Органотипические модельные системы тканей для исследования взаимодействий хозяина и патогена in vitro

Краткое содержание

В настоящем протоколе описывается применение органотипических моделей тканей для исследования взаимодействий хозяина и патогена in vitro. В частности, в описанной модельной системе используется многослойный эпителий полости рта, подвергшийся воздействию микроорганизмов, связанных с биопленками (зубным налетом) в контексте здоровья полости рта в сравнении с заболеванием.

Аннотация

Рекапитуляция интерфейса хозяин-патоген на эпителиальном или слизистом барьере in vitro остается сложной перспективой для биологов-инфекционистов. В то время как монослои эпителия, выращенные в собственном производстве, не имеют истинного представления о ситуации in vivo , коммерчески доступные модели тканей часто упускаются из виду из-за их стоимости и практичности. Тем не менее, при тщательном планировании такие модели предоставляют воспроизводимые платформы для широкого спектра различных приложений. В этой статье мы сообщаем об использовании эпителиальных моделей, которые могут быть использованы для широкого спектра экспериментальных целей для изучения взаимодействий хозяина и патогена в различных экологических нишах, таких как ротовая полость, кожа и слизистая оболочка влагалища. От простых планктонных клеток до сложных биопленочных кокультур, эпителиальные модели используются для оценки адгезии и инвазии микроорганизмов, а также для оценки реакции хозяина на уровне транскрипции и/или белка, с возможностью более детального профилирования с использованием различных омиксных подходов. Кроме того, эти биологические системы могут быть использованы в качестве более точных испытательных стендов для оценки обычной и новой антимикробной активности в сложном микроокружении хозяин-патоген in vitro. Описанные здесь протоколы описывают, как модели обрабатываются по прибытии и подготавливаются в лаборатории для стимуляции совместного культивирования с биопленочными сообществами. Методы подробно описывают, как достигаются экспериментальные результаты с помощью модельных систем, включая обработку тканей, настройку совместного культивирования и генерацию данных. Эти эксперименты включают экспрессию генов хозяина с помощью одно- и мультиплексного анализа количественной ПЦР и обнаружение воспалительных белков с помощью ИФА. В заключение следует отметить, что эпителиальные модели предоставляют полезные системы in vitro для доклинических исследований простых или сложных взаимодействий хозяина и патогена.

Введение

Модельные системы in vitro представляют собой отличные испытательные площадки для исследования взаимодействий хозяина и патогена. Эти органотипические системы нацелены на повторение микроокружения различных экологических ниш, подверженных микробным возмущениям. Был опубликован ряд научных статей с использованием тканевых моделей EpiSkin (ранее SkinEthic) для оценки взаимодействия хозяина и патогена в полости рта 1,2,3,4,5, кожном барьере 6,7,8,9,10,11 и слизистой оболочке влагалища ^5,12,13, в том числе^14,15. В отличие от «двумерной» или «2D» клеточной культуры, которая основана на использовании монослоев эпителиальных клеточных линий, подвергшихся воздействию микроорганизмов, эти коммерчески доступные модели состоят из нескольких слоев дифференцированных клеток, выращенных на границе между воздухом и жидкостью. Несмотря на то, что системы 2D-культур дешевле и часто считаются более воспроизводимыми, они подвержены клеточному повреждению при культивировании с микроорганизмами, что не всегда точно представляет эпителиальные или слизистые барьеры in vivo^16,17.

Последние данные показывают, что «трехмерные» или «3D» методы культивирования становятся все более популярными в различных научных дисциплинах, включая науки о раке, исследования стволовых клеток^{и разработку лекарств.} В контексте биологии инфекций 3D-модели тканей могут быть использованы для исследования взаимодействий между бактериями хозяина, грибами или смешанными видами на границе эпителиального или слизистого барьера в контролируемой микросреде in vitro. Эти модели имеют много преимуществ по сравнению с системами 2D-культивирования, позволяя оценить колонизацию тканей и/или инвазию патогенных организмов или сложных биопленочных сообществ¹⁷, а также оценить реакцию хозяина на многокомпонентном уровне для различных биомаркеров, где 2D-модели иногда ограничены их транскрипционными или протеомными профилями 16,17,18. В конечном счете, доклинические применения таких 3D-систем обширны, что позволяет получить важные исследовательские данные, которые могут быть использованы в моделях in vivo или клинических исследованиях.

В контексте здоровья полости рта и заболеваний понимание воспалительных путей, вовлеченных в поверхность слизистой оболочки полости рта, важно для клиницистов, поскольку это может направлять методы лечения. Предыдущие исследования показали, что «связанные со здоровьем» биопленки могут вызывать минимальные воспалительные реакции 3,19,20,21. Это может быть связано с более низкой микробной биологической нагрузкой, связанной со здоровьем полости рта, или из-за состава биопленки с Streptococcus spp., которая широко считается иммуномодулирующей ^22,23. С другой стороны, биопленки, состоящие из ассоциированных с заболеванием микроорганизмов, таких как Fusobacterium nucleatum и Porphyromonas gingivalis, имеют провоспалительную природу 3,20,24,25,26,27. В обзоре, проведенном Mountcastle et al. в 2020 году, описаны все соответствующие модели кокультуры, которые существовали в то время для микроокружения полости рта¹⁷. Несмотря на то, что таких органотипических моделей много, некоторые из них были выпущены с^28,29 года, остается ряд сложных препятствий, связанных с созданием таких 3D-моделей. Например, эти модели требуют значительной оптимизации и являются весьма трудоемкими и ресурсоемкими в производстве; Воспроизводимость также может быть весьма изменчивой, если ее тщательно не контролировать^16,17. Коммерчески доступные модели обходят эти проблемы, предоставляя платформы для исследования взаимодействий хозяина и патогена в ротовой полости и в других экологических нишах в организме человека.

Подводя итог, можно сказать, что текущий протокол направлен на то, чтобы наметить применение органотипических моделей тканей для исследования взаимодействий хозяина и патогена in vitro в контексте здоровья полости рта и заболеваний. В частности, в описанной модельной системе используется многослойный коммерчески доступный эпителий полости рта, подвергшийся воздействию определенного биопленочного сообщества, представляющего воспалительное заболевание полости рта – гингивит.

Протокол

Следующий протокол включает в себя получение многовидовой биопленки, представляющей гингивит, содержащей в общей сложности 7 видов (видов)^7,30. Три Streptococcus spp., Streptococcus mitis (NCTC 12261), Streptococcus intermedius (DSM 20753) и Streptococcus oralis (NTCC 11427) включены для имитации здоровья полости рта, действуя как первоначальные колонизаторы слюнной пленки. Далее добавляются четыре анаэробных микроорганизма, связанные с переходом от здоровья полости рта к заболеванию: Veillonella dispar (NCTC 11831), Actinomyces naeslundii (DSM 17233) и два подвида Fusobacterium spp. Fusobacterium nucleatum (ATCC 10953) и Fusobacterium nucleatum subspecies (subspp.) vincentii (DSM 19507). Все связанные с этим этапы выполняются асептически либо на огне, либо в безопасном шкафу класса II. Все среды и фосфатно-солевой буфер (PBS), используемые для микробиологических препаратов, перед использованием подвергаются автоклаве, а стерильность оценивается через регулярные промежутки времени в течение протокола. Подробная информация о реагентах и оборудовании, использованных в этом исследовании, приведена в Таблице материалов.

1. Подготовка микробных сообществ к кокультуре

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол описывает образование многовидовой биопленки, представляющей консорциумы, связанные с воспалением ткани десны, также известным как гингивит. Такая модель была использована для оценки реакции хозяина на здоровье полости рта и заболевания, как описано ранее³.

1. Оживите все три вида Streptococcus на кровяных агаровых планшетах (основа Columbia Blood Agar, содержащая 5% стерильной дефибринированной лошадиной крови) из замороженных запасов пористых шариков (коммерчески полученных), содержащих микроорганизмы, хранящиеся при -80^°С. Это достигается за счет использования инокуляционной петли и технологии полосовой пластины.
   1. Инкубировать в течение 24 ч при 37 °C, 5%_CO2, затем выделить 3-4 колонии для размножения в 10 мл среды Триптонного соевого бульона. Культивируют бульоны в течение 16-18 ч при 37 °С, 5%_СО2.
2. Для промежуточных патогенов оживите V. dispar, A. naeslundii, F. nucleatum и F. nucleatum subspp. Винцентии анаэробно на основе анааэробного агара, содержащем 5% стерильной дефибринированной лошадиной крови, в течение 48 ч при 37 °С, перед культивированием в бульоне Шедлера в течение еще 24-48 ч в тех же условиях.
3. После роста грануляторы суспензируют центрифугированием в течение 5 мин, 20 °C при 3000 х г, затем промывают гранулы в 10 мл стерильного PBS (pH 7,2-7,6). Грануляторы снова суспензируют центрифугированием в течение 5 минут при температуре 20 °C при 3000 x g, затем повторите этапы промывки во второй раз. Ресуспендируйте промытые клетки в 10 мл стерильного PBS для нормализации.
4. Стандартизируйте все три вида Streptococcus по отдельности с помощью спектрофотометра с длиной волны 550 нм. Значения поглощения 0,50 (допустимый диапазон от 0,45 до 0,55) указывают на количество клеток ~1 x 10⁸ клеток/мл, как это было определено ранее с помощью метода подсчета клеток Майлза и Мисры³¹. Чтобы добиться этого показателя абсорбции, дополнительно разведите 10 мл промытых клеточных суспензий в стерильном PBS.
5. После стандартизации разбавьте все виды Streptococcus в соотношении от 1:10 до 1 x 10⁷ клеток/мл в смеси бульона Тодда Хьюитта (THB) и среды Roswell Park Memorial Institute (RPMI) в соотношении 1:1. Добавьте 500 мкл клеточных суспензий методом пипетирования в 24-луночный микротитровый тканевый планшет, содержащий диск гидроксиапатита диаметром 13 мм. Оставьте биопленки созревать на 24 ч при 37 °C, 5% CO₂.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Многовидовые биопленки могут быть выращены на различных пероральных субстратах, таких как эмаль, дентин³² и полиметилметакрилатные поверхности зубных протезов^33,34. Для этих моделей также могут быть использованы альтернативные среды, такие как искусственная или синтетическая слюна, хотя следует тщательно рассмотреть вопрос в зависимости от используемых консорциумов микроорганизмов: исследования показали, что выбор питательной среды имеет важное значение для роста биопленки в смешанном сообществе^35,36.
6. На следующий день стандартизируйте четыре анаэробных микроорганизма таким же образом, как описано выше (шаги 1.2-1.4). Суспензию гранулированных клеток промыть дважды, затем нормировать поглощение V. dispar до 0,50 (диапазон от 0,45-0,55) и до поглощения трех оставшихся микроорганизмов до 0,20 (диапазон от 0,18-0,22). После нормализации разбавьте все суспензии в соотношении от 1:10 до 1 x 10⁷ клеток/мл в соотношении 1:1 THB и RPMI.
7. Осторожно удалите неадгезившие клетки и отработанные среды и отбракуйте их из биопленок Streptococcus с помощью пипетирования. Замените лунки с микротитрами на 500 мкл стандартизированных суспензий четырех анаэробов в концентрации 1 x 10⁷ клеток/мл. Культивирование биопленок в течение 24 ч в анаэробных условиях при 37 °С.
8. Через 24 ч удалите неадгезивные клетки и отработанные среды из 7-видовых биопленок и замените 500 мкл стерильной смеси 1:1 среды THB:RPMI. Биопленки оставляют созревать анаэробно при 37 °C в течение 4 дней, при этом среду удаляют и пополняют ежедневно (всего четыре смены среды).
9. На 7-й день многовидовая биопленка полностью созрела и готова к последующим экспериментам. Дважды промойте биопленки 500 мкл стерильного PBS для использования в совместном культивировании.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Биопленки могут быть профилированы с использованием ряда биологических методологий, таких как кПЦР (для оценки состава) и микроскопическое профилирование с конфокальной или электронной микроскопией,^{как описано ранее}.

2. Органотипическая обработка тканей и экспериментальная установка

ПРИМЕЧАНИЕ: Описанная ниже экспериментальная установка включает в себя ткань эпителия полости рта человека (HOE), состоящую из клеток TR146, культивируемых на инертном мембранном фильтре из поликарбоната. Существуют и другие модели, в том числе модели эпидермиса, мочевого пузыря, пищевода, роговицы, десны и вагинального эпителия. Все модели обрабатываются и подготавливаются способом, аналогичным описанному ниже для исследования взаимодействий хозяина и патогена.

1. По прибытии распакуйте и перенесите салфетки и фильтрующие материалы HOE в сейфовый шкаф класса II. Добавьте в общей сложности 1 мл поддерживающей среды, поставляемой вместе с тканью, в 12-луночные планшеты.
2. Стерильным пинцетом удалите поликарбонатные вставки, содержащие HOE, с 24-луночных планшетов и питательного агара, используемого для транспортировки, и перенесите их на 12-луночные планшеты, содержащие среду, убедившись, что под тканью не осталось пузырьков воздуха. Убедитесь, что излишки агара, прикрепленного к боковым сторонам или нижней части вставок, аккуратно удалены с помощью дополнительного пинцета или папиросной бумаги.
3. Инкубируйте модели тканей в течение 24 часов при 37 °C, 5%_CO2 до начала эксперимента для акклиматизации к лабораторным условиям после транспортировки. Следует отметить, что для более длительного поддержания или дальнейшего созревания моделей тканей доступны дополнительные поддерживающие среды или питательные среды.
4. Теперь можно проводить эксперименты по совместному культуре. В приведенном здесь примере удалите 7-видовые биопленки, созданные как указано выше (шаги 1.1-1.9), с их субстратов с помощью ультразвука. Для этого удалите диски с гиалуроновой кислотой, содержащие биопленки, со дна 24-луночных планшетов с помощью иглы 19 G и пинцета, затем перенесите бижутерию, содержащую 1 мл стерильного PBS Дульбекко. Обрабатывайте ультразвуком на частоте 35 кГц в течение 10 минут на ультразвуковой водяной бане.
5. С помощью пинцета осторожно извлеките вкладыши, содержащие модели тканей, после ночной акклиматизации, и добавьте 100 мкл биопленочной суспензии ультразвука непосредственно в ткань путем пипетирования. Используйте нестимулированные контрольные ткани для сравнения. Для этих контрольных тканевых вставок добавьте 100 мкл стерильного PBS Dulbecco's PBS без биопленочной суспензии.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Планктонные клетки, отработанные биопленочные надосадочные жидкости, содержащие диспергированные клетки, или целые биопленки могут быть использованы для модели совместного культивирования вместо биопленочного ультразвука. Различные приложения этих моделей «хозяин-патоген» с использованием различных микробных стимуляторов схематизированы на рисунке 1, как описано в других местах ^{3,5,6,8,13,37,38}.
6. После добавления переложите вкладыши в другой 12-луночный планшет, содержащий 1 мл свежей рабочей среды, снова убедившись, что под вкладышами нет пузырьков воздуха. Инкубируйте планшеты, содержащие модели тканей, в течение 24 часов при 37 °C, 5%_CO2 перед обработкой тканей для последующего применения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Поставщики салфеток могут предоставить дополнительные среды для поддержки непрерывного культивирования ткани после воздействия ультразвуковых агрегатов или биопленок. С этой целью было опубликовано несколько предыдущих моделей, изучающих пролонгированное инокуляцию тканевой биопленки 21,28,39. Для достижения аналогичных результатов с использованием текущей органотипической модели произведите ультразвуковую обработку ткани (как указано выше, шаг 2.6) и оставьте микроорганизмы для прикрепления на 24 часа. Отбросьте остатки микробной суспензии и продолжайте культивирование на границе воздух-жидкость в течение требуемого экспериментального времени.

3. Обработка тканей для получения экспериментальных результатов

ПРИМЕЧАНИЕ: После совместного культивирования модели тканей обрабатываются для получения экспериментальных результатов. Следующие шаги документируют, как РНК извлекается из ткани для транскрипционного профилирования и как отработанная тканевая среда используется для обнаружения белка. Ткань также может быть зафиксирована в формалине, параформальдегиде или аналогичном фиксаторе для гистологической оценки, как описано ранее ^3,6.

1. Во-первых, приготовьте 350 мкл буфера для лизиса RLT в пробирках с уплотнительным кольцом объемом 2,0 мл, содержащих 1% β-меркаптоэтанола и ~100 мкл эквивалента 0,5 мм стеклянных шариков, промытых кислотой.
2. Извлеките вкладыши, содержащие ткань, из среды с помощью пинцета и выбросьте остатки микробной суспензии из вкладыша. Затем удерживайте, перевернуто, на уровне глаз для удобства. С помощью иглы 19 G аккуратно разрежьте ткань и мембрану с нижней части вставки и перенесите в буфер RLT.
   1. Гомогенизируйте ткань через 30 с с помощью настольного гомогенизатора для взбивания шариков, затем извлеките РНК из лизата, следуя инструкциям производителя в наборе для экстракции РНК (см. Таблицу материалов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Экстрагированная РНК используется для синтеза кДНК для профилирования экспрессии генов цитокинов и хемокинов в качестве маркеров воспаления с помощью количественной ПЦР (кПЦР) или секвенирования РНК. КПЦР достигается с помощью мультиплексных массивов, таких как профилограф RT₂ PCR, содержащий лунки с готовыми праймерами для конкретных генов, или реагент на основе зеленого сырья SYBR с последовательностями праймеров собственной разработки и нуклеазным ddH₂O³.
3. Соберите оставшуюся отработанную тканевые среды (~850-900 μл) для протеомных анализов с использованием низко- и высокопроизводительных методологий, таких как ИФА, мультиплексный иммуноферментный анализ или мультиплексный анализ белковых биомаркеров⁷.
4. Используя отработанные тканевые среды, оцените ряд маркеров, связанных с воспалением на уровне белка. Отработанные среды могут быть непосредственно использованы для вышеуказанных методик (шаг 3.3) или храниться при температуре -20 °C или -80 °C. Избегайте многократных циклов замораживания-оттаивания сред для таких анализов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Может потребоваться разбавление среды в соотношении 1:10 в зависимости от тканевого стимулятора для точного протеомного профилирования с использованием ИФА.

Результаты

В этом эксперименте HOE подвергалась воздействию 7-видового биопленочного ультразвука, содержащего микроорганизм, вызывающий переход от здоровья полости рта к воспалению десен (известному как гингивит). Это заболевание возникает из-за воспаления эпителиальной ткани десны или полости рта из-за микробных нарушений из-за накопления зубного налета на поверхности зуба. После стимуляции ткани и отработанные среды используются для транскрипционного и протеомного анализов, как обсуждалось выше. Для этого эксперимента экспрессия генов панели воспалительных биомаркеров была обнаружена в ткани после стимуляции биопленочным ультразвуком (рис. 2). Это было достигнуто с помощью специально изготовленного массива профилографа RT₂ PCR, содержащего 16 различных генов, а экспрессия генов была показана как изменение крат относительно нестимулированной ткани после нормализации к гену хозяйствования GAPDH. Микробная стимуляция увеличивала экспрессию всех генов, за исключением CXCL5, при этом статистические различия наблюдались для NFKB, CCL2, CXCL1, CXCL3, CSF2, CSF3, TNF, IL1A, IL1B и TLR4 (рис. 2A). Наибольшее изменение кратности наблюдалось для CCL2, CXCL1 и CSF3, с увеличением на 16,9, 10,3 и 15,1 соответственно (рисунок 2B).

Отработанные среды HOE использовались для протеомных анализов с целью обнаружения белков, продуцируемых и высвобождаемых тканью после стимуляции. Это полезно для определения того, коррелирует ли экспрессия генов с производством белка. Для этого оценивали экспрессию гена IL8 и высвобождение белка IL-8 в контрольной ткани и ткани, стимулированной биопленкой-ультразвуком (рис. 3). Экспрессию генов оценивали с помощью количественной ПЦР на основе SYBR-green с праймерами для IL8 и GAPDH, как описано ранее³. Экспрессия мРНК IL8 в HOE была увеличена в 8,67 раза после стимуляции биопленочным ультразвуком (рис. 3A). На уровне белка уровни IL-8 количественно определяли с помощью набора IL-8 ELISA. Концентрация IL-8 в отработанных средах была увеличена с ~1,005 нг/мл в контрольной ткани до ~4,245 нг/мл в ткани, стимулированной биопленкой-ультразвуком (рис. 3B).

Рисунок 1: Различные приложения для моделей органотипических культур тканей. Стандартизированные суспензии микроорганизмов наносятся непосредственно на ткань для исследования взаимодействия вида и хозяина (А). Они часто используются для оценки микробной колонизации в течение короткого периода времени (например, <24 ч). Сложные биопленки обрабатываются ультразвуком для исследования воздействия диспергированных клеток или агрегатов биопленки на ткани (В). Это важно, так как ранее было показано, что такие клетки обладают уникальными фенотипами по сравнению с планктонными или биопленочными аналогами; с этой целью неповрежденные биопленки могут быть непосредственно добавлены в ткань с помощью дополнительных вставок меньшего размера для создания соседнего облучения с хозяином (С). Наконец, планктонные клетки добавляют в ткань в соответствующих питательных средах для оценки микробной колонизации, образования биопленки и динамики роста в ткани (D). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Экспрессия генов ткани HOE после стимуляции 7-видовым биопленочным ультразвуковым методом. изменение экспрессии мРНК в общей сложности 15 воспалительных генов, нормализованных к хозяйственному гену, GAPDH, в ткани HOE в контрольных, нестимулированных образцах и при воздействии 100 мкл 7-видового биопленочного ультразвука (А). Три гена (CCL2, CXCL1, CSF3) с наибольшими изменениями экспрессии мРНК показаны на рисунке (B). Статистический анализ проводили с использованием параметрического непарного Т-критерия, при этом значимые изменения отображались как *p < 0,05, **p < 0,01 и ***p < 0,001 соответственно. Данные были нанесены на графики и проанализированы с помощью статистического и графического программного обеспечения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3: Экспрессия гена IL8 и уровни белка IL-8, продуцируемого тканью HOE. Изменение экспрессии мРНК IL8 в тканях HOE, определяемое с помощью количественной ПЦР (А) на основе SYBR-green, и уровни белка IL-8, количественно полученные из отработанных тканевых сред с использованием методики ИФА (В). Статистический анализ проводился с использованием параметрического непарного Т-критерия, при этом значимые изменения отображались как *p < 0,05 и ****p < 0,0001 соответственно. Данные были нанесены на графики и проанализированы с помощью статистического и графического программного обеспечения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Обсуждение

В данной работе описаны методики создания сложной многовидовой модели биопленки, представляющей гингивит, для совместного культивирования с тканью HOE для оценки реакции хозяина после микробной стимуляции. Этот протокол может быть адаптирован для использования при исследовании взаимодействий хозяина и патогена между планктонными клетками, одно-, двух- или смешанными биопленками или диспергированными по биопленке клетками с эпителиальной тканью из различных экологических ниш в организме человека. Использование тканевых моделей для исследования взаимодействий хозяина и патогена является важным шагом вперед по сравнению с предыдущими системами совместного культивирования, которые ограничены двумерными монослоями, которые не всегда точно повторяют ситуацию in vivo, в которой эпителиальная ткань содержит несколько клеточных слоев 16,17,18. Кроме того, существует множество проблем, связанных с выращиванием in vitro многослойных моделей тканей с использованием нескольких клеточных линий и/или выращиванием слоев клеток на границе раздела воздух-жидкость, подверженной загрязнению. Коммерчески доступные ткани обеспечивают воспроизводимую платформу с неизменно высококачественными моделями, сопоставимыми между репликами и партиями, как показано в предыдущих публикациях ^3,7.

Для раздела «Подготовка микробных сообществ к совместному культивированию» включение этих микроорганизмов в модель 7-видового гингивита было выбрано на основе широко идентифицируемых комменсалов и патогенов, связанных с переходом от здоровья полости рта к заболеванию. Как и во всех сложных биопленочных модельных системах in vitro, включение микроорганизмов определяется исследованиями микробиома, относящимися к конкретной здоровой или больной экологической нише. С этой целью мы и другие компании сообщили об использовании биопленки, связанной со здоровьем полости рта, содержащей комменсальные микроорганизмы (например, Streptococcus и Rothia spp.).^3,40,41. Более того, в эти модели могут быть добавлены дополнительные патогены для создания биопленок, связанных с другими заболеваниями. Например, три микроорганизма могут быть добавлены к 7 описанным здесь видам для создания модели заболевания, связанного с периодонтитом³, в то время как грибковый патоген Candida albicans может быть добавлен для увеличения полимикробности, а также добавления слоя сложности между царствами³³. Действительно, стимулирование грибково-бактериальных взаимодействий может иметь огромное значение для различных экспериментальных результатов с использованием таких моделей биопленок in vitro по сравнению с биопленками, содержащими только бактерии⁴². В конечном счете, настоятельно рекомендуется тщательно рассмотреть вопрос о создании новой модели многовидовой биопленки для таких исследований. В то время как включенные микроорганизмы должны быть легко идентифицированы из обширного поиска литературы, для большинства ниш и/или заболеваний они могут не очень хорошо интегрироваться в сложную модель in vitro по разным причинам. Ниже приведены некоторые другие возможные соображения, которые следует учитывать:

Динамика образования биопленки
Образование биопленки in vivo часто включает в себя раннюю, промежуточную и позднюю колонизацию определенными микроорганизмами. Образование наддесневого и поддесневого зубного налета в значительной степени характеризуется первоначальным прикреплением слюнной пленки, обнаруженной на эмали первопроходцами (например, видами Streptococcus ), при этом промежуточные и более поздние патогены требуют их в качестве каркаса для колонизации⁴³. Аналогичное явление было предложено в среде влагалища во время бактериального вагиноза, при котором Gardnerella vaginalis считается первым колонизатором, за которым следуют последующие анаэробы⁴⁴. Однако важно отметить, что это может быть не так для других болезней в других экологических нишах.

Плотность заделки семян для каждого микроорганизма
Микроорганизмы будут иметь разные размеры и/или динамику роста при культивировании in vitro; Поэтому важно учитывать это в процессе стандартизации. Например, C. albicans в 100-150 раз больше по размеру бактериальных клеток^45,46, следовательно, он может требовать добавления в более низкой концентрации, например, 1 x 10⁶ клеток/мл, к таким моделям биопленки.

Видовой антагонизм
Некоторые микроорганизмы (включая те же виды, но разные изоляты, лабораторные и/или клинические штаммы), используемые для этих моделей, могут конкурировать с другими во время формирования биопленки, что приводит к ингибированию роста некоторых видов микроорганизмов47. В исследовании Sadiq et al. подчеркивается, как различные комбинации микроорганизмов могут влиять на биомассу биопленки в результате микробной синергии (или антагонизма)⁴⁸. Хотя изучение таких взаимодействий в рамках модели биопленки может представлять интерес для исследовательских групп (например, при тестировании пре- или пробиотической обработки), другие могут не учитывать такой антагонизм, который может повлиять на многовидовую сложность при создании модели.

Продолжительность созревания биопленки
Крайне важно оптимизировать сроки созревания биопленки, так как это может зависеть от динамики роста включенных микроорганизмов и модельной системы (включая субстраты), используемой для культивирования. Более длительное время созревания может привести к лучшей колонизации более поздних патогенов, но большей гибели клеток в моделях, особенно ранних колонизаторов. И наоборот, более короткое время инкубации может быть важным, если вы хотите исследовать влияние незрелых моделей биопленки на хозяина. В исследовании, проведенном Brown et al., было описано, как одна и та же модель раневой биопленки из 10 видов имела различные воспалительные профили в клетках THP-1 человека при созревании в течение 24 часов, 48 часов и 72 часов, предполагая, что чем менее зрела биопленка, тем она более^{провоспалительна.} Аналогичные результаты можно наблюдать в многослойных моделях тканей. Также важно отметить, что регулярная ежедневная смена среды является необходимостью для минимизации гибели клеток в биопленке, хотя это может быть скорректировано в зависимости от текущих схем лечения, например, при оценке эффектов длительных антимикробных вмешательств.

В разделе «Обработка органотипических тканей, экспериментальная установка и обработка тканей» сроки инкубации могут быть скорректированы в соответствии с потребностями исследователя. Взаимодействие хозяина и патогена может быть исследовано в более ранние временные точки, например, от 1-12 часов, до более поздних временных точек 48 часов и 72 часов, в зависимости от исследовательского вопроса. Во-вторых, поставляются все поддерживающие среды, содержащие антибиотики; Таким образом, при заказе в компанию необходимо обратиться с просьбой удалить их в зависимости от экспериментального дизайна. Несмотря на то, что среда под вкладышем не вступает в прямой контакт с верхней периферией ткани, если только в модели ^6,8 не нанесена рана, удаление антибиотиков может заслуживать рассмотрения при исследовании микробной инвазии в ткань.

Микробный материал, используемый для стимуляции ко-культур, также может быть изменен, как обсуждалось выше, с возможностью оценки планктона, отработанных биопленочных надосадочных линий (отфильтрованных и нефильтрованных), цельных биопленок или инкубации биопленок ультразвуком с тканью. Например, предыдущие данные показали, что тканевые модели, подобные тем, которые предоставлены EpiSkin, являются полезными моделями для изучения планктонных взаимодействий грибов и хозяев: было показано, что клетки C. albicans, Candida auris, Malassezia furfur и Trichophyton rubrum прикрепляются и взаимодействуют со слоями периферических тканей в HOE, реконструированном эпидермисе человека (RHE) или вагинальном эпителии человека, причем некоторые из этих исследований показывают стимуляцию реакции хозяина после грибковой инфекции 1,5,6,11,12,49. Аналогичные публикации существуют для взаимодействия бактерий и хозяина, например, биопленкообразование Cutibacterium acnes, распространенного патогена, связанного с микробиотой кожи головы при перхоти, было изучено на поверхности RHE при культивировании отдельно и с грибковым организмом кожи Malassezia restricta¹⁰. Другие исследовали способность Staphylococcus spp. прикрепляться к RHE, измеряя физико-химические и микробиологические характеристики^{этого взаимодействия бактерии} и хозяина. Н'Диайе и соавторы исследовали, как нейропептид человеческого происхождения, пептид, связанный с геном кальцитонина, влияет на вирулентность Staphylococcus aureus в модели ткани RHE⁵¹. Другие исследовали защитные эффекты пробиотических вмешательств при инфекции Pseudomonas aeruginosa эпителия роговицы¹⁴ человека. Между тем, с точки зрения полимикробов, различные группы изучали влияние смешанных биопленок на различные тканевые субстраты 2,3,7,13.

В целом, эти протоколы и исследования, упомянутые выше, документируют широкий спектр применений органотипических моделей тканей для изучения взаимодействий хозяина и патогена. Несмотря на то, что исследования показали, что модели EpiSkin, в частности модель кожи RHE, хорошо применимы для тестирования косметических продуктов на предмет коррозии/раздражения 52,53,54,55, существуют некоторые ограничения между ними и реальными эксплантамтами тканей ex vivo или другими поставщиками коммерчески доступной ткани ^56,57. Одним из очевидных ограничений может быть то, что все коммерчески доступные модели тканей создаются из клеточных линий в стерильной, «стерильной» среде, что означает, что ткань никогда не подвергалась микробным возмущениям: это может усугубить любую воспалительную реакцию у хозяина, намного превышающую то, что можно было бы наблюдать in vivo или после стимуляции тканевых^{эксплантов} ex vivo. И наоборот, эти лабораторные модельные системы не будут содержать нижележащих соединительных слоев или сосудистой сети, которые можно было бы ассоциировать с тканями in vivo, характеристик, которые могут быть сохранены во время эксплантации тканей ex vivo, и особенностей, влияющих на воспалительные реакции. Действительно, недавний систематический обзор показал, что следует тщательно рассмотреть вопрос об использовании моделей тканей с соответствующей сосудистой сетью, созданных с использованием различных инженерных технологий, включая биоматериалы⁵⁸. Например, в одном недавнем исследовании использовалась матрица на основе фибрина, встроенная в фибробласты десны и микрососудистые эндотелиальные клетки, для создания васкуляризированного эквивалента десневой ткани. Авторы описали дифференциальную воспалительную реакцию в модели после контакта со здоровыми или ассоциированными с заболеванием микроорганизмами⁵⁹. С коммерческой точки зрения, в настоящее время существуют более сложные модели, такие как «модель T-Skin», которая содержит ткань полной толщины, состоящую из дермы, состоящей из фибробластов, наложенных на эпидермис. Было бы интересно посмотреть, как такие сложные модели соотносятся с системами, основанными только на эпидермисе.

Несмотря на то, что ни одна модель не является идеальной, органотипические модели тканей представляют собой многообещающие альтернативы для доклинических испытаний, согласующиеся с рамками, обозначенными тремя «Р» для замены, сокращения и уточнения при проведении исследований на животных. В связи с этим, несмотря на то, что животные модели дают важное представление о сложной патофизиологической природе заболеваний человека, связанных с биопленкой, они имеют очевидные недостатки. Этими 3D-моделями легко манипулировать, что позволяет вносить большие, незначительные изменения в исследования без этического одобрения. Сочетание этих моделей с существующими сложными биопленочными системами, описанными выше, может значительно улучшить наше понимание взаимодействий хозяина и патогена и лучше прогнозировать успех новых методов лечения до проведения исследований in vivo .

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
13 мм диски с гидроксиапатитом (HA)	Plasma Biotal Limited	n/a (изготовлен на заказ)	Субстрат для формирования биопленки полости рта, имитирующий поверхность зуба
19 G игла (40 мм)	VWR	613-2028	Используется для помощи при удалении дисков HA из пластин и для вырезания тканей из вставок
24 хорошо обработанных TC микротитровых пластин с плоским дном с крышками	Научно-лабораторные принадлежности	3524 (упаковка 100 шт.)	Планшеты для культивирования биопленок и экспериментов по совместному культивированию тканей
Стеклянные шарики с кислотным мытьем (425-600 шт; m)	Merck: Sigma-Aldrich	G8772	Для лизиса тканей для улучшения выхода экстракции РНК
Actinomyces naeslundii DSM 17233	Лейбниц институт DSMZ	n/a	Один из микроорганизмов, использованных для комплексной биопленки модели
бисерной мельницы 24 Гомогенизатор (или аналог)	Fisher Scientific	15-340-163	Для лизиса тканей с целью улучшения выхода экстракции РНК
Бижутерия  (7 мл)	Greiner Bio-One	189170 (700 в пакете)	Используется для ультразвуковой обработки биопленки
набор для синтеза кДНК (высокопроизводительный)	Thermo Fisher Scientific	4368814 (для 200 реакций)	синтез кДНК из тканевой РНК
Columbia Blood Agar (CBA) base	Thermo Fisher Scientific	CM0331B (для 500 грамм)	Используется для приготовления планшетов CBA для культивирования аэробных микроорганизмов
Дефибринированная кровь лошади	E& O Laboratories	DHB	Используется в качестве дополнения к планшетам CBA и FAA для культивирования аэробных и анаэробных микроорганизмов
Фосфатно-солевой буфер Dulbecco's Buffered Salt (dPBS: без CaCl2 и MgCl2)Merck	: Sigma-Aldrich	DB537	dPBS для совместной культивирования клеток с биопленочным ультразвуком
Fusobacterium nucleatum ATCC 10953	American Type Culture Collection	n/a	Один из микроорганизмов, использованных для комплексной биопленочной модели
Fusobacterium nucleatum subspecies (subspp.) vincentii DSM 19507	Leibniz Institute DSMZ	n/a	Один из микроорганизмов, использованных для сложной биопленочной модели
GraphPad Prism (Version 10)	GraphPad Software, Inc	n/a	Для создания графов и анализа данных
Набор для ИФА человека IL-8 (набор ИФА без покрытия с пластинами)	Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)	88-8086-86 (для 10 x 96 тестов)	Набор и планшеты для оценки белка отработанных тканевых сред
Эпителий полости рта человека (HOE)	Episkin	н/д (изготовлен на заказ)	Эпителиальная ткань, используемая для модели ко-культуры
Инокуляционные петли (одноразовые, 10 & микро; L, или эквивалент)	Fisher Scientific	12870155 (упаковка 1000 штук)	Для микробиологической культуры в твердых и жидких средах
MicroAmp Fast Reaction 96-луночные планшеты для количественной ПЦР (0,1 мл)	Thermo Fisher Scientific	4346907 (на 10 планшетов)	Для количественной ПЦР профилирования экспрессии генов тканей
Микробанк	Микробанк Про-Лаб Диагностика	PL.170	Хранение и цироконсервация микроорганизмов
Вода без нуклеазы	Thermo Fisher Scientific	AM9935 (10 x 1,5 мл)	Вода класса RT-PCR для экспериментов количественной ПЦР
Чашки Петри (90 мм)	Fisher Scientific (Sterilin)	11309283 (упаковка 500 штук)	Используется для приготовления агаровых планшетов для микробной культуры
фосфатно-солевого буфера (PBS)	Thermo Fisher Scientific	18912014 (упаковка 100 таблеток)	PBS для нормализации микроорганизмов и ступеней промывки биопленки
Rneasy mini kit	Qiagen	74106 (для 250 реакций)	Набор для выделения РНК на основе столбцов для тканей...
Roswell Park Memorial Institute 1640 средний	Merck: Sigma-Aldrich	R7755-10L (для 10 л)	Среды для культивирования биопленки
Массив профилировщика RT2	Qiagen	330171 (заказной)	qPCR массив, содержащий готовые праймеры для профилирования экспрессии генов
Schaedler anaerobe агар основа	Merck: Sigma-Aldrich (Millipore)	91019 (для 500 г)	Используется для приготовления Fastdious Anaerobic Agar plates
Анаэробный бульон Schaedler	Thermo Fisher Scientific	CM0497B (по 500 г)	Жидкая среда для размножения анаэробных микроорганизмов
Screw-cap Beadbug O-Ring tube;	Научные лабораторные принадлежности	Z763837-1000EA (упаковка 1000)	Для использования в гомогенизаторе Bead Mill 24, для лизирования тканей
Ультразвуковая ванна	Fisher Scientific (Fisherbrand)	н/а	Для ультразвуковой обработки биопленок с дисков HA
Streptococcus intermedius DSM 20753	Leibniz Institute DSMZ	n/a	Один из микроорганизмов, использованных для комплексной биопленочной модели
Streptococcus mitis NCTC 12261	National Collection of Type Cultures	n/a	Один из микроорганизмов, использованных для комплексной биопленочной модели
Streptococcus oralis NTCC 11427	Национальная коллекция типовых культур	н/д	Один из микроорганизмов, использованных для комплексной биопленки
модели SYBR-green (qPCRBIO SyGreen Mix Hi-ROX)	PCR Biosystems	PB20.12	SYBR-green mix для qPCR
Бульон Тодда Хьюитта Merck	: Sigma-Aldrich	T1438	Среды для культивирования биопленки
Триптон соевый бульон (TSB) средний	Merck: Sigma-Aldrich	22092 (по 500 г)	Жидкая среда для роста аэробных микроорганизмов
Пинцет (150 мм, Нержавеющая сталь, зубчатый)	RS-Pro	545-187	Используется для перемещения дисков с гиалуроновой кислотой и тканевых вставок/тканевых экстрактов
Универсальные пробирки  (30 мл)	Greiner Bio-One	201150 (400 в мешке)	Сосуды для культивирования микроорганизмов в жидких культурах
Veillonella dispar NCTC 11831	National Collection of Type Cultures	n/a'Один	из микроорганизмов, используемых для комплексной биопленочной модели
бета;-метакаптоэтанола	деактивация РНКазы	Sigma-Aldrich	M3148