Сравнение трансперитонеального забрюшинного доступа и чрескожной пункции для моделирования дегенерации межпозвоночного диска поясничного отдела позвоночника у кроликов

Краткое содержание

В этом протоколе сравнивали чрескожные и транс-забрюшинные пункции в модели дегенерации межпозвоночных дисков кролика (IVDD). Оба метода индуцировали IVDD; Тем не менее, транс-ретроперитонеальный подход привел к более обширным изменениям и снижению смертности.

Аннотация

В этом исследовании сравнивается эффективность двух методов индуцирования дегенерации межпозвоночных дисков (IVDD) у кроликов: чрескожной и транс-ретроперитонеальной пункции фиброзного кольца. Пятнадцать здоровых самцов новозеландских белых кроликов были случайным образом распределены по трем группам: фиктивная, чрескожная пункция и транс-забрюшинная пункция. Для обеспечения точного и подробного сравнения двух методов была проведена комплексная оценка, включающая показатели смертности, морфологическую и гистологическую оценку, рентгенологическую визуализацию и анализ биомаркеров. Результаты демонстрируют, что оба метода пункции успешно индуцировали IVDD на модели кролика. Тем не менее, транс-ретроперитонеальный доступ приводил к более выраженным дегенеративным изменениям в межпозвоночных дисках при сохранении значительно более низкой смертности по сравнению с чрескожным методом. Эти результаты подчеркивают преимущества транс-ретроперитонеального подхода в моделировании IVDD. Это исследование дает ценную информацию о создании моделей IVDD и закладывает основу для будущих исследований эффективных стратегий лечения боли в пояснице, что в конечном итоге улучшает результаты лечения пациентов.

Введение

За последние несколько десятилетий боль в пояснице (LBP) стала наиболее значительным заболеванием опорно-двигательного аппарата, влияющим на качество жизни¹. LBP становится все более важной проблемой общественного здравоохранения, налагая существенное экономическое бремя на общество из-за потери рабочей силы и дополнительных медицинских расходов ^2,3. Только в Соединенных Штатах прямые и косвенные расходы, связанные с LBP, превышают 100 миллиардов долларов в год, включая медицинские расходы, потери доходов и потери рабочей^силы. LBP часто вызывается дегенерацией межпозвоночных дисков (IVDD)5,6,7,8. Учитывая высокую распространенность и экономическое влияние LBP, точное моделирование IVDD имеет решающее значение для изучения стратегий лечения.

Для понимания патофизиологии IVDD и оценки стратегий лечения были разработаны и использованы различные доклинические модели in vivo на животных⁹. В этих моделях было использовано несколько методов индуцирования дегенерации диска, включая хирургическую или химическую травму диска, неинвазивное механическое воздействие, генетическую модификацию и естественное возникновение^. Среди этих методов хирургическая травма составляет до 64,9% индукции IVDD, при этом первичным хирургическим методом является пункция иглой¹¹. Модель прокола иглой отличается простотой установления и минимальным ущербом для подопытных животных. Распространенные подходы с помощью игольчатой пункции включают открытый забрюшинный доступ к межпозвоночному пространству поясничного отдела и чрескожную заднелатеральную пункцию. Глубина введения может быть определена с помощью рентгенологического контроля или длины иглы. Примечательно, что чрескожный доступ может уменьшить ятрогенное повреждение тканей по сравнению с открытыми хирургическими методами, в то время как забрюшинный доступ обеспечивает преимущество прямой визуализации, которая количественно не сравнивалась в предыдущей литературе. В то время как в исследованиях изучалось влияние использования игл разного диаметра¹² и пункции различных дисков¹⁰ на индукцию IVDD, сравнительные исследования, сосредоточенные на различных подходах к пункции игл, остаются ограниченными. Выбранная модель кролика особенно полезна для исследователей, которым требуются экономически эффективные лонгитюдные исследования с частыми визуальными оценками, учитывая ее анатомическое сходство с человеческими дисками и ее преимущества перед моделями грызунов с точки зрения размера^{и структуры.}

В этом исследовании кроличьи модели поясничного IVDD были установлены с использованием двух методов: открытого забрюшинного доступа для пункции межпозвоночного пространства поясничного отдела и чрескожной заднелатеральной пункции. Был проанализирован полный набор критериев оценки исходов, включая морфологические, гистологические и радиологические изменения.

Протокол

Экспериментальные процедуры на животных строго соответствовали Руководству по уходу за лабораторными животными и их использованию, выпущенному Национальными институтами здравоохранения, и были одобрены Комитетом по этике экспериментальных животных Университета традиционной китайской медицины Чэнду (номер утверждения этики: 2021-23). Было использовано пятнадцать здоровых 4-месячных кроликов породы новозеландской белой породы (2,25 кг ± 0,25 кг), в том числе семь самцов и восемь самок. Животные содержались в условиях комнатной температуры от 23 °C ± 3 °C и влажности около 60% ± 10% в течение одной недели адаптации, со свободным доступом к воде и пище. Перед началом эксперимента 15 кроликов были случайным образом распределены в одну из трех групп: фиктивная группа (группа А), группа чрескожной фиброзной пункции в кольце (группа В) и группа транс-ретроперитонеального пространства фиброзной пункции (группа С), по пять кроликов в каждой группе. Подробная информация о реагентах и оборудовании, использованных в этом исследовании, приведена в Таблице материалов.

1. Установление модели IVDD кролика через чрескожную фиброзную пункцию в кольце

ПРИМЕЧАНИЕ: Модель IVDD у кроликов устанавливали методом чрескожной фиброзной пункции через кольцо. Процедура проводилась по методу моделирования пункции, описанному Luo TD et ^al.14 , и выполнялась под рентгеновским контролем (рис. 1).

1. Подготавливаем кролика.
   1. Голодайте кроликов в течение 24 часов перед операцией, обеспечив доступ к воде.
   2. Введение анестезии путем внутривенной инъекции 3% пентобарбитала натрия (1,3 мл/кг) в ушную вену (в соответствии с утвержденными в учреждении протоколами).
   3. Подтвердите успешность анестезии, проверив неподвижность, расслабленность мышц, отсутствие роговичного рефлекса и отсутствие реакции на боль.
2. Расположите и отметьте кролика.
   1. Зафиксируйте кролика в положении лежа на фиксирующей доске.
   2. Побрейте и подготовьте операционную зону, затем пальпируйте костные ориентиры.
   3. Пропальпируйте костные ориентиры на поясничной части спины кролика. Найдите самое нижнее ребро на кролике, которое обычно соответствует позвонку чуть выше остистого отростка L1.
   4. Определите остистый отросток непосредственно под этим позвонком, чтобы определить остистый отросток L1.
   5. Найдите самые высокие точки гребней подвздошной кости, примерно на уровне позвонка L6.
   6. Проследите вниз от остистого отростка L1, чтобы последовательно идентифицировать каждый остистый отросток до L7.
   7. С помощью маркера четко отметьте остистый отросток L1 на спине кролика.
   8. Перейдите к следующему остистому отростку и отметьте его как L2.
   9. Продолжайте отмечать каждый последующий остистый отросток как L3, L4, L5, L6 и L7. Убедитесь, что каждая метка отличается друг от друга и расположена в последовательном порядке для четкой идентификации.
3. Найдите и отметьте место прокола.
   1. Пальпируйте поперечные отростки и найдите середину между дистальными концами L5 и L6.
   2. Отметьте эту точку и приготовьтесь ввести иглу для прокола примерно на 1 см выше нее.
4. Введите прокол иглой.
   1. Держите иглу для прокола горизонтально и вставьте ее к земле, разрывая кожу.
   2. Переместите иглу вперед, чтобы добраться до тела позвонка L4, и проверьте правильное положение под рентгеновским контролем.
   3. Слегка наклоните иглу на головку под углом примерно 20° в сторону межпозвоночного диска L4-5. Прокол диска и подтверждение точности прокола под рентгенологическим исследованием.
5. Выполнять проколы диска.
   1. Точно проколите фиброзное кольцо, при необходимости используя рентгеновский контроль.
   2. Повторите процесс прокола для межпозвоночных дисков L2-3 и L3-4, проколов каждый по одному разу.
   3. Поддерживайте глубину прокола около 5 мм с временем выдержки 5 с для каждого диска.
6. Уход после процедуры
   1. Продезинфицируйте и наложите повязку на место прокола.
   2. Вводите пенициллин внутримышечно в большую ягодичную мышцу в дозировке 40 000 ЕД на кролика ежедневно в течение 3 дней.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Скорректируйте подход, если игла задевает твердые ткани. Используйте рентгеновский контроль для точного прокола. Следите за выздоровлением кролика и обеспечивайте соответствующий уход.

2. Установление модели IVDD кролика через транс-забрюшинное пространство кольцевидной фиброзной пункции

ПРИМЕЧАНИЕ: Модель IVDD кролика была создана с использованием метода транс-ретроперитонеальной фиброзной пункции в кольце¹² (рис. 2).

1. Голодайте кроликов в течение 24 часов перед операцией, обеспечивая доступ к воде.
2. Обезболите кролика путем внутривенного введения 3% пентобарбитала натрия (1,3 мл/кг) в ушную вену (в соответствии с утвержденными в учреждении протоколами).
3. Убедитесь, что кролик неподвижен, с расслабленными мышцами, без роговичного рефлекса и без болевой реакции на давление, чтобы подтвердить успешную анестезию.
4. Зафиксируйте кролика в положении лежа на фиксирующей доске.
5. Побрейте и подготовьте операционную область.
6. Пальпируйте костные ориентиры, отмечая маркером поясничные остистые отростки L1-L7 на поясничной части спины кролика.
7. Повторно пальпируйте поперечные отростки кролика, чтобы определить место хирургического разреза.
8. Поместите стерильную простыню и продезинфицируйте местную кожу, чтобы обеспечить асептические условия.
9. Используйте задний забрюшинный доступ, чтобы рассечь фасцию и мышцы слой за слоем, обнажая латеральную сторону поясничного межпозвоночного диска.
10. Проколите фиброзное кольцо пункционной иглой на глубину примерно 5 мм и время выдержки 5 с.
11. Последовательно проколите межпозвоночные диски L3-4, L4-5 и L5-6, следя за тем, чтобы каждый диск был проколот только один раз.
12. Сшивайте ткани слой за слоем с помощью шовной нити диаметром 0,25 мм.
13. Продезинфицируйте и наложите повязку на место прокола после моделирования.
14. Вводите пенициллин внутримышечно в большую ягодичную мышцу кролика ежедневно в дозировке 40 000 ЕД на кролика в течение трех дней подряд.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте пенициллин со спецификацией 800 000 единиц / флакон и номером одобрения ветеринарного препарата 140051251.

3. Выбор моделей IVDD и оценка результатов

1. Оценка смертности и общего состояния кроликов
   1. Наблюдайте за кроликами еженедельно, чтобы определить выживаемость и записать общее состояние, включая психическое состояние, режим активности, потребление пищи и воды, а также каловые и мочевые выделения.
   2. Точно записывайте наблюдения и отмечайте любые изменения в состоянии.
2. Контроль веса кроликов
   1. Регистрируйте массу тела кроликов до и после создания модели, а также до забора тканей.
   2. Обеспечьте точную запись веса и отметьте любые существенные изменения.
3. Радиологическая оценка
   1. Получите сагиттальную 1,5Т2-взвешенную магнитно-резонансную томографию всей последовательности экспланта поясничного отдела позвоночника каждого белого кролика до и через 4 недели после создания модели.
   2. Наблюдайте за степенью дегенерации межпозвоночных дисков.
   3. Провести количественную оценку дегенерации межпозвоночных дисков с использованием модифицированной системы классификации Пфиррмана, предложенной Griffith et ^al.15. Попросите трех независимых слепых радиологов оценить Т2-взвешенные последовательности МРТ в соответствии с установленными критериями: высота диска, интенсивность сигнала пульпозного ядра и целостность фиброзного кольца.
   4. Определяйте итоговые оценки на основе консенсуса, если расхождения превышают один уровень оценки. Проводите все оценки с помощью стандартизированного программного обеспечения для просмотра DICOM с откалиброванными настройками дисплея.
4. Гистопатологическая оценка и оценка
   1. Усыпьте кроликов через 4 недели после моделирования с использованием внутривенной передозировки пентобарбитала натрия (в соответствии с утвержденными в учреждении протоколами), затем быстро изберите межпозвоночные диски L2-L3, L3-L4 и L4-L5 на льду¹⁵.
   2. Зафиксируйте диски L2-L3 в 4% параформальдегиде и храните оставшиеся образцы при температуре -80 °C.
   3. Погрузите неподвижные диски в раствор для удаления накипи, например, 10% ЭДТА, чтобы обеспечить полное погружение. Меняйте раствор для удаления накипи каждые 2-3 дня для поддержания эффективности.
   4. Регулярно контролируйте процесс декальцинации до тех пор, пока не будет достигнута полная декальцинация, которая может занять от нескольких дней до недели, в зависимости от размера и толщины диска.
   5. Тщательно промойте декальцинированные диски проточной водой, чтобы удалить любые следы декальцинирующего раствора.
   6. Обезвоживайте диски, погружая их в серию растворов этанола, начиная с 70% этанола и постепенно увеличивая до 100% этанола. Проводите каждый этап обезвоживания в течение 1-2 часов на сорт.
   7. Инфильтрируйте обезвоженные диски парафином (температура плавления 56-58 °C) в течение минимум 2 часов, обеспечивая полную инфильтрацию.
   8. Вставьте инфильтрированные диски в восковой блок, расположив их для секционирования. Дайте восковому блоку остыть и полностью застыть.
   9. Разделите встроенные диски на тонкие, однородные ломтики (5-10 мкм) с помощью микротома. Закрепите срезы на предметных стеклах для дальнейшего анализа, такого как гистологическое окрашивание или иммуногистохимия^12,13.
   10. Проведите окрашивание гематоксилином и эозином (ПЭ), сделайте снимки под оптическим микроскопом и присвойте баллы по окрашиванию ПЭ по гистопатологической шкале оценки ИВД¹².
5. Проба TUNEL
   1. Депарафинизация и регидратация участков ткани межпозвоночного диска, затем выполнение забора антигена и мембранной пермеабилизации.
   2. Добавьте смесь реактива 1 (TdT) и реагента 2 (dUTP) в соотношении 1:9 и инкубируйте во увлажненной камере.
   3. Вымойте секции буфером PBS, нанесите морилку DAPI и выдерживайте в темноте при комнатной температуре в течение 10 минут.
   4. Захватывайте изображения с помощью полностью автоматизированного панорамного сканера и программного обеспечения для обработки.
6. Обнаружение цитокинов
   1. Усыпьте подопытных кроликов (шаг 3.4.1) и соберите образцы крови из брюшной аорты.
   2. Центрифугируйте образцы крови кролика при температуре 2000 × г в течение 10 мин при 25 °C для отделения сыворотки от клеток крови. Тщательно соберите надосадочную жидкость (сыворотку), следя за тем, чтобы в ней не было клеточного мусора.
   3. Следуйте инструкциям, приведенным в наборе для ИФА, чтобы определить экспрессию TGF-β в образцах сыворотки.
   4. Подготовьте реагенты и стандарты в соответствии с инструкциями в наборе для ИФА.
   5. Добавьте образцы сыворотки в соответствующие лунки в планшете ИФА.
   6. Инкубируйте планшет при рекомендуемой температуре и продолжительности в соответствии с инструкциями набора.
   7. Вымойте пластину в соответствии с инструкциями, чтобы удалить несвязанные реагенты.
   8. Добавьте антитела для обнаружения и другие необходимые реагенты, следуя протоколу набора.
   9. Снова инкубируйте тарелку в течение указанного времени и температуры.
   10. Тщательно вымойте пластину, чтобы удалить излишки реагентов.
   11. Добавьте раствор субстрата в лунки и инкубируйте в течение рекомендуемого периода, чтобы дать возможность проявиться цвету.
   12. Измерьте оптическую плотность (OD) с помощью спектрофотометра на длине волны, указанной в инструкции к набору.
   13. Рассчитайте концентрации образцов путем подстановки значений наружного диаметра в предоставленное уравнение или с помощью стандартной кривой, созданной на основе известных концентраций стандартов.

4. Статистический анализ

1. Выполняйте статистический анализ с помощью коммерчески доступного программного обеспечения.
2. Выражайте непрерывные переменные в виде среднего ± стандартного отклонения.
3. Используйте однофакторный ANOVA для проверки различий между группами.
4. Применяйте тесты ЛСД для парных сравнений.
5. Используйте ANOVA повторных измерений для анализа данных повторных измерений.
6. Выполните корреляционный анализ Спирмена для оценки корреляции между переменными.
7. Установите уровень значимости на α = 0,05 и примите значения P меньше 0,05 как статистически значимые.

Результаты

Хирургические вмешательства прошли без осложнений. Один кролик из группы В (группа чрескожной пункции) умер после процедуры. Все остальные животные вернулись к нормальному питанию и активности после операции и выжили в течение всего экспериментального периода. Длительных кровотечений или инфекций в местах проведения операций не наблюдалось.

Оценка смертности и общего состояния
Смертность составила 0% как в группе А, так и в группе С, в то время как в группе В она составила ...

Обсуждение

Результаты этого исследования указывают на то, что как чрескожный, так и транс-забрюшинный пункционный подходы эффективны в индуцировании дегенерации межпозвоночных дисков (IVDD) на моделях кроликов. Примечательно, что на основе комплексной оценки общего состояния, смертности, гистопатологической оценки, анализа TUNEL и уровня TGF-β в сыворотке крови, модель транс-ретроперитонеальной пункции привела к более обширным дегенеративным изменениям в межпозвоночных дисках при сохранении более н...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
0,3 Т Ветеринарный Менетический Резонанс Лмагинг (МРТ)	NINGBO CHUANSHANJIA	CSJ-MR
Алкоголь медицинский	LIRCON	20230107
Бензилпенициллин калий	Jiangxi Keda Animal Pharmaceutical	140051251
Кровоостанавливающие щипцы	SHINVA	20211239
Шприц для инъекций	CONPUVON	20153151307
Лезвия ножей	Hons Medincal	20210615
Медицинский абсорбирующий ватный тампон	Cofoe	20210006
Медицинская игла для швов	Shanghai Xiaoyi Medical Devices
Медулло-пункционная игла	Yangzhou Jiangzhou Medical Devices	20190902	используется для пункции поясничного диска
физиологический раствор	NeilMed
раствор повидон-йода	Sichuan IJIS Medical Technology
	квазимикровесов
Rabbit	Zhenhua Biomedical	ZH-BXT-3Z
Shaver	AUX
Статистический анализ софт	IBM	SPSS
Стерильная марля	Cofoe	20202140675
Хирургические перчатки	DR. LERSH	20172140028
Хирургический нож	Hons Medinca	20210019
Хирургический пинцет	SHINVA	20210233
линия передачи данных USB-C	KINI
Белый свет фотографический микроскоп	Nikon	Электроэнергия Eclipse Ci-L