этот держатель для бутылок может быть легко адаптирован для использования с аналогичными бутылками и трубками для сипперов с незначительными изменениями или без них.
1. Соберите материалы, 3D-принтеры и инструменты для пайки, необходимые для создания одного ликометра, как показано на рисунке Рисунок 3B. Обратите внимание, что каждая система LIQ HDR вмещает максимум 18 лизометров на 36 бутылок.
2. Чтобы удлинить кабель штекерного разъема, зачистите оба его конца до ~1/4 дюйма в длину, а также удлиненные черные и красные провода (Рисунок 3C-1).
3. Припаяйте удлинители к соединительному кабелю (рисунок 3C-2) и закройте паяные соединения термоусадочной трубкой (рисунок 3C-3). Закройте кабель штекерного разъема термоусадочной трубкой, цвет которой соответствует цвету соответствующего кабеля гнездового разъема на блоке датчика (Рисунок 3C-4).
4. Чтобы обеспечить соответствие проводке на плате датчика (Рисунок 2), проденьте красный и черный провод через левый и правый внутренний кабельный проход держателя бутылки соответственно (Рисунок 3D-1).
5. Припаяйте каждый провод к самому концу проводящей медной ленты диаметром 1 3/4 дюйма (Рисунок 3D-2) и сложите медные ленты пополам (Рисунок 3D-3).
6. Отклейте медную ленту и с помощью пары щипцов осторожно проведите ее внутри кронштейна для сиппера (Рисунок 3E-1), прежде чем прочно приклеить его к внутренним стенкам кронштейна для сиппера (Рисунок 3E-2). Убедитесь, что паяльная сторона медной ленты приклеена к стене ближе к средней линии держателя бутылки, как указано (Рисунок 3E-2). Проденьте трубку через кронштейн, чтобы плотно прижать ленту к стене и загрунтовать кронштейн.
7. Чтобы укрепить паяльную сторону медной ленты, которая не так адгезивна и имеет тенденцию отслаиваться, нанесите ложку горячего клея на паяное соединение (Рисунок 3E-3). Намажьте клей так, чтобы покрыть как медную ленту, так и любую прилегающую открытую часть 3D-печати (Рисунок 3E-4).
8. Проденьте кабель через внутренний проход протектора кабеля (Рисунок 3F). Обязательно выберите подходящий протектор кабеля (направленный влево или вправо) для каждого ликометра, чтобы использовать предложенную настройку вивария (см. шаг 3.6 и Рисунок 6)." ПРИМЕЧАНИЕ: Лизометры 5-6, 11-12 и 17-18, которые в текущей конфигурации изображены кабелями синего или фиолетового цвета, требуют защиты кабеля, обращенного влево (Рисунок 4D-1), в то время как для всех других лизометров требуется правый протектор кабеля (рисунок 4D-2).
9. Чтобы установить кабельный зажим, сначала вставьте один провод в паз одной половины кабельного зажима (рисунок 3G-1), затем наденьте другую половину поверх второго провода, а затем плотно закройте обе половины гайкой (рисунок 3G-2).
10. Пометьте штекерный разъем соответствующим идентификационным номером ликометра (рисунок 3H). Повторяйте эти действия, пока не будут построены все 18 ликомметров.
Установка ликометра LIQ HDR
ПРИМЕЧАНИЕ: LIQ HDR предназначен для установки на стандартную обувную коробку в клетку для крыс с крышкой из металлической проволоки (рисунок 4A-1).
1. Определите две пары стержней с расстоянием между центрами ~75 мм на верхней части проволочной клетки, чтобы разместить держатель для бутылок. С помощью плоскогубцев слегка приоткройте металлические стержни вокруг отверстий поглотителя. Изолируйте эти стержни изолентой, чтобы предотвратить контакт металла с металлом между глотками и верхней частью клетки (Рисунок 4A-2).
  ПРИМЕЧАНИЕ: Несмотря на то, что изолента недоступна для крыс и, следовательно, не подвержена жеванию, мы рекомендуем выбросить ее в конце исследования и не использовать повторно между исследованиями.
2. Установите лизометр и лазерную акриловую панель толщиной 1/8 дюйма на верхнюю часть клетки с помощью двух наборов винтов и гаек M5 (Рисунок 4B). Убедитесь, что отверстия для погильдов на лицометре и акриловой панели совпадают, и что погильды не соприкасаются с какой-либо частью верхней части клетки.
3. Закрепите кабельный зажим на крайнем стержне (~4 мм в диаметре) верхней части проволочной клетки (Рисунок 4C). При необходимости отрегулируйте зажим для кабеля, чтобы убедиться, что верхняя часть клетки плотно прилегает к нижней части клетки и что трос не тянется и не сгибается при слишком сильном натяжении. Убедитесь, что для каждого ликометра используется правильный протектор кабеля (Рисунок 4D и см. шаг 3.8.8).
4. При необходимости отрегулируйте трубки сиппера так, чтобы только ~2 см сиппера выступали от колпачка (Рисунок 4E-1). Чтобы установить бутылки, вставьте трубку сиппера через кронштейн сиппера держателя бутылки до упора (Рисунок 4E-2). Только самый кончик трубки сиппера должен выходить за пределы акриловой панели (Рисунок 4E-3). Крайне важно, чтобы никакая другая часть сипперной трубки не подвергалась воздействию, чтобы избежать ложноположительных слизываний от неконсумативного поведения, такого как прикосновение крысы или игра с сиппером. Верхняя часть фильтра должна плотно прилегать к верхней части проволочной клетки и зажиму кабеля, не нарушая сам кабель (Рисунок 4F).
  ПРИМЕЧАНИЕ: Более толстая акриловая панель или стопка из нескольких панелей размером 1/8 дюйма могут быть использованы для полного закрытия сиппер трубок большей длины для экспериментов, требующих, чтобы сиппер простирались дальше в клетку, например, при измерении питья у молодых крыс, у которых могут возникнуть проблемы с дотягиванием до короткого глотка.
Установка и использование блокираторов
ПРИМЕЧАНИЕ: Блокиратор для питья (Рисунок 5A) предназначен для ограничения доступа крысы к сипперу во время смены бутылок и для обеспечения точной калибровки ликометра в начале каждого сеанса питья.
1. Соберите напечатанные на 3D-принтере детали и винт, гайку и шайбу M5 для одного блокиратора, как показано на рисунке Рисунок 5B.
2. Вставьте SIPPER_Gear в SIPPER_Base (рисунок 5C-1). Убедитесь, что SIPPER_Gear ориентирован точно так, как показано на врезке для 3D-рендеринга. Вставьте SIPPER_Worm в отверстие в верхней части SIPPER_Base. Поворачивайте червяк по часовой стрелке во время вставки, пока головка не окажется на одном уровне с основанием (Рисунок 5C-2).
3. Прикрутите SIPPER_Nut к концу червяка снизу основания (рисунок 5C-3). С помощью щипцов затяните гайку, поворачивая червячный диск. Вставьте круглые узкие горловины SIPPER_Blockers в слоты Gear (Рисунок 5C-4).
4. Установите собранный блокиратор сиппера на верхнюю часть клетки с помощью набора винтов M5 (Рисунок 5D). Убедитесь, что оба блокиратора сиппера совпадают с отверстиями сиппера.
5. Чтобы заблокировать доступ к глоткам, поверните червячный диск по часовой стрелке, чтобы опустить блокираторы до тех пор, пока они полностью не закроют отверстия сиппера (Рисунок 5E).
6. Чтобы обеспечить доступ к потягивателям, поворачивайте диск против часовой стрелки, пока блокираторы не окажутся в вертикальном положении, перпендикулярном верху клетки (Рисунок 5F-1). Вручную потяните вверх за каждый блокирующий рычаг, пока головки не окажутся чуть ниже верхней части проволочной клетки. Поверните блокираторы на 90° так, чтобы головки были параллельны металлическим стержням на верхней части клетки, а руки зафиксированы на месте (Рисунок 5F-2). Продолжайте поворачивать диск против часовой стрелки, пока оба блокиратора не поднимутся над верхней частью клетки (Рисунок 5F-3) и глотки не станут полностью доступными (Рисунок 5F-4).
Использование системы LIQ HDR в виварии
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующая конфигурация вивария оптимизирована для захвата напитков из двух бутылок с использованием одного интерфейса микроконтроллера, подключенного к 18 стандартным клеткам для крыс в обувных коробках. Все электронные компоненты, включая интерфейс микроконтроллера, сенсорные блоки и различные кабели, закреплены на настенных металлических проволочных стеллажах, на которых установлены клетки (Рисунок 6A). Могут потребоваться некоторые модификации для адаптации к условиям содержания животных и потребностям пользователей.
1. Закрепите каждый сенсорный блок на стеллаже вивария с помощью специального 3D-печатного крепежного винта (Рисунок 6B). Убедитесь, что каждый блок датчиков установлен непосредственно под клеткой с помощью желтого ликометра, чтобы избежать ненужного натяжения кабеля (Рисунок 6A).
2. Расположите и закрепите каждый кабель гнездового разъема, следя за тем, чтобы они не перекрывались друг с другом и не перегибались на концах пайки, что может привести к плохому обнаружению облизывания (Рисунок 6B). Если используется полка с металлическими стержнями, этого можно легко достичь, связав соединительные кабели с отдельными стержнями на полке, как показано на рисунке.
3. Установите интерфейс микроконтроллера рядом с сенсорным блоком A с помощью того же крепежного винта, напечатанного на 3D-принтере, и вставьте его 4-контактный разъем во входной порт 5 В преобразователя уровня 5 В-3 В, подключенного к сенсорному блоку A (рисунок 6C).
4. Используйте изоленту, чтобы закрепить дополнительный провод заземления к источнику заземления, такому как металлический стеллаж (Рисунок 6D).
5. Расположите каждую клетку в соответствии с цветом и идентификатором установленного ликометра в соответствии с изображением Рисунок 6A, чтобы свести к минимуму перекрытие и натяжение кабеля.
6. Надежно подсоедините все кабели гнездового разъема lickometer к подходящим кабелям гнездового разъема датчика (Рисунок 6E). Подключите блок питания, чтобы включить интерфейс микроконтроллера (рисунок 6F).
7. На главной странице графического интерфейса пользователя (Рисунок 6G) нажмите на символ настроек, чтобы открыть страницу настроек. Пользователи могут изменять время включения и выключения света в зависимости от расписания вивария, чтобы гарантировать, что отображение интерфейса автоматически уменьшается при начале темного цикла (Рисунок 6H-1).
8. Нажмите «Редактировать настройки датчика» (рисунок 6H-1), чтобы настроить порог касания на 8 и порог отпускания на 2, что, как мы обнаружили, обеспечивает наиболее стабильное обнаружение облизывания крыс с использованием текущей настройки (рисунок 6H-2). Обратите внимание, однако, что пользователям может потребоваться поэкспериментировать с другими настройками, если в текущую систему вносятся какие-либо изменения.
9. Снимите флажок Автокалибровка, если данные собираются только за период 24 часа или меньше (Рисунок 6H-2).

4. Ежедневные процедуры для выбора двух бутылок в домашней клетке с использованием обнаружения облизывания

Выполните действия, описанные в шаге 2 для стандартных процедур выбора двух флаконов со следующими изменениями.
По понедельникам, средам и пятницам, перед тем как надеть бутылки MWF, используйте блокираторы, чтобы закрыть отверстия сипперов на всех клетках (см. шаг 3.5.5 и рисунок 5E).
Перед записью выберите правильную экспериментальную сторону на главной странице графического интерфейса, которая будет стороной бутылки EtOH в этот день (Рисунок 6G).
После установки всех бутылок MWF нажмите START! на главной странице (Рисунок 6G), чтобы начать калибровку датчиков, во время которой пользователям рекомендуется отойти от системы и убедиться, что крысы не облизывают глотки (Рисунок 6I-1). Калибровка занимает несколько секунд, после чего система попадает на главную страницу записи, показывающую совокупные номера облизывания на каждой бутылке для каждого лизуна (Рисунок 6I-2).
Поднимите все блокираторы сипперов над верхней частью клетки, чтобы обеспечить доступ к сипперам (см. шаг 3.5.6 и Рисунок 5F), и аккуратно верните все верхние части фильтров, как описано (см. шаг 3.4.4 и Рисунок 4F).
Нажмите «Обновить», чтобы обновить цифры на экране, которые не будут обновляться в режиме реального времени сами по себе (Рисунок 6I-2).
По вторникам, четвергам и субботам нажмите Save & Quit, чтобы остановить запись и вернуться на главную страницу (Рисунок 6I-2) перед тем, как извлечь бутылки MWF.
Чтобы извлечь SD-карту для передачи данных, нажмите «Извлечь SD» перед отключением SD-карты (Рисунок 6G). Вставьте SD-карту в любой компьютер и скопируйте/вставьте файл данных .csv, названный по дате начала бутылки, на этот компьютер (рисунок 6K). Чтобы снова подключить SD-карту для следующей записи, вставьте карту в интерфейс и нажмите Mount SD (Рисунок 6J).
ПРИМЕЧАНИЕ: Мы рекомендуем ежедневно создавать резервные копии файлов данных.
Рекомендуется ограничить измерение массы тела до одного раза в неделю, если это совместимо с моделью животного и протоколом использования животного, и выполнять эту задачу в день, предназначенный для смены клетки, чтобы свести к минимуму ненужное беспокойство лизуновщиков и датчиков. Перед перемещением клеток отсоедините все шлейфы лизометра от соответствующих кабелей датчика с гнездом. Взвесив каждую крысу, верните крысу в чистую клетку. Перенесите лизометр на новую крышку клетки и при необходимости снова подключите каждый лизометр к соответствующему датчику.
Для экспериментов, в которых проверяется влияние вмешательства (например, инъекции препарата) на потребление этии и микроструктуру питья, планируйте такие вмешательства до начала сеанса употребления алкоголя, когда это возможно. В тех случаях, когда это невозможно, исследователи могут прервать обнаружение облизывания, нажав кнопку «Пауза» (рисунок 6I-2), и возобновить сбор данных, нажав кнопку «Возобновить» после завершения вмешательства. Мы рекомендуем собирать данные о весе бутылок во время каждой паузы во время сеанса питья, чтобы зафиксировать изменения в потреблении этиона до и после вмешательства, а также учесть утечку, которая может произойти при снятии крышки клетки для получения доступа к животному.
В конце исследования все компоненты в клетке должны быть тщательно продезинфицированы перед использованием с новыми животными, чтобы ограничить передачу загрязняющих веществ между животными. Мы рекомендуем аккуратно распылить и протереть ликометр 70% раствором EtOH, следя за тем, чтобы не нарушить работу внутренних электрических компонентов. Блокиратор сиппера и акриловую панель можно мыть теплой мыльной водой.

5. Анализ данных

Прежде чем оценивать зависимые показатели, скорректируйте данные о потреблении на предмет разлива, который неизбежно происходит в результате ежедневной замены бутылок. Для этого усредните изменение веса бутылок с этиоксидом этина иН2 О на клетке для разлива в течение всего периода исследования.
Исключите любые значения, превышающие два стандартных отклонения от среднего значения для каждой бутылки. После исключения этих выбросов вычтите рассчитанные средние из изменений EtOH и_H2Oвеса бутылок, полученных из бутылок в клетках с животными. Вычитая эту величину, исследователи могут быть уверены в том, что средние потери в результате разлива данного раствора не учитываются в мерах потребления. Вычитание среднего количества разлива может привести к отрицательному значению для некоторых животных в некоторых случаях. Преобразуйте их в ноль и интерпретируйте их как отсутствие какого-либо приема для этого решения.
Основными зависимыми показателями для экспериментов с выбором напитков с двумя бутылками являются потребление этиона (г/кг) и предпочтение (%). Рассчитайте потребление на основе изменения веса бутылки с этиоксидом (г) и нормализуйте до массы тела (кг), выполнив следующие действия.
1. Конвертируйте изменение веса бутылки (г) в изменение объема (мл) с помощью следующего уравнения:
  
  Плотность чистого этанола составляет 0,789 г/мл. Таким образом, плотность 20% EtOH составляет 0,1578 г/мл. H₂O весит 1 г/мл. Таким образом, составляющая плотность 80%_H2O = 0,80 г/мл. Следовательно, каждый мл 20% раствора EtOH (v/v) состоит из 0,1578 (EtOH) + 0,80 (H₂O) = 0,9578 г/мл. Таким образом, итоговое уравнение при использовании концентрации EtOH 20% (v/v) выглядит следующим образом:
2. Рассчитайте дозу потребляемого этанола, используя уравнение ниже. Используйте массу тела, полученную в течение той же недели, что и данные о потреблении, чтобы рассчитать потребленный этанол с точки зрения массы тела животного><.
3. Рассчитайте предпочтения с помощью следующего уравнения:
Как и его мышиный аналог class³⁰, LIQ HDR фиксирует множество переменных микроструктуры питья, включая продолжительность облизывания, количество схваток, продолжительность схватки, число схваток и продолжительность слияния (Рисунок 6K). Попойка определяется как серия облизываний, которая начинается не менее чем с 3 облизываний, выполненных менее чем за 1 секунду, и заканчивается по прошествии 3 секунд без дополнительных облизываний. Эти измерения затем могут быть использованы для расчета средней продолжительности индивидуального облизывания, средней продолжительности индивидуального схватки, среднего количества облизываний за схватку, средней частоты облизывания, предполагаемого интервала между облизываниями и предполагаемого интервала между схватками.
ПРИМЕЧАНИЕ: Интерфейс микроконтроллера предоставляет эти данные о микроструктуре с разрешением 1 минута в файле .csv (Рисунок 6K). Исследователи могут использовать аналитическое приложение, поставляемое с оригинальным протоколом LIQ HD³⁰ или предпочитаемую ими платформу постобработки для сопоставления и обобщения данных в соответствии с исследовательскими потребностями. Данные о микроструктуре обычно суммируются за весь 24-часовой период для сравнения усредненных различий на макроуровне или за 30 минут до 1 часа для изучения вариаций модели употребления алкоголя в цикле «свет-темнота».

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Стандартный прерывистый выбор домашней клетки с двумя бутылками EtOH данные для питья
Используя стандартную процедуру (Рисунок 7A), исследователи могут зафиксировать 24-часовое потребление (Рисунки 7B-D), а также запойное питье, если вес бутылки собран вскоре после начала сеанса питья (Рисунки 7E-F). Рассчитывая потребление этанола относительно потребления воды, исследователи также могут получить данные о предпочтениях во всех измеряемых временных точках (рисунки 7D,F). Как показано на рисунке Рисунок 7C, у крыс часто наблюдается период увеличения потребления этанола в течение первых нескольких дней доступа с двумя бутылками. За этим следует плато, во время которого потребление остается относительно стабильным. Хотя постоянно наблюдается у самцов крыс⁷^,³²^,³³^,³⁴^,³⁵^,³⁶, эта закономерность не всегда наблюдается у самок. Вместо этого, некоторые исследования сообщают о стабильных уровнях потребления этанола в течение всего периода исследования у самок крыс³⁷^,³⁸. Кроме того, некоторые исследования показывают, что потребление этанола может еще больше увеличиться при более длительных периодах доступа³⁶^,³⁹. Суточная доза может значительно варьироваться у разных людей. Тем не менее, средняя суточная доза была хорошо охарактеризована для штаммов, наиболее часто используемых в исследованиях алкоголя, и может быть использована в качестве критерия успеха при рассмотрении сгруппированных данных⁷^,⁸^,³³^,³⁴^,³⁵^,³⁹.

Как показано в Рисунок 7E, многие крысы потребляют значительную часть своего ежедневного потребления этанола вскоре после начала сеанса питья⁸^,³³. Этот перезапой режим потребления этанола часто связан со значительным предпочтением этанола воде (Рисунок 7F). Однако исследователям не стоит удивляться, если 24-часовое предпочтение не превышает 50%. Это особенно верно для беспородных или не предпочитающих алкоголь штаммов грызунов и исследований, ограниченных относительно короткими периодами выбора двух флаконов access⁷^,³²^,³³^,³⁵^,³⁷.

Валидация LIQ HDR для анализа микроструктуры напитков из двух бутылок
Добавление системы LIQ HDR к стандартной парадигме выбора двух бутылок позволяет исследователям точно и точно прогнозировать потребление с использованием собранных данных о питье. Это подтверждается наличием сильной и значимой корреляции между кумулятивным числом обнаруженных лизунов и изменением веса бутылки как для EtOH (R² = 0,7789, F_(1,113) = 398,1, p < 0,0001), так и для бутылки H₂O (R² = 0,7910, F_(1,117) = 442,9, p < 0,0001) за период в 24 часа (рисунок 8A). Это справедливо и для дней, когда крысы получали две бутылки, содержащие H₂O (R² = 0,8875, F_(1,188) = 1484, p < 0,0001; рисунок 8B).

LIQ HDR также позволяет точно анализировать модели употребления алкоголя с высоким временным разрешением, которое не обеспечивается стандартной парадигмой выбора двух бутылок. Используя этот подход, исследователи имеют возможность изучить различия в моделях употребления алкоголя между различными решениями, в световом цикле, между полами, группами лекарств и т. д. Например, разбивка средних доз на 30-минутные интервалы позволяет легко анализировать средние 24-часовые модели употребления алкоголя. Как и ожидалось, этот анализ показал значительно более высокое потребление как EtOH, так и H₂O во время темнового цикла, когда крысы бодрствуют, чем в световом цикле, когда крысы обычно спят (Рисунок 8C). Используя аналогичный подход, исследователи могут изучить групповые различия в моделях употребления алкоголя. Например, можно сравнить микроструктуру питья самцов и самок крыс, изучив среднее количество облизываний этии (рисунок 8D) или воды (рисунок 8E) за 24-часовой период. Чтобы исследовать перегрузку и/или запойное употребление алкоголя, исследователи могут увеличить разрешение своего анализа, чтобы сосредоточиться на употреблении алкоголя, происходящем вскоре после начала сеанса, используя меньшее групповое окно для обобщения данных. Это позволяет исследователям исследовать периоды пьянства, не требуя многократного взвешивания бутылок в течение 24 часов. Как показано на рисунке Рисунок 8C (врезка), этот анализ показывает, что большая часть напитков, захваченных весом бутылки, полученной через 30 минут после начала сеанса, происходит в первые 5 минут, а не в течение всего 30-минутного периода. Такие данные могут помочь в определении оптимальных временных точек для сбора образцов крови для измерения концентрации этанола в крови (BEC). Действительно, аналогичная картина фронтальной загрузки наблюдалась в отдельный день питья, в течение которого модели употребления алкоголя с высоким разрешением регистрировались в течение всего 15 минут (Рисунок 8F). Среднее количество облизываний, зарегистрированное во время этого сеанса, достоверно предсказывало изменение веса бутылки (EtOH: R² = 0,6316, F_(1,10) = 17,15, p = 0,0020; H₂O: R² = 0,8601, F_(1,10) = 61,47, p < 0,0001; Рисунок 8G). Кроме того, БЭК, взятые из образцов крови, полученных через 15 мин после начала сеанса, хорошо коррелировали с количеством обнаруженных лизунов: (R² = 0,4327, F_(1,10) = 7,627, p = 0,0201; рисунок 8H) даже при относительно низком уровне потребления EtOH.

LIQ HDR фиксирует различные измерения микроструктуры питья, которые обнаруживаются и рассчитываются в режиме реального времени во время сеансов питья и сохраняются в контейнерах по 1 минуте, подобно обнаружению лизания (Рисунок 6K). Эти меры кратко описаны в шаге 5.4 и определены ранее³⁰. Исследователи могут провести подробный анализ изменений в микроструктуре отдельных напитков и изучить, как и в какой степени модели употребления алкоголя влияют на различия в общем потреблении. Чтобы проиллюстрировать это, мы обнаружили, что, хотя самцы и самки крыс демонстрировали одинаковое количество облизываний, питьевых схваток и продолжительность схваток (Рисунок 9A-C) при употреблении воды, это было связано с большим общим потреблением (г/кг) у самок, чем у самцов (t-критерий; t=2,882, df=10, p=0,0163; Рисунок 9D). Это ожидаемо, учитывая половой диморфизм в массе тела, который способствует более высокому уровню потребления массы тела для самок, чем для самцов за эквивалентное количество облизываний. Поразительно, но это контрастирует со сравнением половых различий в микроструктуре EtOH, которое выявило схожую микроструктуру питья, связанную с одинаковыми уровнями потребления EtOH (Рисунки 9E-H). Эти данные свидетельствуют о том, что, хотя объем облизывания воды одинаков между полами, по сравнению с самцами, самки крыс имеют меньший объем облизывания этиленоксида. В совокупности эти микроструктурные данные подтверждают идею о том, что самцы и самки крыс, вероятно, различаются в стратегиях добровольного питья, основанных на типе жидкости, потребляемой в домашних условиях. В предыдущих работах также сообщалось о половых различиях в стратегиях употребления алкоголя, которые зависят от типа жидкости⁴⁰^,⁴¹, хотя различия, наблюдаемые в этих исследованиях, не ограничивались только потреблением воды. Продолжительность истории употребления алкоголя может играть роль в различиях, наблюдаемых между исследованиями, поскольку выбор двух бутылок был ограничен 5 неделями в текущем наборе данных, тогда как в предыдущей работе он превышал 12 недель⁴⁰^,⁴¹.

figure-results-1
Рисунок 1: Выбор двух бутылок в домашней клетке. (А) Исследователи могут измерить добровольное потребление этанола в клетке и предпочтение (относительно воды) с помощью стандартного подхода, который рассчитывает потребление на основе изменения веса бутылки. (B) Используя LIQ HDR, недорогую систему обнаружения облизывания домашних клеток, предназначенную для крыс, исследователи могут получить те же измерения, что и в стандартной процедуре выбора двух бутылок, а также захватить микроструктуру питья с высоким разрешением в течение всего периода записи. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-2
Рисунок 2: Создание емкостных сенсорных блоков. (A) Электронные детали и электрические схемы. (B) Материалы для создания трех емкостных сенсорных блоков, необходимых для создания одной системы LIQ HDR. (C) Припаяйте 2-контактные кабели гнездового разъема для каркасов #1-6 к плате A контакт #0-11 и закрепите паяные соединения горячим клеем. Цветная маркировка кабелей с цветными термоусадочными трубками и маркировка каждого с уникальным идентификационным номером ликометра. (D) Подключите плату A и переключатель уровня 5 В на 3 В к дифференциальному коммуникационному выключателю I²C EndPoint с помощью 4-контактных кабелей (1), а также разместите плату A и коммуникационный выключатель в напечатанном на 3D-принтере корпусе (2-3). (E) Измените адреса I²C плат B и C, припаяв перемычку от контакта ADDR к контактам 3Vo и SDA соответственно. (F) Припаяйте кабели 2-контактного гнездового разъема к платам датчиков B и C, пометьте соответствующими идентификаторами ликометра и подключите плату B к коммуникационному разъему MidPoint и плату C к EndPoint с помощью 4-контактных кабелей. (G) Разместите сенсорные блоки B и C в соответствующих 3D-печатных корпусах и последовательно подключите все три блока кабелями Ethernet. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-3
Рисунок 3: Соберем ликометр LIQ HDR. (A) 3D-визуализация компонентов в каркасе. (Б) Материалы для настройки одного двухбутылочного лизометра. Обратите внимание, что одна система LIQ HDR вмещает 18 двухбутылочных лизометров. (C) Увеличьте длину 2-контактного кабеля штекерного разъема с помощью пары черных и красных проводов и цветовой кодировки с термоусадочной трубкой. (D) Проденьте черный и красный провода через левое (L) и правое (R) отверстия на держателе для бутылок (1) и припаяйте концы к медным лентам (2-3). (E) Приклейте медные ленты к внутренним стенкам кронштейнов сиппера (1-2) и укрепите их горячим клеем (3-4). (F) Проденьте кабель через протектор кабеля. (G) Установите зажим для кабеля. (H) Пометьте разъем соответствующим идентификационным номером ликометра. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-4
Рисунок 4: Установка ликометра. (A) Используйте изоленту для изоляции металлических стержней вокруг отверстий для поглотителей на металлической крыше клетки. (B) Установите лизометр и акриловую панель на верхнюю часть клетки с помощью двух наборов винтов и гаек M5. (C) Закрепите зажим кабеля на крайнем стержне верхней части проволочной клетки. (D) Убедитесь, что вы используете соответствующий протектор кабеля (левый L или правый R) для каждой клетки. (E) Убедитесь, что только ~2 см потягивателей для бутылок открыты (1), чтобы при размещении бутылок на клетке (2) только самые кончики глотков выходили за пределы акриловой панели и были доступны для крыс. (F) Верхняя часть фильтра должна прилегать к зажиму кабеля, не нарушая сам кабель. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-5
Рисунок 5: Установка и использование блокиратора Sipper. (A) 3D рендеринг блокиратора сиппера. (B) Изготовленные на заказ 3D-печатные детали для одного блокиратора sipper. (C) Соберите детали, напечатанные на 3D-принтере. (D) Установите собранный блокиратор сиппера на верхнюю часть клетки с помощью винта M5 + гайки + шайбы. (E) Поверните диск по часовой стрелке, чтобы перекрыть доступ к глоткам. (F) Поверните диск против часовой стрелки, чтобы удалить блокираторы из глотков (1), поднимите блокираторы и поверните их на 90° (2) и продолжайте вращать диск против часовой стрелки, пока блокираторы не окажутся над столешницей клетки (3-4). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-6
Рисунок 6: Настройка Vivarium и работа с графическим интерфейсом. (A) Рекомендуемая конфигурация вивария и электрическая схема. (B) Установите каждый сенсорный блок на стеллаж и расположите и стабилизируйте кабели датчиков на стеллаже. (C) Установите интерфейс микроконтроллера на стеллаж и подключите его 4-контактную перемычку к переключателю уровня 5 В на 3 В, подключенному к блоку датчиков A. (D) Закрепите дополнительный провод заземления изолентой. (E) Подсоедините кабели датчиков к соответствующим кабелям ликометра. (F) Подключите блок питания, чтобы включить интерфейс микроконтроллера. (G) Главная страница графического интерфейса. (H) Нажмите «Настройки», чтобы настроить время включения/выключения света в соответствии с расписанием освещения вивария (1), и нажмите «Настройки датчика», чтобы настроить пороги касания и отпускания для крыс (2). (I) Чтобы записать данные, выберите сторону бутылки EtOH на главной странице, нажмите СТАРТ! , чтобы откалибровать датчики (1), и начните запись (2). Нажмите «Обновить», чтобы обновить отображаемое на экране число щелчков, и нажмите «Сохранить и закрыть», чтобы остановить запись. (J) Нажмите «Извлечь SD» на главной странице, чтобы извлечь SD-карту и перенести данные. Нажмите «Подключить SD» после установки SD-карты. (K) Скриншот репрезентативного файла необработанных данных, иллюстрирующий, как данные о микроструктуре сохраняются в ячейке за 1 минуту интерфейсом микроконтроллера. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-7
Рисунок 7: Репрезентативные данные о выборе двух бутылок, полученные с помощью стандартной процедуры. В парадигме питья EtOH в домашних клетках с прерывистым доступом (A) крысы получают 20% (v/v) раствора EtOH (оранжевый) и H₂O (синий) по понедельникам, средам и пятницам (MWF), а также две бутылки, содержащие H₂O по вторникам, четвергам и выходным. (В) Измерения ежедневного потребления жидкости показывают, что в то время как крысы поддерживают относительно постоянный уровень общего потребления жидкости (мл) на протяжении всего периода исследования, (В) крысы часто демонстрируют увеличение потребления этиОН в течение первых нескольких сеансов питья, после чего уровень потребления стабилизируется. (D) Эта модель эскалации и поддержания аналогичным образом отражается в предпочтении этиленоксида. Исследователи также могут зафиксировать потребление EtOH (E) в виде запоя, если вес бутылки был собран после первых 30-60 минут начала сеанса. (F) Это часто связано с высоким предпочтением EtOH по сравнению с H₂O. Закрашенные полосы погрешностей представляют ± SEM (n = 32 для мужчин и n = 16 для женщин). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-8
Рисунок 8: LIQ HDR точно фиксирует потребление с высоким временным разрешением. Точность и аккуратность системы LIQ HDR подтверждается, в частности, наличием значимой положительной корреляции между количеством облизываний и изменением веса бутылки в дни, когда крысы получают (A) H2 O и EtOH, а также (B) дни, когда обе бутылки содержат H₂O. (C) Различия в режимах питья между_H2O (синий) и EtOH (оранжевый) в течение 24-часового периода употребления можно легко оценить, разделив средние дозы на 30-минутные интервалы. Врезка соответствует среднему количеству облизываний в 5-минутных контейнерах в течение первых 30 минут доступа к бутылке (выделено серым цветом), в течение которого крысы часто демонстрируют значительное поведение при фронтальной загрузке. Различия между группами в моделях употребления алкоголя также могут быть изучены с использованием аналогичного подхода, примером чего является микроструктура лизания для (D) EtOH и (E) _H2O, изображенная у самцов и самок крыс в течение 24 часов. (F) Модели употребления алкоголя также могут быть оценены с высоким временным разрешением в течение более короткого периода тестирования, (G) в течение которого LIQ HDR продолжает точно отслеживать потребление и (H) прогнозировать концентрацию этанола в крови (BEC) даже при относительно низких уровнях потребления этанола. Закрашенные полосы погрешностей представляют ± SEM (n = 6 для каждого пола). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-9
Рисунок 9: Репрезентативные данные о микроструктуре питья. LIQ HDR позволяет фиксировать показатели микроструктуры питья, включая (A) количество выпивок, (B) количество питьевых напитков и (C) продолжительность питья, в дополнение к (D) измерению общего потребления воды путем изменения веса бутылки. (Э-Х) Аналогичные меры можно получить и для этанола. Межгрупповое сравнение этих показателей может выявить различные модели употребления алкоголя, как в данном примере, который выявляет половые различия в стратегиях употребления алкоголя в зависимости от потребляемого раствора. сплошной линией обозначена медиана, а пунктирными линиями обозначены квартили (n = 6 для каждого пола); непарный t-критерий; *p < 0,05. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительный рисунок 1: Настройка интерфейса микроконтроллера. (A) Электронные детали и электрические схемы. (B) Материалы для создания интерфейса микроконтроллера, необходимого для одной системы LIQ HDR. (C) На обратной стороне емкостного сенсорного экрана добавьте паяльную перемычку через задние мягкие паяльные площадки. (D) На тыльной стороне экрана регистрации данных разрежьте дорожку перемычки контакта CS (1). Припаяйте провод перемычки от контакта CS к контакту #7 (2). (E) Припаяйте контакты разъема к регистратору данных, используя сенсорный экран в качестве основания. (F) Установите оставшийся разъем 2x4 в микроконтроллер (1), установите регистратор данных на микроконтроллере и припаяйте разъем на место (2). (G) Вставьте батарейку типа «монета» в регистратор данных (1), установите сенсорный экран на регистратор данных и вставьте SD-карту в регистратор данных (2). (H) Чтобы сделать дополнительный провод заземления, отрежьте один штекерный разъем от провода перемычки и припаяйте конец к зачищенному проводу с твердым сердечником. (I) Подсоедините 4-контактные соединительные провода и дополнительный провод заземления к микроконтроллеру (1) и закрепите горячим клеем (2). (J) Разместите интерфейс микроконтроллера в специальном корпусе, напечатанном на 3D-принтере. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Текущий протокол содержит пошаговые инструкции по сбору данных о потреблении этанола с использованием процедуры прерывистого доступа в домашней клетке с двумя бутылками. Этот метод может быть реализован с относительной легкостью и практически без затрат или необходимости в специализированном исследовательском оборудовании. Используя представленные здесь процедуры для создания и внедрения LIQ HDR - системы обнаружения облизывания для использования на крысах - исследователи могут захватывать данные о микроструктуре питья с высоким разрешением в дополнение к стандартным показателям потребления и предпочтений.

График прерывистого доступа, описанный в настоящем протоколе, является широко используемой процедурой в значительной степени потому, что хорошо известно, что он приводит к более высоким уровням потребления этанола, чем многие альтернативные графики доступа к этанолу. Действительно, предыдущие исследования показали, что крысы с прерывистым доступом имеют более высокое среднесуточное потребление этанола, чем крысы с непрерывным 24-часовым доступом ^6,7. Тем не менее, в зависимости от исследовательского вопроса или других параметров экспериментального плана могут быть желательны различные графики доступа к этанолу. Исследователи могут очень легко модифицировать текущий протокол, чтобы приспособиться к различным графикам (например, непрерывный доступ, питье в темноте и т. д.), просто изменяя время и дни включения/выключения бутылки.

Несмотря на то, что выбор двух бутылок является относительно простой в реализации парадигмой, могут возникнуть проблемы, которые могут поставить под угрозу сбор данных. Поэтому крайне важно, чтобы экспериментаторы ежедневно проверяли данные, чтобы быстро выявлять потенциальные проблемы. В частности, исследователи должны обращать пристальное внимание на очень большие или очень малые изменения веса бутылки, которые могут указывать на протекающий или забитый глоток соответственно. Раннее выявление признаков этих проблем может предотвратить исключение всех данных по данному предмету из анализа. Действительно, если исследователи заметят резкие изменения (или их отсутствие) в весе бутылки в течение 24 часов, простое переключение на новую бутылку может помочь подтвердить, следует ли изъять данную бутылку из обращения. По этим причинам разумно иметь под рукой дополнительные бутылки и глотки. Однако следует отметить, что некоторые крысы от природы демонстрируют очень низкий уровень потребления этанола, например, ³⁵. Это особенно верно для крыс определенных линий, см.⁸ для обзора. Таким образом, исследователям не следует беспокоиться, если небольшая популяция животных в данном эксперименте имеет низкое потребление этанола или вообще не потребляет его. Кроме того, некоторые животные склонны играть с глотком/бутылкой таким образом, что это может способствовать разливу. Хотя и редко, но повторяющиеся случаи значительных изменений веса бутылки, которые не связаны с потреблением, могут потребовать исключения конкретного животного из эксперимента.

Наш подробный пошаговый протокол демонстрирует простоту внедрения и использования системы LIQ HDR для крыс. Исследователи, не обладающие предварительными знаниями или навыками в области микроконтроллерной электроники и программирования, могут легко адаптировать эту систему к своим экспериментальным потребностям с минимальными изменениями или без них. Наши репрезентативные данные еще раз демонстрируют его успешное применение для исследований употребления алкоголя в клетках для крыс и его мощную способность фиксировать многочисленные показатели микроструктуры питья с высоким временным разрешением. LIQ HDR включает в себя несколько конструктивных изменений относительно своей предшественницы^{мыши 30}. Это было сделано не только для успешной адаптации к использованию на крысах, но и для улучшения функциональности и пользовательского опыта. Компоненты клетки, в том числе напечатанный на 3D-принтере держатель для бутылок, блокиратор для питья и электронные компоненты, перемещены в верхнюю часть клетки для защиты от жевания, что может привести к частой и значительной потере данных и обороту оборудования. Добавление акриловой панели, вырезанной лазером, еще больше помогает предотвратить разрушение этих уязвимых компонентов. За исключением акриловой панели, которая изготовлена из того же материала, что и стандартная клетка для крыс в обувной коробке, все остальные компоненты LIQ HDR недоступны для животного изнутри клетки или доступны только на короткое время во время смены бутылки. Такая конструкция ограничивает возможность разрушения компонентов устройства и риск для животного при проглатывании непищевых предметов. В отличие от относительно трудоемких бутылок, изготовленных на заказ, используемых в дизайне LIQ HD, держатель для бутылок, напечатанный на 3D-принтере LIQ HDR, разработан таким образом, чтобы быть совместимым с коммерческими готовыми бутылками для питья грызунов. Бутылочки устанавливаются на верхней части клетки и доступны для крыс во многом так же, как бутылочки для питья применяются во время стандартного ухода и содержания. Добавление блокираторов sipper является простым, но эффективным решением, которое повышает надежность системы и предотвращает потерю ценных данных, которая в отсутствие блокиратора может произойти в результате употребления алкоголя до начала сбора данных на интерфейсе Arduino, или ошибочных измерений лизуния, которые происходят при взаимодействии крыс с сипперами во время ежедневной калибровки. В то время как значительно большие клетки для крыс требуют увеличения оригинальной конструкции оборудования в размерах, использование значительно более длинных кабелей может негативно повлиять на чувствительность и точность емкостного считывания из-за помех, а также на целостность связи I^2Cмежду последовательно подключенными сенсорными платами и интерфейсом Arduino. Мы обошли эту проблему, внедрив систему дифференциальной связи I²C для обеспечения сверхдальней передачи сигнала без потерь по кабелям Ethernet. Материалы, из которых изготовлены компоненты в клетке, обеспечивают легкую очистку и дезинфекцию между использованиями. Лизометр можно стерилизовать и протереть 70% раствором этиленоксида, при этом необходимо следить за тем, чтобы электрические компоненты, такие как проводящая медная лента, оставались неповрежденными. Неэлектрическое оборудование, находящееся в непосредственном контакте с животным, такое как блокиратор воды и акриловая панель, можно тщательно промыть теплой мыльной водой.

Надежность и эффективность любой системы обнаружения слизывания требует надлежащего строительства и установки, а также всестороннего тестирования, тщательного мониторинга ошибок и эффективного поиска и устранения неисправностей. Все компоненты своими руками должны быть изготовлены и собраны с умением и тщательностью. Это особенно важно для этапов, связанных с пайкой, которые могут потребовать практики для начинающих. Несмотря на это, перед использованием в реальных экспериментах требуется всестороннее тестирование всех лизометров. Если систему необходимо модифицировать для адаптации к индивидуальным экспериментальным потребностям, может потребоваться дополнительная тонкая настройка датчика (например, пороги касания и отпускания) для точного обнаружения облизывания. Для начинающих пользователей мы предлагаем протестировать систему в кратком пилотном исследовании с небольшой выборкой с использованием очень приятного на вкус решения, которое приведет к высокому уровню употребления алкоголя. Обнаружение облизывания можно проверить в режиме реального времени путем визуального осмотра платы датчика, поскольку светодиод мигает при каждой регистрации облизывания. Сильные, значимые и последовательные корреляции между числом лизунов и изменением веса бутылки следует использовать в качестве ориентира для правильной настройки аппаратного и программного обеспечения. Даже после того, как настройка будет завершена, мы рекомендуем начинать запись для конкретного эксперимента в день, когда крысы получают две бутылки с водой, чтобы устранить проблемы с оборудованием, которые могут быть очевидны в начале эксперимента. Также может быть полезно проверить работу лизометра в день воды, связанный со сменой клетки, поскольку для этого необходимо отсоединить лизометр и снова подключить его к датчику. Случайный отказ отдельного лизкометра или датчика, который может привести к очень очевидным отклонениям данных (например, не обнаружено ни одного или несколько облизываний, несмотря на существенное изменение веса бутылки) для одного и того же лизометра, указывает на неисправный компонент (компоненты). Мы рекомендуем заранее подготовить дополнительные компоненты для каждого элемента системы ликометра, чтобы обеспечить легкую замену в случае необходимости. Наконец, невозможно переоценить важность того, чтобы кабели датчиков не перекрывались и не изгибались чрезмерно. Это может привести к случайным случаям плохого обнаружения облизывания, о чем свидетельствует необоснованно низкое число облизывания при данном изменении веса бутылки или чрезвычайно большая продолжительность облизывания (около 60 000 мс для 1-минутной корзины), охватывающая минуты или часы. Тем не менее, небольшие потери данных неизбежны в исследованиях, которые собирают данные в течение 24 часов для многих животных в течение многих дней с использованием стандартного подхода или подхода, оснащенного ликометром. Исследователи могут исключить ошибочные данные для редких сеансов питья, когда вес бутылки и/или облизывание явно не отражают потребление (например, засорение глотка, ошибка калибровки и т. д.). В таких случаях среднее значение для данного показателя (например, потребление (г/кг), облизывание и т.д.) за период исследования для этого конкретного субъекта может быть заменено отсутствующим значением во время анализа данных. ANOVA со смешанными эффектами также можно использовать в качестве альтернативы для размещения отсутствующих точек данных.

Одним из преимуществ парадигмы выбора двух бутылок является добровольный аспект потребления этанола. Это дает отличную лицевую достоверность, особенно в свете результатов, показывающих, что употребление алкоголя экспериментатором может оказывать значительно иное воздействие на функции мозга и поведение по сравнению с добровольным самостоятельным приемом^{алкоголя.} Более того, добровольный характер парадигмы позволяет исследователям фиксировать индивидуальные различия в потреблении, аналогичные вариативности предпочтений алкоголя и моделей употребления алкоголя, наблюдаемой у людей. Эти индивидуальные различия могут предоставить исследователям прекрасную возможность соотнести потребление (потребление и/или модели) с величиной наблюдаемых патологических эффектов.

Тем не менее, следует учитывать некоторые ограничения парадигмы питья в домашних клетках с двумя бутылками. Например, хотя индивидуальная вариабельность потребления этанола может быть полезной для некоторых экспериментов, она может быть недостатком в других экспериментах, где может быть желателен постоянный уровень интоксикации или воздействия этанола. Это особенно верно для экспериментов, изучающих последствия зависимости и отказа от хронического воздействия этанола. Важно отметить, что употребление алкоголя в двух бутылках не характеризуется как модель зависимости - даже у крыс с доступом к этанолу в течение длительных периодов времени. Таким образом, при отсутствии сопутствующих симптомов абстиненции исследователи должны проявлять осторожность при интерпретации последствий длительного потребления этанола как эффектов зависимости и/или абстиненции. Действительно, возможно, если не правдоподобно, что крысы, пьющие относительно большое количество этанола во время процедуры выбора двух бутылок, проявляют симптомы абстиненции, но что крысы, пьющие меньшие объемы в течение данного 24-часового периода, не проявляют подобных признаков зависимости. Режим питья также может играть важную роль в этом рассмотрении, поскольку два животных, пьющих одно и то же количество в течение 24 часов, могут испытывать совершенно разные уровни интоксикации (т.е. BEC) в зависимости от^{характера потребления ими} этанола. Это подчеркивает полезность LIQ HDR в процедуре выбора двух флаконов, поскольку он может легко идентифицировать крыс, которые потребляют данную дозу этанола с высокой скоростью (т.е. глотком), по сравнению с теми, кто потребляет ту же дозу гораздо медленнее (т.е. глотком). Хотя это потенциально нежелательно для исследований, изучающих эффекты контролируемой дозы этанола, обнаружение изменений в привычках употребления алкоголя (например, уменьшение эпизодов запоя) после конкретного экспериментального вмешательства имеет значительную трансляционную ценность, учитывая подход к снижению вреда, который все чаще применяется в клиниках. Наконец, не требуется никаких усилий для того, чтобы животные получили доступ к этанолу в домашних клетках, включая описанную здесь. Таким образом, полезность этой парадигмы ограничена только анализом употребления алкоголя, в то время как оперантные методы предпочтительны в тех случаях, когда исследователи заинтересованы в изучении поиска алкоголя, что является важной особенностью AUD.

Таким образом, описанный здесь протокол предоставляет исследователям всю информацию и ресурсы, необходимые для измерения потребления этанола крысами в домашних условиях. Мы представляем варианты подходов с относительно низким и высоким разрешением, предоставляя исследователям гибкость в выборе метода, который наиболее подходит для их исследовательских потребностей.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы благодарят Джозефа Питока и Кэти Пшибыш, доктора философии, за техническую помощь во время разработки LIQ HDR. Мы также благодарим Николаса Петерсена и доктора философии Мари Дойл за множество полезных бесед во время разработки LIQ HDR. Эта работа была поддержана Национальным институтом злоупотребления алкоголем и алкоголизма при Национальных институтах здравоохранения (P50 AA022538 и R01 AA029130 EJG).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
<прочный>коммерчески доступные компоненты			<сильный>Количество
12-клавишный емкостный сенсорный датчик разрыв (MPR121)	Adafruit	1982	3
2-контактная пара кабелей (шаг JST XH 2,5 мм)	Adafruit	4872	18
4-контактная перемычка на макетной плате (Qwiic)	SparkFun	PRT-17912	1
4-контактный кабель (100 мм Qwiic)	SparkFun	PRT-17259	1
4-контактный кабель (50 мм Qwiic)	SparkFun	PRT-17260	3
Переключатель уровня 5 В на 3 В прорыв	Adafruit	5637	1
Емкостный сенсорный экран (2,8 дюйма)	Adafruit	1947	1
Медная проводящая лента (1/4 дюйма)	DigiKey	4393-CFT-1/4-ND	1
Данные Щиток для лесозаготовок	Adafruit	1141	1
Дифференциал I2C коммуникационного выключателя (QwiicBus)	SparkFun	KIT-17250	1
Изолента	DigiKey	3M156004-ND	1
Термоусадочная трубка (3/16 дюйма различных цветов)	Кабельные стяжки и многое другое	HS357-S10	6
Комплект термоусадочных трубок (4 дюйма черный)	Jameco	2095963	1
Литиевая батарейка для монет (3 В 12,5 мм)	DigiKey	1908-CR1220JAUCHSB-ND	1
M5 плоская шайба	Grainger	54FN66	1
M5 шестигранная гайка	Grainger	6CA72	1
M5 машинный винт (12 мм)	Grainger	6GU88	1
M5 машинный винт (25 мм)	Grainger	6GU91	2
Перемычка	Adafruit	1957	1
Плата микроконтроллера (Arduino Mega 2560 Rev3)	DigiKey	1050-1018-ND	1
Нить PETG (2,85 мм серебро)	MatterHackers	M-DDH-UZR2	2
нить PLA (2,85 мм черный)	MatterHackers	M-SEW-RUAW	2
нить PLA (2,85 мм серебро)	MatterHackers	M-66P-6CLE	1
Блок питания (постоянный ток 9 В 1 А)	Newegg	9SIBPPKJYR5991	1
карта памяти SD/microSD (8 ГБ)	Adafruit	1294	1
Разъемы для стекирования щита	Adafruit	85	1
Твердожильный провод (22AWG красный)	Adafruit	288	1
Многожильный провод (22AWG черный)	Adafruit	2976	1
Многожильный провод (22AWG красный)	Adafruit	3068	1
Поворотная трубка с шариком	Альтернативный дизайн	TCCN8.5-ST2.5SB	38
Бутылка для воды (8 унций)	Альтернативный дизайн	WB8FS	38
Изготовленные на заказ 3D-печатные компоненты			Количество
3D-печатное дно корпуса Arduino	Н/Д	ARDUINO_Bottom.stl	1
3D-печатная крышка корпуса Arduino	Н/Д	ARDUINO_Top.stl	1
Напечатанный на 3D-принтере кабельный зажим L	Н/Д	CLIP_L.stl	18
Напечатанная на 3D-принтере гайка кабельного зажима	Н/Д	CLIP_Nut.stl	18
Напечатанный на 3D-принтере кабельный зажим R Н	/Д	CLIP_R.stl	18
Напечатанный на 3D-принтере держатель для бутылок	Н/Д	LICKOMETER_Bottle Holder.stl	19
Напечатанный на 3D-принтере протектор кабеля L	N/A	LICKOMETER_Cable Protector_L.stl	6
Напечатанный на 3D-принтере протектор кабеля R	N/A	LICKOMETER_Cable Protector_R.stl	12
Напечатанные на 3D-принтере буквы ликометра	N/A	LICKOMETER_Letters.stl	19
Напечатанный на 3D-принтере крепежный винт	N/A	Mount Screw.stl	4
Напечатанный на 3D-принтере чехол для датчика A снизу	Н/Д	SENSOR_A_Bottom.stl	1
Напечатанный на 3D-принтере чехол для датчика A сверху Н	/Д	SENSOR_A_Top.stl	1
Напечатанный на 3D-принтере корпус датчика B низ	Н/Д	SENSOR_B_Bottom.stl	1
Напечатанный на 3D-принтере чехол для датчика B сверху	Н/Д	SENSOR_B_Top.stl	1
Напечатанный на 3D-принтере чехол для датчика C низ	Н/Д	SENSOR_C_Bottom.stl	1
Напечатанный на 3D-принтере чехол для датчика C верх	Н/Д	SENSOR_B_Top.stl	1
Напечатанный на 3D-принтере корпус датчика буквы	Н/Д	SENSOR_Letters.stl	1
Напечатанный на 3D-принтере блокиратор	Н/Д	SIPPER_Blocker.stl	36
Напечатанный на 3D-принтере блокиратор	Н/Д	SIPPER_Base.stl	18
Напечатанный на 3D-принтере блокиратор свиребер Снаряжение	Н/Д	SIPPER_Gear.stl	18
Напечатанная на 3D-принтере гайка блокиратора	Н/Д	SIPPER_Nut.stl	18
Напечатанный на 3D-принтере червяк-блокиратор	Н/Д	SIPPER_Worm.stl	18
Вырезанная лазером акриловая панель Н	/Д	LICKOMETER_Acrylic Panel_Sketch.dxf	19

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

GBD 2016 Alcohol Collaborators. Alcohol use and burden for 195 countries and territories, 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. Lancet. 392 (10152), 1015-1035 (2018).
Fillmore, K. M., Stockwell, T., Chikritzhs, T., Bostrom, A., Kerr, W. Moderate alcohol use and reduced mortality risk: systematic error in prospective studies and new hypotheses. Annals Epidemiol. 17 (5 Suppl), S16-S23 (2007).
GBD 2020 Alcohol Collaborators. Population-level risks of alcohol consumption by amount, geography, age, sex, and year: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2020. Lancet. 400 (10347), 185-235 (2020).
Esser, M. B., Sherk, A., Liu, Y., Naimi, T. S. Deaths from excessive alcohol use - United States, 2016-2021. Morbidity Mortality Weekly Rep. 73, 154-161 (2024).
Melendez, R. I. Intermittent (every-other-day) drinking induces rapid escalation of ethanol intake and preference in adolescent and adult C57BL/6J mice. Alcohol Clin Exp Res. 35 (4), 652-658 (2011).
Wise, R. A. Voluntary ethanol intake in rats following exposure to ethanol on various schedules. Psychopharmacologia. 29 (3), 203-210 (1973).
Simms, J. A., et al. Intermittent access to 20% ethanol induces high ethanol consumption in Long-Evans and Wistar rats. Alcohol Clin Exp Res. 32 (10), 1816-1823 (2008).
Carnicella, S., Ron, D., Barak, S. Intermittent ethanol access schedule in rats as a preclinical model of alcohol abuse. Alcohol. 48 (3), 243-252 (2014).
Loi, B., et al. Increase in alcohol intake, reduced flexibility of alcohol drinking, and evidence of signs of alcohol intoxication in Sardinian alcohol-preferring rats exposed to intermittent access to 20% alcohol. Alcohol Clin Exp Res. 34 (12), 2147-2154 (2010).
Rhodes, J. S., Best, K., Belknap, J. K., Finn, D. A., Crabbe, J. C. Evaluation of a simple model of ethanol drinking to intoxication in C57BL/6J mice. Physiol Behavior. 84 (1), 53-63 (2005).
Thiele, T. E., Navarro, M. "Drinking in the dark" (DID) procedures: a model of binge-like ethanol drinking in non-dependent mice. Alcohol. 48 (3), 235-241 (2014).
Rimondini, R., Sommer, W., Heilig, M. A temporal threshold for induction of persistent alcohol preference: behavioral evidence in a rat model of intermittent intoxication. J Studies Alcohol. 64 (4), 445-449 (2003).
Sommer, W. H., et al. Upregulation of voluntary alcohol intake, behavioral sensitivity to stress, and amygdala crhr1 expression following a history of dependence. Biol Psychiatry. 63 (2), 139-145 (2008).
Nentwig, T. B., et al. The lateral habenula is not required for ethanol dependence-induced escalation of drinking. Neuropsychopharmacol. 47 (12), 2123-2131 (2022).
Becker, H. C., Lopez, M. F. Increased ethanol drinking after repeated chronic ethanol exposure and withdrawal experience in C57BL/6 mice. Alcohol Clin Exp Res. 28 (12), 1829-1838 (2004).
Lopez, M. F., Becker, H. C. Effect of pattern and number of chronic ethanol exposures on subsequent voluntary ethanol intake in C57BL/6J mice. Psychopharmacology. 181 (4), 688-696 (2005).
Griffin, W. C., Lopez, M. F., Becker, H. C. Intensity and duration of chronic ethanol exposure is critical for subsequent escalation of voluntary ethanol drinking in mice. Alcohol Clin Exp Res. 33 (11), 1893-1900 (2009).
Hwa, L. S., et al. Persistent escalation of alcohol drinking in C57BL/6J mice with intermittent access to 20% ethanol. Alcohol Clin Exp Res. 35 (11), 1938-1947 (2011).
Vierkant, V., Xie, X., Wang, X., Wang, J. Experimental models of alcohol use disorder and their application for pathophysiological investigations. Curr Prot. 3 (6), e831(2023).
Greenfield, T. K., et al. Risks of alcohol use disorders related to drinking patterns in the U.S. general population. J Studies Alcohol Drugs. 75 (2), 319-327 (2014).
Rehm, J., Greenfield, T. K., Rogers, J. D. Average volume of alcohol consumption, patterns of drinking, and all-cause mortality: results from the US National Alcohol Survey. Am J Epidemiol. 153 (1), 64-71 (2001).
Grant, K. A., et al. Drinking typography established by scheduled induction predicts chronic heavy drinking in a monkey model of ethanol self-administration. Alcohol Clin Exp Res. 32 (10), 1824-1838 (2008).
Nathan, P. E., O'Brien, J. S. An experimental analysis of the behavior of alcoholics and nonalcoholics during prolonged experimental drinking: A necessary precursor of behavior therapy. Behav Ther. 2 (4), 455-476 (1971).
Godynyuk, E., Bluitt, M. N., Tooley, J. R., Kravitz, A. V., Creed, M. C. An open-source, automated home-cage sipper device for monitoring liquid ingestive behavior in rodents. eNeuro. 6 (5), (2019).
Frie, J. A., Khokhar, J. Y. An open source automated two-bottle choice test apparatus for rats. HardwareX. 5, e00061(2019).
Melo, M. C., Alves, P. E., Cecyn, M. N., Eduardo, P. M. C., Abrahao, K. P. Development of eight wireless automated cages system with two lick-o-meters each for rodents. eNeuro. 9 (4), (2022).
Wong, K., et al. Socially integrated polysubstance (SIP) system: An open-source solution for continuous monitoring of polysubstance fluid intake in group housed mice. Addiction Neurosci. , (2023).
Frie, J. A., Khokhar, J. Y. FARESHARE: An open-source apparatus for assessing drinking microstructure in socially housed rats. NPP-Digit Psychiatry Neurosci. 2 (1), 1-7 (2024).
Zhao, Z., et al. INGEsT: An open-source behavioral setup for studying self-motivated ingestive behavior and learned operant behavior. bioRxiv. , (2024).
Petersen, N., Adank, D. N., Raghavan, R., Winder, D. G., Doyle, M. A. LIQ HD (Lick Instance Quantifier Home Cage Device): An open-source tool for recording undisturbed two-bottle drinking behavior in a home cage environment. eNeuro. 10 (4), (2023).
Trujillo, J. L., Roberts, A. J., Gorman, M. R. Circadian timing of ethanol exposure exerts enduring effects on subsequent ad libitum consumption in C57 mice. Alcohol Clin Exp Res. 33 (7), 1286-1293 (2009).
Nentwig, T. B., Margaret Starr, E., Judson Chandler, L., Glover, E. J. Absence of compulsive drinking phenotype in adult male rats exposed to ethanol in a binge-like pattern during adolescence. Alcohol. 79, 93-103 (2019).
Patwell, R., Yang, H., Pandey, S. C., Glover, E. J. An operant ethanol self-administration paradigm that discriminates between appetitive and consummatory behaviors reveals distinct behavioral phenotypes in commonly used rat strains. Neuropharmacology. 201, 108836(2021).
Bito-Onon, J. J., Simms, J. A., Chatterjee, S., Holgate, J., Bartlett, S. E. Varenicline, a partial agonist at neuronal nicotinic acetylcholine receptors, reduces nicotine-induced increases in 20% ethanol operant self-administration in Sprague-Dawley rats. Addict Biol. 16 (3), 440-449 (2011).
Mill, D. J., Bito-Onon, J. J., Simms, J. A., Li, R., Bartlett, S. E. Fischer rats consume 20% ethanol in a long-term intermittent-access two-bottle-choice paradigm. PloS One. 8 (11), e79824(2013).
Carnicella, S., Amamoto, R., Ron, D. Excessive alcohol consumption is blocked by glial cell line-derived neurotrophic factor. Alcohol. 43 (1), 35-43 (2009).
Moore, C. F., Lynch, W. J. Alcohol preferring (P) rats as a model for examining sex differences in alcohol use disorder and its treatment. Pharmacol Biochem Behav. 132, 1-9 (2015).
Pitock, J. R., et al. Presence of distinct operant phenotypes and transient withdrawal-induced escalation of operant ethanol intake in female rats. bioRxiv. , (2024).
Carnicella, S., Yowell, Q. V., Ron, D. Regulation of operant oral ethanol self-administration: a dose-response curve study in rats. Alcohol Clin Exp Res. 35 (1), 116-125 (2011).
De Oliveira Sergio, T., et al. Sex- and estrous-related response patterns for alcohol depend critically on the level of compulsion-like challenge. Prog Neuro-Psychopharmacol Biol Psychiatry. 133, 111008(2024).
Foo, J. C., Skorodumov, I., Spanagel, R., Meinhardt, M. W. Sex- and age-specific effects on the development of addiction and compulsive-like drinking in rats. Biol Sex Diff. 14 (1), 44(2023).
Moolten, M., Kornetsky, C. Oral self-administration of ethanol and not experimenter-administered ethanol facilitates rewarding electrical brain stimulation. Alcohol. 7 (3), 221-225 (1990).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Моделирование потребления алкоголя грызунами с использованием двухбутылкового питья в домашней клетке и микроструктурный анализ

В этой статье

Краткое содержание

Аннотация

Введение

Протокол

Результаты

Обсуждение

Раскрытие информации

Благодарности

Материалы

Ссылки

Перепечатки и разрешения

Теги

Похожие статьи