Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

ATAC-Seq Библиотечная подготовка нейтрофилов, полученных из костного мозга мышей

1.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/67490

⸱

3 января 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Biomedical Innovation Center, Beijing Shijitan Hospital, Capital Medical University, 2Beijing Key Laboratory for Therapeutic Cancer Vaccines

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

В данной рукописи изложен протокол подготовки библиотеки нейтрофилов ATAC-seq из костного мозга мышей с целью обеспечения оптимальной жизнеспособности нейтрофилов и высокого качества библиотеки. Он предлагает пошаговые инструкции по подготовке BMC, иммуномагнитной сортировке и построению библиотеки, выступая в качестве ценного руководства, особенно для новичков в изучении нейтрофилов.

Аннотация

Анализ на доступный для транспозазы хроматин с секвенированием (ATAC-seq) является мощным высокопроизводительным методом для оценки доступности хроматина и понимания эпигеномной регуляции. Нейтрофилы, как важнейший тип лейкоцитов в иммунных реакциях, претерпевают существенные архитектурные изменения хроматина во время дифференцировки и активации, что значительно влияет на экспрессию генов, необходимую для их функций. ATAC-seq сыграл важную роль в раскрытии ключевых транскрипционных факторов в созревании нейтрофилов, выявлении патоген-специфических эпигеномных сигнатур и идентификации терапевтических мишеней для аутоиммунных заболеваний. Однако чувствительность нейтрофилов к внешней среде затрудняет получение высококачественных данных ATAC-seq. В данной работе мы предлагаем масштабируемый протокол подготовки библиотек ATAC-seq из нейтрофилов, полученных из костного мозга грызунов, с улучшенной иммуномагнитной сепарацией для обеспечения оптимальной жизнеспособности клеток и высокого качества библиотек. Подробно обсуждаются важнейшие элементы, влияющие на качество библиотеки, и принципы оптимизации методологического расширения. Этот протокол будет поддерживать исследователей, которые хотят изучать архитектуру хроматина и эпигеномное перепрограммирование нейтрофилов, продвигая исследования в области фундаментальной и клинической иммунологии.

Введение

Нейтрофилы являются одним из наиболее распространенных и важных типов иммунных клеток у позвоночных, составляя 50-70% лейкоцитовчеловека1. Нейтрофилы играют центральную роль в обнаружении и уничтожении микроорганизмов в организме хозяина. Во время сепсиса зрелые нейтрофилы являются одними из первых, кто реагируетна сепсис2. Они быстро мобилизуются к очагам инфекции с помощью хемотаксиса3, где они борются с патогенами, поглощая микроорганизмы (фагоцитоз), продуцируя NADPH-оксидазу-зависимые активные формы кислорода (дыхательные взрывы), секретируя гранулы (дегрануляция) и формируя нейтрофильные внеклеточные ловушки (НВЛ), которые захватывают и убивают внеклеточные бактерии, как только они достигают места воспаления4. Незрелые нейтрофилы также быстро мобилизуются из костного мозга в периферический кровоток с помощью хемокинов 5,6. Эти нейтрофилы, привлеченные к инфекционному очагу, также высвобождают цитокины, которые участвуют в нескольких физиологических процессах, таких как кроветворение, ангиогенез и заживление ран 7,8. Пациенты с врожденными или приобретенными заболеваниями, которые приводят к снижению количества нейтрофилов, более восприимчивы к инфекциям 9,10. Однако активация нейтрофилов – палка о двух концах. Чрезмерная активация и высвобождение цитокинов могут вызвать повреждение тканей и органов, что приводит к полиорганной дисфункции, если инфекции не контролируются своевременно11,12. Кроме того, нейтрофилы также способствуют развитию различных воспалительных и аутоиммунных заболеваний и могут влиять на прогрессирование рака и метастазирование13,14. Это подчеркивает необходимость изучения регуляции активности нейтрофилов для балансировки эффективного иммунного ответа и предотвращения повреждения хозяина.

У нейтрофилов архитектура хроматина претерпевает отчетливые и динамические изменения в их дифференцировке, миграции и активации, выполняя ключевую регуляторную роль на протяжении всей клеточной жизни. Это путешествие от большого, круглого, богатого эухроматином ядра миелобластов к более углубленному ядру в миелоцитах и метамиелоцитах, а затем к С- или S-образным внутриполосным клеткам и высокодольчатым с плотно упакованным хроматином в полиморфноядерных нейтрофилах15,16, является свидетельством сложности биологии нейтрофилов. Специализированная конфигурация хроматина обеспечивает селективную экспрессию генов, важных для функции нейтрофилов, таких как гены, участвующие в производстве гранул и быстрых транскрипционных реакциях, необходимых дляэффективной элиминации патогенов. Когда нейтрофилы мобилизуются к очагам воспаления с помощью хемотаксиса, трансэндотелиальная миграция оказывает давление на комплекс нуклеоскелет/линкер комплекса цитоскелет (ЛИНК), вызывая ремоделирование хроматина и больший потенциал активации18. При сепсисе активированные нейтрофилы демонстрируют «ядерный сдвиг влево» с аномальной морфологией хроматина, такой как двулопастные или нелопастные ядра и значительно более слабая конденсацияхроматина19. Это приводит к повышенной доступности в областях генов, связанных с воспалительной реакцией, тем самым вызывая значительную экспрессию этих генов. Если инфекции не контролируются должным образом, для образования НВЛ20,21 необходимы цитруллинирование гистонов и последующая деконструкция хроматина. Таким образом, понимание архитектуры нейтрофильного хроматина имеет решающее значение для развития биологии нейтрофилов и разработки методов лечения воспалительных и аутоиммунных заболеваний, давая надежду на будущее лечение заболеваний.

Доступность хроматина служит метрикой для архитектуры хроматина на эпигеномном уровне. В нем показано, как участки генома физически допустимы для энхансеров, промоторов, изоляторов и хроматин-связывающих факторов и как эти элементы влияют на экспрессиюгенов22. Анализ на доступный для транспозазы хроматин с секвенированием (ATAC-seq) является широко используемым методом для оценки доступности хроматина в геноме23. Он не требует предварительных знаний регуляторных элементов, что делает его мощным инструментом для эпигенетических исследований. Этот метод включает в себя выделение ядер образцов, фрагментацию геномной ДНК транспозазой Tn5 и добавление праймеров для секвенирования для подготовки библиотеки, секвенированияи анализа данных. ATAC-seq сыграл важную роль в изучении картирования нуклеосом, анализа связывания транскрипционного фактора, регуляторных механизмов в различных типах клеток или заболеваниях, идентификации новых энхансеров, открытия биомаркеров и т. д.22,23. Его часто комбинируют с другими методами, такими как секвенирование РНК, для всестороннего анализа экспрессии генов.

ATAC-seq расширил наши знания в области биологии нейтрофилов, раскрыв точные эпигенетические механизмы в здоровье и болезнях. Было выявлено несколько ключевых факторов транскрипции (т.е. RUNX1, KLF6, PU.1 и т.д.) в созревании нейтрофилов и эффекторных ответах24,25, раскрыты патоген-специфические сигнатуры с биомаркерным потенциалом при сепсисе26, выяснены эпигеномные механизмы врожденной иммунной памяти12 и идентифицированы терапевтические мишени при остром миелоидном лейкозе (ОМЛ) у детей27. Тем не менее, являясь важным клеточным компонентом в иммунном надзоре, нейтрофилы проявляют высокую чувствительность к своей внешней среде и, таким образом, представляют собой проблему для получения высококачественных данных ATAC-seq. При физиологических условиях средний период полувыведения нейтрофилов человека составляет 3,8 дня, в то время как средний период полувыведения нейтрофилов мышей составляет 12,5 часов. Примечательно, что их период полувыведения значительно короче при изучении in vitro28,29. Во время работы in vitro с выделенными нейтрофилами воздействие микроорганизмов или ассоциированных с патогенами молекулярных структур (PAMP), а также избыточные экспериментальные процедуры и жесткие операции могут привести к аберрантной активации нейтрофилов и снижению клеточной жизнеспособности из-за апоптоза или нетоза. Умершие клетки обычно содержат значительное количество нехроматинизированной ДНК, очень чувствительной к Tn5, что приводит к повышению фонового шума ATAC-seq23.

В данной работе мы предлагаем масштабируемый протокол для подготовки библиотек ATAC-seq, оптимизированных для нейтрофилов, полученных из образцов костного мозга грызунов. На рисунке 1 представлен графический обзор протокола, который включает в себя иммуномагнитное разделение нейтрофилов из костного мозга с последующим проведением ATAC-seq. Усовершенствованная иммуномагнитная сортировка гарантирует оптимальную жизнеспособность нейтрофилов перед экстракцией ядра для библиотеки ATAC-seq, что обеспечивает высокое качество библиотек и облегчает включение в схему дополнительных оценок нейтрофилов. Реализация этого протокола поможет исследователям понять особенности архитектуры хроматина и механизмы эпигеномного перепрограммирования нейтрофилов при воздействии различных микроэкологических проблем. Ожидается, что это найдет широкое применение в фундаментальных и клинических иммунологических исследованиях.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все представленные ниже процедуры для животных соответствовали национальным этическим рекомендациям и правилам по защите животных, которые были одобрены Комитетом по этике исследований в области ухода за животными Столичного медицинского университета, Пекин, Китай (sjtkl11-1x-2022(060)).

1. Приготовление суспензии клеток костного мозга (БМК)

  1. Отдельные самцы мышей C57BL/6J в возрасте 6-8 недель весом 19-21 г. Усыпите мышей с помощью камеры CO2 с последующим вывихом шейки матки после исчезновения глубокого рефлекса. Продезинфицируйте их спреем с 70% этанолом на коврике для вскрытия.
  2. С помощью небольших ножниц и щипцов осторожно отделите бедренную кость от тазобедренного сустава и большеберцовой кости, удалите прикрепленную кожу и скелетные мышцы и промойте бедренную кость холодным фосфатно-солевым буфером (PBS) в чашке Петри диаметром 10 см.
  3. Отрежьте эпифиз бедренной кости, аккуратно введите иглу 28 G, прикрепленную к шприцу объемом 2 мл, в полость костного мозга и промойте костный мозг холодной PBS, содержащей 2% фетальной бычьей сыворотки (FBS).
  4. Повторяйте предыдущий шаг до тех пор, пока промытая темно-красная жидкость не станет полупрозрачной. Обычно требуется три промывки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте слишком глубокого введения иглы в полость костного мозга, чтобы обеспечить оптимальное получение клеток.
  5. Используйте клеточный фильтр 70 мкм, чтобы отфильтровать клеточную суспензию в пробирку для сортировки клеток, активируемую флуоресценцией (FACS) (5 мл).
  6. Лизировать эритроциты в БМК с помощью коммерческого буфера для лизиса эритроцитов без полиформальдегида.
    1. Центрифугируйте пробирку при давлении 500 x g в течение 5 минут при 25 °C, осторожно удалите надосадочную жидкость, оставив на дне примерно 100 μл жидкости, и осторожно постучайте по трубке, чтобы ослабить гранулу.
    2. Добавьте 2 мл буфера для лизиса, разведенного из буфера для лизиса эритроцитов (10x), и перемешайте, перевернув пробирку три раза вверх дном. Затем центрифугируйте пробирку при давлении 500 x g в течение 5 минут, выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу легкими постукиваниями.
    3. Дважды промойте клетки средой RPMI 1640, содержащей 10% FBS, и повторно суспендируйте их в объеме 2 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При работе с нерассеянными сгустками клеток рекомендуется использовать наконечник для пипетки объемом 200 мкл, чтобы выбрать их, а не фильтровать клеточные суспензии через клеточный фильтр 70 мкм. Этот метод позволяет уменьшить потерю клеток.
  7. Рассчитайте клеточную жизнеспособность и общее количество живых клеток на образец с помощью окрашивания трипановым синим.

2. Иммуномагнитное мечение нейтрофилов анти-Ly6G магнитными шариками

  1. Ресуспендировать клетки костного мозга (~2 x 107 живых клеток на мышь) в 2 мл среды RPMI 1640, содержащей 10% FBS, и центрифугировать при 500 x g в течение 5 мин при 25 °C.
    Примечание: Учитывая ограниченную потребность в 1 x 105 клетках для ATAC-seq, избыточные нейтрофилы могут быть распределены для дополнительных эпигеномных анализов (например, ChIP-seq и Hi-C) или оценки иммунной функции (например, продукции цитокинов, фагоцитоза и НВЛ) с использованием нейтрофилов, полученных от той же мыши.
  2. Отасуньте большую часть надосадочной жидкости, оставив после себя примерно 100 μл, и осторожно постучите по трубке, чтобы ослабить гранулу.
  3. Добавьте 30 μL гранул Ly6G и перемешайте с BMC, легкими постукивающими движениями.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Магнитные шарики следует держать в вихревом состоянии не менее 10 секунд перед использованием. После добавления бусин в БМК рекомендуется воздержаться от завихрения.
  4. Инкубируйте пробирку при температуре 25 °C в течение 15 минут.
  5. Добавьте 2 мл PBS для ресуспензии гранул и клеток, затем центрифугируйте при 500 x g в течение 5 минут при 25 °C.
  6. Отасуньте большую часть надосадочной жидкости, оставив после себя примерно 100 μл, и осторожно постучите по трубке, чтобы ослабить гранулу. Добавьте дополнительную PBS для получения конечного объема 1 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При работе с нерассеянными сгустками клеток рекомендуется использовать наконечник для пипетки объемом 200 мкл, чтобы выбрать их, а не фильтровать клеточные суспензии через клеточный фильтр 70 мкм. Этот метод позволяет уменьшить потерю клеток.

3. Разделение нейтрофилов с иммуномагнитной сортировкой клеток

  1. Предварительно обработайте колонку МС PBS.
    1. Поместите колонку MS в магнитное поле совместимого магнитно-активируемого сепаратора для сортировки ячеек (MACS). Поместите незанятую трубку объемом 5 мл под жидкость, выходящую из колонны MS.
    2. Промойте колонку 500 μл PBS. Повторите этот шаг после завершения потока PBS в столбец MS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: PBS следует давать поступать, капля за каплей, в пробирку для сортировки флуоресцентно-активируемых клеток (FACS) объемом 5 мл через колонку MS. Следите за тем, чтобы воздух не попадал в колонну, так как пузырьки воздуха могут препятствовать колонне.
  2. Нанесите суспензию BMC с магнитной маркировкой на колонку MS, добавив 500 мкл за один раз, и сразу же наполните ее, как только резервуар колонки опустеет.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что клеточные суспензии лишены клеточной массы. При необходимости поместите новую пробирку FACS объемом 5 мл под колонку МС, чтобы собрать немеченые клетки (например, моноциты и лимфоциты) перед этой стадией.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обратите внимание на скорость потока капель. Медленный расход может указывать на то, что сортировочная колонна затруднена.
  3. Промойте колонку MS, добавляя 500 μL PBS каждый раз, когда резервуар опустошается, повторяя этот процесс дважды.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Преждевременное добавление PBS может препятствовать поступлению определенных клеток в сортировочную колонну, потенциально ставя под угрозу чистоту сортировки клеток.
  4. Соберите нейтрофилы, меченные магнитом.
    1. Как только резервуар колонки будет исчерпан, извлеките колонку из магнитного поля и осторожно поместите ее на трубку объемом 5 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перед удалением колонки убедитесь, что в ней нет остатков жидкости, чтобы предотвратить потерю нейтрофилов из-за выделения капель во время процесса. Остатки в колонке можно удалить с помощью пипетки.
    2. Нанесите 2 мл PBS на колонку, затем немедленно и сильно вставьте поршень в колонку, чтобы вытеснить нейтрофилы, меченные магнитом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы получить достаточное количество нейтрофилов, обеспечьте достаточный объем элюирования и оставайтесь короткими при проталкивании поршня в колонку.
  5. Используйте гемоцитометр для подсчета выделенных клеток. Определить чистоту выделенных нейтрофилов путем взятия 100 мкл постсортировочной клеточной суспензии и ее анализа с помощью проточной цитометрии.

4. Экстракция ядра

  1. Центрифугируйте 50 000 суспензий одиночных клеток, содержащих нейтрофилы, при 500 x g в течение 5 мин при 4 °C в пробирке объемом 0,2 мл, затем выбросьте надосадочную жидкость.
  2. Суспендируйте нейтрофилы в 50 мкл предварительно охлажденного лизисного буфера (см. таблицу 1), аккуратно перемешайте раствор с помощью пипетки и инкубируйте на льду в течение 10 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если объем образца составляет менее 5 мкл, допускается прямое добавление буфера для лизиса. Концентрация клеточной суспензии не превышает 1 х 107 клеток/мл.
  3. Центрифугируйте при 500 х г в течение 5 минут при 4 °C, затем выбросьте надосадочную жидкость и соберите ядро. Положите трубку на лед перед началом последующих процедур.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы свести к минимуму потерю пробы, обозначьте сторону стенки пробирки, где скапливаются гранулы, и осторожно отсасывайте жидкость с противоположной стороны при удалении надосадочной жидкости.

5. Нуклеосомно-привязанная маркация транспозазой

  1. Приготовьте реакционную смесь для мечения, содержащую транспозазу Tn5, в пробирке полимеразной цепной реакции (ПЦР) в соответствии с рекомендациями набора для подготовки библиотеки ДНК (см. таблицу 2) и предварительно нагрейте охлажденные гранулы для очистки ампликонов при температуре 25 °C в течение не менее 30 минут.
  2. Ресуспендируйте ядро нейтрофилов 50 мкл реакционной смеси для тагментации и осторожно перемешайте с помощью пипетки с последующим центрифугированием в течение 5 с с помощью ручной центрифуги (~2600 x g).
  3. Инкубируйте реакционную пробирку в приборе для ПЦР при температуре 37 °C в течение 30 минут.
  4. Добавьте в лизат 100 мкл предварительно завихревших шариков для очистки ампликонов, затем тщательно перемешайте магнитные шарики в растворе, пипетируя вверх и вниз 10 раз.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Магнитные шарики липкие и могут легко прикрепляться к наконечникам пипеток, поэтому убедитесь, что вы отсасываете нужный объем и медленно выдавайте их с наконечников при переносе шариков.
  5. Инкубируйте реакционную пробирку при 25 °C в течение 5 минут, затем центрифугируйте в течение 5 с с помощью ручной центрифуги (~2600 × г).
  6. Очистите прерванный фрагмент ДНК, поместив реакционную пробирку на магнитный штатив до тех пор, пока раствор не станет прозрачным (примерно 5 минут). Затем осторожно удалите надосадочную жидкость, не потревожив магнитные шарики.
  7. Каждый раз промойте магнитный шарик 200 μл свежеприготовленного 80% этанола, удерживая реакционную трубку на магнитной решетке в течение 30 секунд. Не тревожьте шарики при добавлении этанола. Повторите процедуру, описанную в шаге 5.7.
  8. Центрифугируйте реакционную пробирку с помощью ручной центрифуги (приблизительно 2600 × г), отсасывайте этанол с помощью наконечников пипеток объемом 10 мкл, затем высушите магнитные шарики в течение 3-5 минут, открывая крышку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Продолжительность сушки магнитных шариков может варьироваться в зависимости от региона из-за различий в уровнях влажности. Бусины следует сушить только до тех пор, пока они не потеряют свой блеск. Чрезмерная сушка может усложнить процесс элюирования, в то время как недостаточная сушка может привести к присутствию остатков спирта, что повлияет на последующие эксперименты. Кроме того, горизонтальное расположение магнитного штатива в большей степени способствует равномерному высыханию магнитных шариков.
  9. После извлечения реакционной пробирки из магнитного штатива добавьте 26 μL ddH2O, чтобы покрыть магнитные шарики, пипетируя вверх и вниз, чтобы обеспечить тщательное перемешивание. Затем выдерживайте при температуре 25 °C в течение 2 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Увеличьте продолжительность инкубации соответствующим образом, если магнитные шарики пересушены.
  10. Кратковременно центрифугируйте реакционную пробирку с помощью ручной центрифуги (примерно 2600 × г) и отделите магнитные шарики с помощью магнитного штатива до тех пор, пока раствор не станет прозрачным (примерно 5 минут).
  11. Осторожно перенесите надосадочную жидкость объемом 24 мкл в новую ПЦР-пробирку.

6. Построение библиотеки для секвенирования нового поколения (NGS)

  1. Приготовьте реакционную смесь для ПЦР в стерилизованной пробирке с использованием очищенных фрагментов ДНК и праймеров, содержащих адаптеры для секвенирования (см. таблицу 3).
  2. Проведите реакцию ПЦР в соответствии с рекомендованными процедурами (см. Таблицу 4), обычно занимая около 1 часа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После этой процедуры эксперимент может быть временно приостановлен, а продукты ПЦР могут храниться при температуре -20 °C или не менее 2 недель.
  3. Добавьте 27,5 мкл предварительно вихревых шариков для очистки ампликонов в 50 μл продуктов ПЦР, затем тщательно перемешайте магнитные шарики в растворе, пипетируя вверх и вниз 10 раз.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Неправильное соотношение магнитных шариков к продуктам ПЦР может привести к расхождениям в длине отсортированных фрагментов. Используйте ddH2O для заполнения испарившегося объема продукта ПЦР до 50 мкл. Убедитесь, что магнитные шарики отсасываются в нужном объеме, и медленно распределяйте их с наконечников пипеток, чтобы свести к минимуму количество шариков, которые могут быть прикреплены.
  4. Инкубируйте реакционную пробирку при 25 °C в течение 5 минут, затем центрифугируйте в течение 5 с с помощью ручной центрифуги (примерно 2600 x g).
  5. Очистите библиотечную ДНК, поместив реакционную пробирку на магнитный штатив до тех пор, пока раствор не станет прозрачным (примерно 5 минут). Затем осторожно перенесите надосадочную жидкость в новую стерилизованную ПЦР-пробирку и выбросьте магнитные шарики.
  6. Добавьте в надосадочную жидкость 50 мкл предварительно завихревших шариков очистки ампликонов, затем тщательно перемешайте магнитные шарики в растворе, пипетируя вверх и вниз 10 раз.
  7. Инкубируйте реакционную пробирку при 25 °C в течение 5 минут, затем центрифугируйте в течение 5 с с помощью ручной центрифуги (примерно 2600 x g).
  8. Поместите реакционную пробирку на магнитный штатив до тех пор, пока раствор не станет прозрачным (примерно через 5 минут), затем осторожно удалите надосадочную жидкость, не нарушая магнитные шарики.
  9. Каждый раз дважды промойте магнитную бусину 200 μл свежеприготовленного 80% этанола, удерживая реакционную пробирку на магнитной решетке в течение 30 секунд. Не тревожьте шарики при добавлении этанола.
  10. Высушите магнитные шарики в течение 5 минут, открывая крышку.
  11. После извлечения реакционной пробирки из магнитного штатива добавьте 22 мкл ddH2O, чтобы покрыть магнитные шарики, пипетируя вверх и вниз 10 раз, чтобы обеспечить тщательное перемешивание. Затем выдерживайте при температуре 25 °C в течение 5 минут.
  12. Кратковременно центрифугируйте реакционную пробирку с помощью ручной центрифуги (примерно 2600 × г) и отделите магнитные шарики с помощью магнитного штатива до тех пор, пока раствор не станет прозрачным (примерно 5 минут).
  13. Осторожно перенесите надосадочную жидкость объемом 20 мкл в новую стерилизованную ПЦР-пробирку и храните при температуре -20 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы получить библиотеку с более концентрированным распределением длины, рассмотрите возможность использования набора для восстановления геля для сортировки усиленного продукта. В качестве альтернативы, если нет особых требований к диапазону распределения длины, усиленный продукт может быть очищен непосредственно с помощью магнитного гранулометра или комплекта для очистки колонки без сортировки по длине.

7. Контроль качества библиотеки и секвенирование

  1. Используйте платформы для анализа фрагментов ДНК для оценки распределения по длине библиотечной ДНК.
  2. Используйте платформы NGS для выполнения высокопроизводительного секвенирования в библиотеках, прошедших проверку качества.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Описанный протокол был использован для выделения нейтрофилов из костного мозга мышей C57BL/6 и сравнения их соответствующих различий в доступности хроматина до и после стимуляции липополисахаридами (ЛПС) с помощью ATAC-seq. Как правило, 2 x 107 BMC могут быть собраны из обеих бедренных костей 6-8-недельной мыши C57BL/6, а затем могут быть выделены 2-5 x 106 нейтрофилов. Среди них 1 x 105 клеток используются для ATAC-seq, в то время как избыточные клетки могут быть выделены для комплексног...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В данной рукописи представлен экспериментальный протокол подготовки библиотек ATAC-seq, оптимизированных для нейтрофилов, полученных из образцов костного мозга грызунов. Из-за того, что нейтрофилы обладают высокой восприимчивостью и легко активируются иммунными клетками, усилия по оптимизации были направлены на поддержание жизнеспособности изолированных нейтрофилов. Неправильное лечение может привести к нетозу и другим формам клеточной смерти, вызывая высвобождение значительного количест...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантами Программы исследований и разработок Пекинской муниципальной комиссии по образованию (KZ202010025041) и Китайского института медицинских исследований, Пекин (грант No. CX24PY29).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,4% Трипановый синийScientificT10282
1x фосфатно-солевой буферный BiosharpBL302A
20.н. 5000.н. Маркер выравниванияBiopticC109102-100Aанализатор фрагментов ДНК вспомогательные продукты
5k Маркер размера (стандартный 50.н. Лестница)BiopticC109101-100Aанализатор фрагментов ДНК вспомогательные продукты
Amplicons Purification BeadsBeckmanA63881Amplicons Purification Beads - это набор для очистки нуклеиновых кислот для получения высококачественных продуктов ДНК.
Anti-Ly6G MicroBeads Ultrapure, мышиныйmiltenyi130-120-337Анти-Ly-6G MicroBeads UltraPure, мышиный был разработан для положительного отбора или истощения мышиных нейтрофилов из суспензий одиночных клеток костного мозга мыши.
Мышь CD11b-BV605 (1:200)BDCat#563015
Мышь CD48-PE-Cy7 (1:400)BDCat#560731
Мышь Ly6G-BV510 (1:200)BDCat#740157
C57BL/6J мыши, дикий тип, 8-недельный, самецИнститут науки о лабораторных животных, Китайская академия медицинских наукИнститут науки о лабораторных животных, Китайская академия медицины Sciences
DNA Separation BufferBiopticC104406анализатор фрагментов ДНК вспомогательные продукты
E. coli derived ultrapure LPS (serotype0111: B4)Sigma-AldrichCat#L-2630
ДНК Количественный реагентvazymeEQ111DNA Quantitative Reagentt представляет собой простой, чувствительный и точный набор для флуоресцентного количественного анализа двухцепочечной ДНК (dsDNA).
Буфер для лизиса эритроцитов (10x)BioLegendCat#420301
Фетальная бычья сывороткаGibcoCat#10099141C
MS Разделительные колонкиmiltenyi130-042-201MS Колонки предназначены для положительного отбора клеток.
RPMI 1640 mediumGibcoC11875500BT
S2 Гель игла для электрофореза БиоптическийC105101анализатор фрагментов ДНК вспомогательные продукты
Хирургические инструменты: скальпель, ножницы для препарирования, ножницы для микродиссекции, тонкие щипцы, тупые анатомические щипцы, иглодержательhttps://www.fishersci.com/us/en/browse/90184247/surgical-toolsFisher ScientificМожно приобрести у других квалифицированных поставщиков
Шприц (1  mL)Fisher Scientific https://www.fishersci.com/shop/products/sterile-syringes-single-use-12/14955464Можно приобрести у других квалифицированных поставщиков
TruePrepTM DNA Library Prep Kit V2 for IlluminavazymeTD501-01TruePrep DNA Library Prep Kit V2 for Illumina — это специально разработанный набор, специально разработанный для высокопроизводительной платформы секвенирования Illumina. С помощью этого набора ДНК может быть подготовлена в библиотеки секвенирования, предназначенные для высокопроизводительной платформы секвенирования Illumina.
TruePrepTM Index Kit V2 для IlluminavazymeTD202TruePrep Index Kit V2 для Illumina — это набор для TruePrep DNA Library Prep Kit V2 для Illumina. Он может быть использован для подготовки 96 различных библиотек двусторонних индексов.
Научный

Ссылки

  1. Mortaz, E., Alipoor, S. D., Adcock, I. M., Mumby, S., Koenderman, L. Update on neutrophil function in severe inflammation. Front Immunol. 9, 2171(2018).
  2. Lehrer, R. I., Ganz, T., Selsted, M., Babior, B. M., Curnutte, J. T. Neutrophils and host defense. Ann Intern Med. 109 (2), 127-142 (1988).
  3. De Oliveira, S., Rosowski, E. E., Huttenlocher, A. Neutrophil migration in infection and wound repair: Going forward in reverse. Nat Rev Immunol. 16 (6), 378-391 (2016).
  4. Herrera-Uribe, J., et al. Integrative profiling of gene expression and chromatin accessibility elucidates specific transcriptional networks in porcine neutrophils. Front Genet. 14, 1107462(2023).
  5. Kipnis, E. Neutrophils in sepsis: Battle of the bands. Crit Care Med. 41 (3), 925-926 (2013).
  6. Kong, Y., et al. Sepsis-induced thymic atrophy is associated with defects in early lymphopoiesis. Stem Cells. 34 (12), 2902-2915 (2016).
  7. Cassatella, M. A. Neutrophil-derived proteins: Selling cytokines by the pound. Adv Immunol. 73, 369-509 (1999).
  8. Tecchio, C., Cassatella, M. A. Neutrophil-derived cytokines involved in physiological and pathological angiogenesis. Chem Immunol Allergy. 99, 123-137 (2014).
  9. Newburger, P. E. Autoimmune and other acquired neutropenias. Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2016 (1), 38-42 (2016).
  10. Skokowa, J., Dale, D. C., Touw, I. P., Zeidler, C., Welte, K. Severe congenital neutropenias. Nat Rev Dis Primers. 3, 17032(2017).
  11. Burn, G. L., Foti, A., Marsman, G., Patel, D. F., Zychlinsky, A. The neutrophil. Immunity. 54 (7), 1377-1391 (2021).
  12. Wang, B., et al. Sepsis induces non-classic innate immune memory in neutrophils. Cell Rep. 42 (9), 113044(2023).
  13. Dinauer, M. C. Primary immune deficiencies with defects in neutrophil function. Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2016 (1), 43-50 (2016).
  14. Shaul, M. E., Fridlender, Z. G. Tumour-associated neutrophils in patients with cancer. Nat Rev Clin Oncol. 16 (10), 601-620 (2019).
  15. Hong, C. W. Current understanding in neutrophil differentiation and heterogeneity. Immune Netw. 17 (5), 298-306 (2017).
  16. Carvalho, L. O., Aquino, E. N., Neves, A. C., Fontes, W. The neutrophil nucleus and its role in neutrophilic function. J Cell Biochem. 116 (9), 1831-1836 (2015).
  17. Tamassia, N., et al. Cutting edge: An inactive chromatin configuration at the il-10 locus in human neutrophils. J Immunol. 190 (5), 1921-1925 (2013).
  18. Shiraishi, K., et al. Biophysical forces mediated by respiration maintain lung alveolar epithelial cell fate. Cell. 186 (7), 1478-1492.e15 (2023).
  19. Chang, C. C., Sun, J. T., Chu, F. Y. Bacterial sepsis, neutrophils and intracellular organisms. QJM. 110 (6), 393-394 (2017).
  20. Walling, B. L., Murphy, P. M. Protean regulation of leukocyte function by nuclear lamins. Trends Immunol. 42 (4), 323-335 (2021).
  21. Sollberger, G., Tilley, D. O., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: The biology of chromatin externalization. Dev Cell. 44 (5), 542-553 (2018).
  22. Klemm, S. L., Shipony, Z., Greenleaf, W. J. Chromatin accessibility and the regulatory epigenome. Nat Rev Genet. 20 (4), 207-220 (2019).
  23. Grandi, F. C., Modi, H., Kampman, L., Corces, M. R. Chromatin accessibility profiling by ATAC-seq. Nat Protoc. 17 (6), 1518-1552 (2022).
  24. Khoyratty, T. E., et al. Distinct transcription factor networks control neutrophil-driven inflammation. Nat Immunol. 22 (9), 1093-1106 (2021).
  25. Fischer, J., et al. Safeguard function of pu.1 shapes the inflammatory epigenome of neutrophils. Nat Immunol. 20 (5), 546-558 (2019).
  26. Ram-Mohan, N., et al. Profiling chromatin accessibility responses in human neutrophils with sensitive pathogen detection. Life Sci Alliance. 4 (8), e202000976(2021).
  27. Wei, L., et al. Integrative analysis of single-cell rna-seq and atac-seq data across treatment time points in pediatric AML. Blood. 136 (1), 29(2020).
  28. Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nat Rev Immunol. 13 (3), 159-175 (2013).
  29. Pillay, J., et al. In vivo labeling with 2H20 reveals a human neutrophil lifespan of 5.4 days. Blood. 116 (4), 625-627 (2010).
  30. Orchard, P., Kyono, Y., Hensley, J., Kitzman, J. O., Parker, S. C. J. Quantification, dynamic visualization, and validation of bias in ATAC-seq data with ataqv. Cell Syst. 10 (3), 298-306.e4 (2020).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Доступность хроматинанейтрофилы костного мозгаиммуномагнитная сепарацияизоляция нейтрофиловтранспозаза Tn5эпигеномная регуляцияпозиционирование нуклеосомочистка ПЦР-продуктовперепрограммирование хроматина
ATAC-Seq Библиотечная подготовка нейтрофилов, полученных из костного мозга мышей
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.