Пластырь-зажим для анализа одиночных эндолизосомальных везикул

Summary

В этом протоколе подробно описан метод прямого измерения активности ионных каналов на внутриклеточных везикулах с использованием ручной эндолизосомальной системы патч-зажимов. Мы проиллюстрируем метод, который заключается в увеличении эндолизосом и ручном выделении этих везикул. Такой подход гарантирует, что исследователи могут точно воспроизвести и применить процедуру.

Abstract

Эндолизосомальные ионные каналы имеют решающее значение для эндолизосомального ионного и рН-гомеостаза, регуляции мембранного потенциала и транспортировки везикул. Тем не менее, электрофизиологический доступ к этим каналам в небольших внутриклеточных везикулах был сложной задачей. Разработка эндолизосомальных методов патч-зажима сыграла важную роль в преодолении этого барьера, позволив напрямую измерять активность ионных каналов в эндолизосомальных мембранах.

По сравнению с существующими методами планарного патч-клэмпа, эндолизосомальный пластырь-зажим может одновременно регистрировать несколько клеток и легко комбинироваться с другими методами измерения. Ручное управление дает преимущество визуализации целевых везикул. В нем также рассматривается ограничение незаменимого присутствия Ca²⁺ на одной стороне эндолизосомальной мембраны, что повышает гибкость экспериментального дизайна. Использование эндолизосомальных методов патч-зажима позволяет напрямую измерять и анализировать активность ионных каналов в эндолизосомах.

Учитывая тесную связь между аберрантной функцией эндолизосомальных ионных каналов и такими заболеваниями, как нейродегенеративные заболевания и метаболические нарушения, исследование и модуляция этих каналов может открыть новые мишени для лекарств. Восстанавливая внутриклеточный ионный баланс, мы можем облегчить или вылечить связанные с этим заболевания. Таким образом, этот метод имеет решающее значение для открытия новых мишеней для лекарств и разработки соответствующих лекарств.

Introduction

Ионные каналы играют решающую роль во многих физиологических процессах. В то время как поверхностные ионные каналы привлекают значительное внимание, важность внутриклеточных каналов, особенно в эндолизосомах, постепенно признается. Эндолизосомальная система состоит из многофункциональных, связанных с мембраной органелл, специализированных для основных клеточных функций, включая рециркуляционные эндосомы (RE), ранние эндосомы (EE), поздние эндосомы (LE), лизосомы (LY) и гибридные органеллы с эндолизосомальными и другими компартментными характеристиками, такие как фагосомы и аутофагосомы.

ЭЭ, также известные как сортирующие эндосомы (СЭ), являются одним из первых мест назначения для материалов, интернализованных из плазматической мембраны (ТЧ). ЭЭ являются важнейшими компартментами, отвечающими за сортировку груза по различным эндоцитарным путям, таким как путь созревания к LE/LY для разложения, путь быстрой рециркуляции обратно к PM и путь медленной рециркуляции, включающий отсек для рециркуляции или периферический RE. Мультивезикулярные тельца (MVB), происходящие из эндосом, представляют собой сферические компартменты, окруженные ограничивающей мембраной, которая может быть заполнена внутрипросветными везикулами (ILV)¹. Для поддержания нормальной функции этих органелл им требуются мембранные ионные каналы для регулирования везикулярного pH, осмолярности и передачи сигнала. Однако измерить активность этих каналов не так просто.

Для ионных каналов, расположенных на плазматической мембране, метод патч-зажима, разработанный в 1970-х годах, долгое время был золотым стандартом метода². Тем не менее, доступ к электрофизиологическим каналам в небольших внутриклеточных везикулах остается проблемой. Применение золотого стандарта измерения ионных каналов на плазматической мембране к стандарту измерения ионных каналов на внутриклеточных органеллах сталкивается с тремя основными проблемами. Во-первых, размер эндолизосом, как правило, очень мал (менее 1 мкм в диаметре), что затрудняет их наблюдение и выделение под микроскопом, и меньше, чем диаметр отверстия типичных стеклянных микропипеток, что делает эксперимент неработоспособным. Во-вторых, выделение эндолизосом непосредственно из клеток-мишеней при сохранении целостности органелл требует специальных навыков. В-третьих, из-за отсутствия цитоскелета во внутриклеточных органеллах формирование уплотнения на эндолизосомальной мембране в патч-пипетке и последующий его разрыв для достижения конфигурации целой эндолизосомы может быть сложной задачей, поскольку это ставит под угрозу структурную целостность органеллы³.

Для решения этих проблем было разработано несколько методов, включая запись липидного бислоя, модификацию лизосомальных целевых последовательностей и методы электрофизиологии на основе твердой мембраны (SSM или SSME). Метод записи липидных бислоев включает в себя реконструкцию синтетических фосфолипидных мембран с очищенными ионными каналами, что позволяет детально изучить электрофизиологическую функцию мембранного белка в контролируемых условиях ^4,5. Модификация лизосомальных последовательностей нацеливания на ионных каналах включает перенаправление эндолизосомальных ионных каналов на плазматическую мембрану для измерения с использованием традиционных методов патч-зажима⁶. Методы мембранной электрофизиологии на твердой основе (SSM или SSME), также известные как эндолизосомальный метод планарного патч-зажима, используют плоские стеклянные чипы на твердой подложке с небольшими апертурами (<1 мкм в диаметре) в микроструктурированных планарных боросиликатных чипах. Эти стеклянные чипы с малой апертурой позволяют анализировать маленькие, даже нативные, эндолизосомы с использованием системы управления давлением и всасыванием (Nanion). Однако в первых двух методах ионные каналы не находятся в своей естественной физиологической среде. Попытки зарегистрировать лизосомальные каналы, экспрессируемые на плазматической мембране или реконструированные в липидные бислои, в значительной степени привели к неопределенным и противоречивым результатам.

Несмотря на то, что планарные методы использования патч-зажимов эффективно решают проблему искусственных помех и обеспечивают преимущество высокопроизводительных измерений, используемые решения также ограничены этим методом. Эндолизосомальный метод наложения пластыря-зажима, представленный в этой статье, может одновременно регистрировать несколько клеток и легко сочетаться с другими методами измерения. Ручное управление обеспечивает преимущество визуализации целевых везикул. Он также преодолевает неизбежное ограничение^Ca2+ в растворе на одной стороне эндолизосомальной мембраны, увеличивая^{свободу экспериментального} дизайна3. В последнее время эндолизосомальные методы наложения пластырей играют ключевую роль в исследованиях по разработке лекарств. Например, при нейродегенеративных заболеваниях этот метод помог идентифицировать новые препараты, нацеленные на эндолизосомальные ионные каналы, связанные^{с болезнями} Альцгеймера и Паркинсона^. Исследователи также могут использовать этот метод для изучения роли эндолизосомальных ионных каналов в опухолевых клетках9, тем самым контролируя рост и пролиферацию опухоли. Что касается метаболических заболеваний, исследования эндолизосомального пластыря выявляют соединения, которые регулируют эндолизосомальные ионные каналы, предлагая новые подходы к лечению диабета и ожирения. Эндолизосомальная техника наложения пластыря помогает понять эндолизосомальную дисфункцию и найти потенциальные методы^{лечения, значительно} улучшая наше понимание функций эндолизосомальных ионных каналов и способствуя открытию новых мишеней для лекарств.

Protocol

1. Настройка прибора

1. Скобяные изделия
   ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 1 приведена стандартная конфигурация электрофизиологической установки.
   1. Защитите установку от внешних помех с помощью стола и клетки Фарадея.
   2. Используйте инвертированный микроскоп с микроманипулятором для стабильного позиционирования микроэлектрода.
   3. Настройте усилитель для сбора и усиления полученных сигналов.
   4. Используйте дигитайзер для преобразования аналоговых сигналов в цифровые.
   5. Используйте программное обеспечение для сбора и анализа данных для настройки экспериментальных протоколов и извлечения значимых, поддающихся анализу результатов из собранных данных.
2. Электроды
   1. Используйте два электрода: электрод для ванны и электрод для пипетки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Платина и хлорид серебра обладают наилучшими поляризационными свойствами. Электроды из хлорида серебра состоят из серебряной проволоки или гранул, которые были хлорированы, таким образом, имеют слой AgCl на внешней поверхности проволоки или гранулы (Рисунок 2).
3. Подготовка пипетки
   1. Вытягивание
      1. Установите капиллярную трубку в съемник.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Параметры, используемые для изготовления пипеток ниже, зависят от прибора. Инструмент, который мы использовали в этой статье, упоминается в Таблице материалов.
      2. В экспериментальных условиях (комнатная температура 22 °C, нить нагревателя сквозной формы, боросиликатное стекло с нитью), которые не выжигают нить нагревателя, проведите испытание RAMP на съемнике, чтобы определить теплоту сгорания (HEAT), необходимую для плавления стеклянного капилляра.
      3. Разработайте новую программу вытягивания с шестью отдельными циклами вытягивания с использованием параметров HEAT, скорости (VEL) и времени (TIME) (Таблица 1).
         ПРИМЕЧАНИЕ: HEAT относится к параметру, который нагревает нить нагревателя, позволяя стеклянной нити плавиться. Скорость указывает скорость, с которой съемник тянет нить в обоих направлениях. Время представляет собой продолжительность интервала между каждым циклом.
      4. Нажмите зеленую кнопку Pull на клавиатуре.
      5. Ослабьте ручку зажима и извлеките пипетки из съемника.
      6. Осмотрите наконечники пипеток под окуляром микрокузницы, чтобы определить диаметр, остроту и геометрию наконечника. Убедитесь, что диаметр наконечника составляет 0,5-0,9 мкм.
         ПРИМЕЧАНИЕ: По мере того, как нить используется чаще, теплота сгорания, необходимая для плавления стеклянного капилляра, будет меняться.
      7. Если размер наконечника не соответствует ожиданиям, отрегулируйте параметры HEAT и VEL. Более высокие температуры и более высокие скорости позволяют получать более тонкие и длинные наконечники, и наоборот. Отрегулируйте НАГРЕВ с шагом 5 градусов и скорость с шагом 3.
   2. Полировка
      1. Поместите вытянутые патч-пипетки в держатель микрокузницы.
      2. Осмотрите наконечники пипеток с помощью объектива с 35-кратным увеличением (в сочетании с 15-кратным окуляром, что приводит к 525-кратному увеличению).
      3. С помощью микроманипулятора приблизьте пипетки пластыря к нити.
      4. Установите регулятор температуры на 80.
      5. С помощью ножного переключателя включите нагреватель и подайте короткий тепловой импульс (1 - 2 с), контролируя процесс полировки через окуляр микрокузницы.
      6. Повторяйте процесс до тех пор, пока все пипетки не будут отполированы.
      7. Поместите готовые пипетки в герметичную коробку, чтобы предотвратить попадание пыли.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Цель состоит в том, чтобы быстро расплавить наконечник, чтобы стекло изменило конечную геометрию наконечника, не делая его слишком острым. Это предотвращает проникновение пипетки через мембрану везикулы, к которой она прижимается, и эффективно способствует образованию уплотнения. После окончательной полировки внутренний путь наконечника пипетки должен быть очень узким, прямым и линейным.
         Лучшие записывающие пипетки обычно имеют сопротивление 5 - 8 МОм после огневой полировки. Диаметр отверстия наконечника должен составлять 2 мкм. Идеально отполированная патч-пипетка имеет важное значение для успешного формирования гигасила, так как это один из ключевых методов, имеющих решающее значение для успеха процедуры.

2. Подготовка образцов

1. Клеточная культура (на примере HEK293)
   1. Культивируйте клетки в стандартном увлажненном инкубаторе при температуре 37 °C с 5%_CO2.
   2. Культивировали клетки HEK293 в DMEM с низким содержанием глюкозы с добавлением 10% инактивированной при нагревании фетальной бычьей сыворотки (FBS), 100 ЕД/мл пенициллина и 100 мг/мл стрептомицина.
   3. Поместите покровные стекла 12 мм с поли-L-лизиновым покрытием в 24-луночный планшет.
2. Увеличение органелл
   1. Добавьте 1 мкМ вакуолин-1 к клеткам HEK293 в 24-луночном планшете (начиная с шага 2.1) и инкубируйте при 37 °C с 5%_CO2 в течение ночи до тех пор, пока не начнут образовываться увеличенные везикулы.
      Примечание: Размер увеличенных эндолизосом может достигать 1-10 мкм, в зависимости от инструмента, соединения, времени инкубации и типа клеток (Рисунок 3 и Таблица 2).
3. Приготовление раствора
   Примечание: Приготовление стандартного раствора направлено на моделирование концентраций ионов внутри клетки и органелл. Например, стандартные решения для измерения ионных каналов на лизосомах выглядят следующим образом:
   1. Приготовьте раствор для ванны (в мМ): 140 K-метансульфоната (MSA), 5 KOH, 4 NaCl, 0,39 CaCl₂, 1 EGTA, 10 HEPES. Отрегулируйте pH до 7,2 с помощью KOH. Отрегулируйте осмолярность до 300 мосм/л с глюкозой.
   2. Приготовьте раствор пипетки (в мМ): 140 Na-MSA, 5 K-MSA, 2 Ca-MSA, 1 CaCl₂, 10 HEPES, 10 MES. Отрегулируйте pH до 4,6 с помощью MSA. Отрегулируйте осмолярность до 310 мосм/л с глюкозой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пропустите раствор через фильтр 0,2 мкм, приготовьте 45 мл аликвот в конических пробирках объемом 50 мл и храните их при температуре 4 °C до 2-4 недель.

3. Выделение органелл

1. Снимите покровную крышку с обработанными клетками (см. раздел 2) с 24-луночного планшета, перенесите ее в камеру микроскопа и добавьте 1 мл раствора для ванны.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки не должны храниться в растворе ванны в течение >1 ч для экспериментов с цельноэндолизосомальным пластырем, которые включают выделение, герметизацию и запись эндолизосом. Через 1 ч увеличенные эндолизосомы уменьшаются, прилипают к пипетке, и их становится трудно выделить.
2. С помощью самодельной пластиковой иглы для наполнения изолирующей пипетки раствором для пипетки и установите пипетку на переднем конце установки патч-зажима.
3. Установите угол диагонального перемещения микроманипулятора как близкий к 30° (заводское значение по умолчанию).
4. Под микроскопом (объектив 40x и окуляр 10x) исследуйте клетки на предмет достаточно увеличенных эндосом или лизосом, расположенных вблизи края клеточной мембраны для выделения. Переместите изолирующую пипетку близко к выбранной ячейке.
5. Опустите изолирующую пипетку с помощью микроманипулятора до тех пор, пока она не коснется края плазматической мембраны (рис. 4). Быстро переместите изолирующую пипетку горизонтально, чтобы оторвать небольшой кусочек плазматической мембраны.
6. С помощью той же пипетки надавите на клетку с противоположной стороны, чтобы выдавить эндосомы/лизосомы на расстояние ~2 мкм от клетки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если на органелле есть остаточная клеточная мембрана, это может препятствовать образованию гигаseal.
7. Исследуйте выделенную эндолизосому под микроскопом.

4. Формирование Gigaseal

1. Заполните только что отполированную патч-пипетку подходящим раствором для пипетки и установите пипетку на передний конец усилителя.
2. Подайте на пипетку положительное давление 20 - 50 мбар (или используйте 0,03-0,05 мл из шприца объемом 1 мл для контроля давления) и поддерживайте это давление (заблокируйте клапан).
   ПРИМЕЧАНИЕ: 1 мбар (миллибар) = 0,001 бар = 0,1 кПа (килопаскаль) = 1 гПа (гектопаскаль) = 1 000 дин/см2.
3. Переместив наконечник пипетки в раствор для ванны в центре поля зрения, убедитесь, что давление достаточно высокое, чтобы увидеть, как жидкость течет в раствор для ванны.
4. Применяйте повторяющиеся импульсы тока (+5 мВ; 5 мс) для определения сопротивления пипетки, сопротивления уплотнения и последовательного сопротивления. Контролируйте размер наконечника пипетки, формирование уплотнения и создание цельноэндолизосомальной конфигурации.
5. Быстро переместите пипетку близко к верхней части целевого пузырька. Подносите пипетку к пузырьку до тех пор, пока везикула не начнет двигаться или сворачиваться под действием потока жидкости из пипетки (рисунок 5).
6. Отрегулируйте напряжение смещения пипетки на 0 мВ. Немедленно сбросьте положительное давление. В идеале везикула должна быть притянута к пипетке и соединена с мембраной, образуя гигауплотнение (1-20 ГОм) в течение 1 с. Обратите внимание на снижение до <10 пА амплитуды тока, вызванного импульсом напряжения 5 мВ, что указывает на успешное формирование гигауплотнения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Стабильное положительное давление имеет важное значение для формирования гигасил. Иногда утечки в трубках могут предотвратить образование гигауплотнений. Рекомендуется использовать манометр, чтобы убедиться в отсутствии утечек. При обнаружении утечки снова прикрепите трубку или нанесите небольшое количество вазелина на швы, чтобы улучшить герметичность.

5. Измерение тока

1. Разрыв мембраны
   ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от экспериментальных потребностей, контакт электрода с мембраной можно разделить на четыре режима: режим прикрепления к клетке, режим всей клетки, режим изнутри-наружу и режим наружу-наружу (рис. 6).
   1. Для регистрации всего везикулы используйте высоковольтный короткий импульс (ZAP-импульс) длительностью 200 μс или 500 μс , чтобы разорвать мембрану в точке контакта между пипеткой и органеллой. Установите напряжение от -500 мВ до -1 200 мВ, уменьшая его каждый раз на 100 мВ до тех пор, пока мембрана не будет нарушена.
   2. Для режима «изнутри-наружу» (одноканальная запись) после формирования гигауплотнения потяните пипетку в сторону от органеллы, оторвав небольшой кусочек мембраны, обнажив сторону, которая изначально была обращена к просвету везикулы.
   3. Для режима «снаружи-наружу», после формирования гигасил и перехода к режиму полного везикулы, оттяните пипетку от органеллы, отрывая небольшой кусочек мембраны, сохраняя при этом небольшую везикулярную структуру.
2. Текущая запись
   1. Запишите ток через эндолизосомальную мембрану по мере изменения входного напряжения в экспериментах с эндолизосомальным напряжением.
      1. Контролируйте эти напряжения с помощью ступеней напряжения или линейных изменений напряжения; использовать широкий диапазон входных напряжений (например, от -100 мВ до +100 мВ) в экспериментах с эндолизосомальными зажимами напряжения.

Results

Ниже описаны современные формы, наблюдаемые во время экспериментов с эндолизосомальными пластырями. Если текущая форма не соответствует ожидаемой, это может быть связано с плохим контактом или утечкой. Плохой контакт может произойти, если электрод сравнения не полностью контактирует с раствором ванны или если электрод пипетки вот-вот сломается. Утечка может произойти, если между камерой и покровным стеклом есть зазор, позволяющий жидкости стекать на линзу объектива или предметный стол; Слишком большое или слишком малое к...

Discussion

Электрофизиологические экспериментальные установки предъявляют четыре основных лабораторных требования: i) окружающая среда: методы сохранения образца в здоровом состоянии; ii) оптика: методы визуализации образца; iii) механика: методы стабильного позиционирования микроэлектрода; и iv) электроника: методы усиления и записи сигнала.

Для успешного проведения эндолизосомальных экспериментов с наложением пластыря и зажима решающее значение имеют несколько ключевых...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
БОРОСИЛИКАТНОЕ СТЕКЛО	SUTTER INSTRUMENT	BF150-75-10	Наружный диаметр:1,5 мм, внутренний диаметр 0,75 мм 10 см длина, с нитью
Digidata 1140A	Axon Instruments
Инвертированный микроскоп IX73	OLYMPUS
МОДЕЛЬ P-97 Съемник микропипеток	SUTTER INSTRUMENT
MPC-200	SUTTER INSTRUMENT
MultiClamp 700B	Axon Instruments
POLISHER
Быстросъемная камера	Warner Instruments	641943	QR-40LP, для 25 мм Покровные стекла