Методическая статья

Эквибиальное растягивающее устройство для конфокальной флуоресцентной микроскопии живых клеток с большим увеличением

DOI:

10.3791/67520

⸱

13 июня 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute for Bioengineering of Catalonia (IBEC), Barcelona Institute of Science and Technology (BIST), 2University of Barcelona (UB), 3Department of Physics, King's College London, 4ICFO-Institut de Ciencies Fotoniques, The Barcelona Institute of Science and Technology, 5Centro de Investigación Biomédica en Red en Bioingeniería, Biomateriales y Nanomedicina (CIBER-BBN), 6Institució Catalana de Recerca i Estudis Avançats (ICREA)

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этой статье мы представляем универсальное устройство для равноосного растяжения, которое имеет пневматический привод и совместимо с микроскопией высокого разрешения.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Клетки постоянно подвергаются воздействию механических сил в физиологических и патологических ситуациях, включая различные растягивающие и сжимающие напряжения. Ведутся очень активные исследования по изучению того, как клетки и ткани реагируют на такие стрессы и адаптируются к ним, и как эти реакции интегрируются с механохимической сигнализацией. Это породило потребность в сложных инструментах, совместимых со стандартными протоколами культивирования клеток и методами микроскопии, воспроизводящих физиологические стрессы в исследованиях in vitro. В этом исследовании представлены дизайн, функции и характеристики устройства для растяжения, совместимого с оптической и флуоресцентной микроскопией высокого разрешения. Были разработаны и используются в полевых условиях многочисленные устройства для растяжения, как пневматические, так и моторные. Мы подробно представляем одну из этих систем, включая рекомендации по проектированию, различные приложения и все инструменты для создания подобной конфигурации. Система основана на деформируемой мембране из полидиметилсилоксана (PDMS), растянутой в равнобиаксии при подаче вакуума, что обеспечивает однородную, воспроизводимую и контролируемую деформацию образца. Он обеспечивает различные растягивающие напряжения, от точечного и немедленного растяжения до повторяющихся циклов растяжения-отпускания с контролируемой амплитудой и частотой. Покрытие субстрата адгезионными белками позволяет засеивать клетки, несущие флуоресцентные репортеры, в устройство для растяжения и выполнять живую визуализацию этих клеток на растяжении с помощью флуоресцентных микроскопов с большим увеличением. Сжимающие напряжения также могут быть приложены, если дать образцу адаптироваться к растяжению и впоследствии освободить его или засеять образец на предварительно растянутую подложку перед освобождением от растяжения. Дополнительная топографическая структура подложки PDMS позволяет визуализировать один и тот же образец в различных режимах микроскопии (например, флуоресцентной и электронной микроскопии). Полиакриламидные гели также могут быть прикреплены к мембране PDMS, что приводит к растяжению клеток, засеянных на подложках различной жесткости. В целом, применяя контролируемые растягивающие напряжения к живым образцам, это устройство для растяжения в сочетании с высококачественной флуоресцентной микроскопией может решить широкий спектр вопросов механобиологии.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Тонкие деформируемые мембраны из полидиметилсилоксана (PDMS) широко используются в различных устройствах для растяжения, изготовленных по индивидуальному заказу 1,2,3, поскольку PDMS является хорошо зарекомендовавшим себя биосовместимым инертным материалом, совместимым с микроскопической визуализацией. Здесь, как и во многих других 4,5,6,7,8,9, простая концепция применения вакуума используется для деформации мембраны для сборки надежного и управляемого устройства для равноосного растяжения. Путем зажима мембраны внутри круглого кольца и герметизации кольца на вершине «растягивающего столба» (Рисунок 1A-C) достигается равномерная изотропная деформация. Биологический образец расположен в центре кольца на отдельно стоящей мембране PDMS, что позволяет получать изображения с помощью флуоресцентной микроскопии. Здесь представлены две индивидуальные установки, совместимые с двумя моделями столиков микроскопа (рис. 1D-F) и обладающие высокой универсальностью с точки зрения биологического применения. Несмотря на то, что общая конструкция проста и может быть перенесена на другие сцены, размеры установки должны быть тщательно подобраны в соответствии с требованиями к визуализации. После этого профиль деформации устройства должен быть охарактеризован и проверен.

Помимо самой установки, представлен простой метод, сопровождаемый кодом Matlab, для характеристики величины деформации, однородности и изотропии. Растягивающее устройство может быть впоследствии использовано для приложения равноосных растягивающих напряжений к синтетическим системам10, одиночным ячейкам 11,12 или монослоям13, при этом регистрируя с высоким пространственно-временным разрешением биологическую реакцию образца с помощью флуоресцентной микроскопии. Мембрана может быть покрыта различными белками адгезии внеклеточного матрикса14,15. Дополнительные функции могут быть добавлены в соответствии с потребностями биологического исследования. Например, полиакриламидные гели могут быть присоединены к мембране PDMS для настройки жесткости подложки при растяжении13,16, а мембраны PDMS могут быть изготовлены с координатной пронумерованной сеткой для задней визуализации той же области интереса в пределах образца12. Неподвижные растянутые образцы также могут быть обработаны иммуноокрашиванием и впоследствии повторно растянуты для флуоресцентной визуализации17. Применяемая структура растяжения может контролироваться в диапазоне от одного немедленного импульса растяжения до циклической деформации различной величины, частоты или формы14,16.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Проектирование сцены и натяжной стойки (Рисунок 1)

  1. Спроектируйте растяжную стойку, совместимую по размерам с размером сцены/держателями и конфигурацией объектива. Две конкретные растяжные стойки показаны на рисунках 1A, D.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Файлы FreeCAD, представленные в этом протоколе (Дополнительная папка 1), совместимы со следующими микроскопами и столиками Nikon: Eclipse Ni-E вертикальный с ножом NI-SH-E и Eclipse Ti-E/B с инвертированным столиком TI-S-ER , рисунок 1D. Столб может быть напечатан трехмерно (3D), но может деформироваться после многократного использования; Стойки на основе алюминия не будут страдать этим недостатком. Обязательно анодируйте стойки на основе алюминия, чтобы предотвратить окисление. Вертикальная конфигурация обеспечивает большую амплитуду движения. Кроме того, вертикальная конфигурация обеспечивает прямую визуализацию образца без границы раздела, что является оптически выгодным в случае деформируемой мембранной подложки PDMS. Вместо этого, в инвертированной конфигурации, луч освещения проходит через мембрану PDMS (рис. 1F); Поскольку при нанесении на растяжение мембрана PDMS будет двигаться, следует тщательно выбирать иммерсионную среду для объекта (рекомендуются типы погружения в воду, воздух или глицерин; погружение в масло не рекомендуется из-за несовместимости с подложками PDMS). Коммерческие держатели могут быть модифицированы с помощью дополнительных отверстий для винтов; Остерегайтесь использовать винты на основе пластика или тефлона, чтобы избежать попадания пыли во время завинчивания. Может быть удобно сконструировать держатель, который позволяет установить растягивающую стойку на верхней части сцены, как показано на рисунке 1E. Файл FreeCAD, предоставляемый в этом протоколе, совместим с вертикальным микроскопом Eclipse Ni-E.
  2. Спроектируйте натяжные кольца (Рисунок 1C), совместимые по размеру с натяжной стойкой (Рисунок 1A, B). Файлы FreeCAD, предоставляемые в этом протоколе, совместимы с соответствующими постами (чтобы покрыть кольца при работе с образцами, их диаметр может быть выбран так, чтобы он был совместим с размером чашки Петри).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Кольцо также может быть изготовлено на основе алюминия (анодированное) или напечатано на 3D-принтере. Включите прокладки достаточного диаметра для вакуумного уплотнения растягивающего штифта и колец.
  3. Дополнительно: Изготовьте вакуумный контроллер. Электрическая карта блока управления вакуумом, используемого в этом протоколе, представлена в дополнительной информации (см. Дополнительную папку 2). Он позволяет вручную контролировать уровень вакуума, подаваемого на устройство для вытягивания.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Коммерческие вакуумные контроллеры также могут выполнять аналогичные функции и обычно могут сопровождаться управляющим программным обеспечением, позволяющим применять различные типы сигналов (синусоидальные, треугольные и т.д.) (Флуигент, Кобальт).

2. Изготовление растягивающейся мембраны

  1. Дизайн круглых пластин (рекомендуемый материал: полиметакрилат, ПММА). Убедитесь, что эти пластины шире колец и совместимы по размеру с прядильной машиной для нанесения покрытий (Рисунок 2A). Рекомендуемые размеры см. в таблице 1 и в дополнительной папке 3.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для столба 1 использовался диаметр 12 см; для столба 2 диаметром 18-21 см. До и после каждого использования пластины следует тщательно очищать с использованием нетканых салфеток и 96% этанола. Важно избегать накопления PDMS в пластинах, а также на границах и под ними.
  2. Приготовьте PDMS 1:10 и хорошо перемешайте до получения очень однородной эмульсии (используйте рекомендуемые ложки для размешивания).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для 12 см приготовьте 4,5 г на тарелку; Для тарелок 18 см, по 8 г на тарелку. Для приготовления нескольких планшетов приготовьте дополнительные PDMS, например, на 10 мл больше, чем необходимо для 10 планшетов. На 10 пластин по 12 см приготовьте 50 г компонента А и 5 г компонента В. Удобно использовать большие емкости, чтобы легко пипетировать. Емкость не должна содержать пыль или любую другую грязь, которая может препятствовать правильному отжиму и отверждению PDMS. Используйте перчатки из совместимого материала (избегайте латекса; подходят виниловые перчатки) для обеспечения отверждения PDMS.
  3. Дегазация в течение минимум 1 часа с помощью вакуумной камеры.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы, PDMS можно центрифугировать при концентрации 0,2 × г в течение 5 мин с использованием пробирки объемом 50 мл, но имейте в виду, что аспирация смеси PDMS из пробирки с помощью дозирующего шприца затруднена (необходимо для шага 2.4). Не дегазируйте слишком долго (не более 2 часов) под прямым светом, чтобы избежать предварительного отверждения PDMS.
  4. Центробежное покрытие PDMS на верхней части пластин из ПММА
    1. Нанесите 4,2 мл или 7,5 мл дегазированного PDMS на планшеты из ПММА.
    2. Нанесите на пластины отжимное покрытие, используя следующие рекомендуемые настройки:
      1. Отжим покрытия в течение 5 с при 500 об/мин с ускорением 100 об/мин.
      2. Отжим в течение 1 мин при 500 об/мин с ускорением 300 об/мин.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Может быть удобно отметить центр пластины из ПММА на ее нижней стороне, чтобы обеспечить центрирование пластин во время прядения и однородного прядения. Шаг 2.4.2.1 не является обязательным, особенно если параметр ускорения не может быть отрегулирован; Это помогает распределить PDMS перед прядением. Согласно этому протоколу, получаются мембраны PDMS толщиной около 140 мкм (измеренные с помощью интерферометрии; см. дополнительный рисунок 1 и таблицу 2). Калибровка должна быть выполнена до начала экспериментов в случае, если модель или параметры спиннингового устройства приводят к различным характеристикам мембраны.
  5. Храните каждую тарелку в чашке Петри, чтобы избежать накопления пыли, и полимеризуйтесь в течение ночи при температуре 65 °C внутри духовки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Остерегайтесь использования термостойкой посуды. Условия отверждения будут влиять на деформируемость PDMS при заданном уровне вакуума.

3. Сэндвич мембраны в кольцах

  1. Конструкция монтажного материала.
    1. Расчет колец из ПММА внутреннего/наружного диаметра для укладки круговой мембраны PDMS со спиновым покрытием (рис. 2А). Предлагаемые размеры см. в Таблице 1 и Дополнительной папке 3.
    2. Спроектируйте монтажную опору (рисунок 2В), на которую будет помещаться кольцо, а высота также будет определять предварительное натяжение при монтаже мембраны в кольцо.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Монтажная опора может быть простым решением на основе существующей лабораторной посуды (например, чашки Петри). Более элегантным решением является 3D-печать опоры (см. файл FreeCAD этой детали, предоставленный в этом протоколе, см. Дополнительную папку 3), так как высота может быть определена пользователем и легко варьироваться (высота 10 мм использовалась в этом протоколе для маленьких колец). Высоту центральной части опоры следует выбирать меньше высоты полукольца, чтобы подложка PDMS не касалась опоры при монтаже (см. дальнейшее использование в шаге 3.4.2). Для этого подойдет 3D-принтер с использованием нитей полимолочной кислоты (PLA) (см. Таблицу материалов). Режущее кольцо также может быть спроектировано, напечатано на 3D-принтере, чтобы служить ориентиром для скальпеля (Рисунок 2A).
    3. Спроектируйте и изготовьте латунные грузы, совместимые по размеру, чтобы оказывать давление на кольцо при монтаже мембраны (рис. 2C) и обеспечивать воспроизводимое предварительное натяжение.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Файлы FreeCAD, представленные здесь (см. Дополнительную папку 3), соответствуют размерам колец, представленным в этом протоколе.
  2. Снимите мембрану PDMS с пластины из ПММА.
    1. Приготовьте кольца из ПММА поверх листа белой скамьи.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Важно, чтобы скамейка и бумага оставались плоскими, чтобы бумага не соприкасалась с мембраной PDMS во время монтажа.
    2. Осторожно обойдите лезвием край пластины (один или два раза), а затем обведите этот же край острым пинцетом, чтобы убедиться, что PDMS имеет чистый срез по всей окружности (рисунок 2А).
    3. С помощью пинцета осторожно приподнимите мембрану по одному краю. Затем аккуратно очистите край листа PDMS большими пальцами, чтобы равномерно приподнять мембрану по краю. Отсоедините край мембраны от пластины по половине окружности пластины (рисунок 2A).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Заливка нескольких капель 96% этанола ниже мембраны PDMS поможет поднять мембрану, не нарушая ее.
  3. Высушите мембрану PDMS.
    1. Протрите 96% этанолом вокруг всей верхней поверхности предварительно подготовленного кольца из ПММА (шаг 3.2.1), равномерно распределив его пальцами.
    2. Осторожно снимите мембрану PDMS, отодвинув ее от ранее поднятого края (см. в шаге 3.2.3), и поместите ее симметрично на кольцо из ПММА, покрытое этанолом. Удалите все складки с PDMS, но следите за тем, чтобы не растянуть мембрану; Только расправьте его.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Применение предварительного растяжения на этом этапе повлияет на деформируемость PDMS при заданном уровне вакуума.
    3. После полного высыхания этанола убедитесь, что мембрана PDMS плотно приклеена к кольцу из ПММА.
  4. Соберите стрейч-кольцо.
    1. Возьмите еще одно пустое кольцо из ПММА. Поместите его поверх монтажного кольца и с помощью металлических зажимов запечатайте их вместе, поместив мембрану PDMS между двумя кольцами (сэндвич с мембраной PDMS, рисунок 2B).
    2. Поместите нижнюю половину натяжного кольца на монтажную опору, указанную в шаге 3.1.2 (рисунок 2B).
    3. Поместите сэндвич с кольцом PDMS на растягивающее кольцо и сильно нажмите на него, пока он не дойдет до самого низа. Подложка PDMS не соприкасается с монтажной опорой. Закрепите прокладку в правильном положении (рисунок 2B).
    4. Поместите круглые латунные грузики поверх образца (рисунок 2C). При этом применяется фиксированное предварительное натяжение, аналогичное тому, которое используется во всех установленных кольцах, что обеспечивает дополнительную воспроизводимость при калибровке системы.
    5. Поместите верхнюю половину металлического натяжного кольца сверху, совместив отверстия для винтов, установите все винты и затяните (Рисунок 2C).
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе мембрана PDMS имеет отверстия, поэтому не пытайтесь размонтировать или вернуться назад в протоколе.
    6. Аккуратно разрежьте PDMS вокруг кольца лезвием (Рисунок 2C).
    7. Накройте крышкой (например, чашкой Петри), чтобы защитить мембрану от пыли (Рисунок 2C).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если PDMS необходимо функционализировать полиакриламидным гелем, перейдите к разделу 5. Для первоначальных калибровочных измерений перейдите к разделу 6. Если кольцо PDMS будет использоваться для посева клеток, перейдите к разделу 7.

4. Вариант изготовления мембраны PDMS: шаблон опорной сетки

  1. Подготовьте пластину из ПММА (до нанесения спинового покрытия PDMS) с помощью сетки на основе SU8, созданной с помощью фотолитографии (рис. 2D). Для этого разработайте интересующий вас узор для создания фотошаблона пленочной (ацетатной маски).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Файл pdf, предоставляемый в этом протоколе (см. Дополнительную папку 4), создает сетку с альтернативными номерами; см. Рисунок 2D. Сетка может быть создана с помощью простого программного обеспечения, такого как Inkscape с учетом размера узора (или альтернатив, таких как Clewin или FreeCAD). Дизайн может быть напечатан сторонними компаниями на фотопленках (см. Таблицу материалов).
  2. Протокол фотолитографии на пластине из ПММА (оптические свойства ПММА см. в дополнительной папке 3 ).
    1. Проведите кислородно-плазменную обработку пластин из ПММА в течение 20 мин при давлении 7 Вт при постоянном потоке кислорода 0,8 бар.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что возможная пластиковая защита пластин снята, а пластины из ПММА полностью прозрачны.
    2. Выпекать 5 минут при температуре 95 °C.
    3. Охладите пластину из ПММА с помощью азотного пистолета, а затем нанесите на пластину из ПММА 4 мл смолы СУ-8 2100 см (отрегулируйте объем, если используете пластины разных размеров).
    4. Отжим со следующими параметрами (или отрегулируй параметры отжима для создания слоя высотой примерно 10 мкм): 5 с при 500 об/мин с ускорением 100 об/мин с последующим 30 с при 4000 об/мин с ускорением 300 об/мин.
    5. Выпекать 2,5 минуты при температуре 95 °C.
    6. Поместите пластину из ПММА на выравниватель маски в присутствии ацетатной маски и используйте следующие параметры: без i-line. Широкополосное воздействие (от 260 до 460 нм), 25 мВт/см2, экспозиция 7,5 с.
    7. Выпекать 3,5 минуты при температуре 95 °C.
    8. Разработайте шаблон в течение 1 минуты с помощью ацетата монометилового эфира пропиленгликоля.
    9. Тщательно промыть изопропанолом.
    10. Проведите визуальную верификацию качества рисунка с помощью объектива с малым увеличением (2-10x) в светлопольном микроскопе.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Силанизация пластины с рисунком из ПММА увеличивает долговечность рисунка при многократном использовании. Для этого активируйте пластину из ПММА в течение 30 с с помощью кислородной плазмы, а затем проведите обработку трихлор(1H,1H,2H,2H-перфтороктил)силаном в течение 1 часа под вакуумом в химическом колпаке.
  3. Используйте пластину из ПММА с рисунком, как показано в шагах с 2.2 по 2.5, чтобы накрыть растягивающуюся мембрану PDMS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: PDMS с рисунком можно визуализировать в светлопольном микроскопе, как упоминалось ранее, а также в сканирующем электронном микроскопе (рис. 2D). Остерегайтесь того, какой стороной шаблон обращен вверх при монтаже мембраны PDMS в растягивающее кольцо, чтобы получить шаблон в нужной ориентации.

5. Прикрепление геля из полиакриламида (ПАА) поверх мембраны PDMS

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап может быть выполнен либо на мембране PDMS, прикрепленной к пластине из ПММА (см. раздел 2), либо на ранее установленных стретч-кольцах (см. раздел 3). Работа под химическим колпаком; для этапов, связанных с нагревом, удобно использовать небольшой фитинг для духовки под химическим колпаком, см. Таблицу материалов; в противном случае храните образцы в герметичной коробке в духовке).

  1. Предварительное покрытие мембраны PDMS (Рисунок 2E)
    1. Приготовьте раствор для нанесения покрытия, смешав 96% этанола с 10% (3-аминопропил)триэтоксисиланом (APTES) в микроцентрифужной пробирке (например, 20 μL APTES в 180 μL этанола).
    2. Активируйте мембраны PDMS с помощью короноплазменного разрядника на 1 мин (или активируйте на 30 с с помощью кислородного плазменного очистителя).
    3. Поместите 200 μL раствора APTES/этанола в центр мембраны.
    4. Оставьте мембрану при температуре 65 °C в духовке на 1 час.
    5. Дважды постирайте с PBS. Для второй стирки оставьте PBS на 10 минут, встряхивая.
    6. Приготовьте 3% раствор глутаральдегида (GA) в PBS. Поместите 200 μL GA на мембрану на ту же область мембраны, обработанную APTES.
    7. Подождите 25 минут (не более 30 минут).
    8. Дважды вымойте PBS, второй раз встряхивая.
    9. Отсадите жидкость и поместите кольцо в наклонное положение, пока PBS полностью не высохнет.
  2. Силанизация покровного стекла
    1. Приготовьте 6 мл Repel Silane и вылейте его в чашку Петри.
    2. Осторожно опустите в жидкость квадратные стеклянные покровные стекла толщиной 18 мм, одну за другой.
    3. Инкубируйте покровные стекла в течение 5 минут.
    4. Подготовьте два стакана; Один из них содержит 96% этанола, а другой — сверхчистую воду.
    5. Снимите покровное стекло с Repel Silane с помощью пинцета и постирайте сначала в 96% этаноле, а затем постирайте в ультрачистой воде (покровное стекло должно выйти «сухим» от водной стирки).
    6. Дайте высохнуть еще 30 минут на краю чашки Петри.
  3. Прикрепление полиакриламидного геля (ПАА) к мембране PDMS
    1. Разложите половину обработанных Repel Silane покровных стекол на дно чашки Петри.
    2. Приготовьте гелевую смесь ПАА нужной жесткости16,18.
    3. Нанесите каплю 10 μL гелевой смеси поверх каждого покровного стекла.
    4. Положите сверху еще один покровный лист, обработанный Repel Silane, чтобы распределить гель. Не совмещайте два покровных стекла. Убедитесь, что они расположены в форме звезды, чтобы облегчить разделение. Осторожно нажмите, чтобы гель расплющился, но не выходил за пределы области покровного стекла.
    5. Подождите от 45 минут до 1 часа.
    6. Аккуратно отделите покровные стекла с помощью пинцета. Убедитесь, что гель остается прикрепленным к одному из покровных стекол.
    7. Возьмите покровное стекло, к которому прикреплен гель, и поместите гель в контакт с областью PDMS, ранее обработанной GA (рисунок 2E).
    8. Надавите двумя пальцами снизу и сверху в течение 5 с.
    9. Инкубировать при температуре 37 °C в течение ночи.
    10. На следующий день заполните кольцо PBS на 30 минут.
    11. Аккуратно отсоедините верхнюю крышку пинцетом.
    12. Нарисуйте периметр геля ПАА перманентным маркером с другой стороны мембраны PDMS. Это поможет найти образец в следующих шагах.
    13. Аспирация PBS.
    14. Выполните этап функционализации для облегчения прикрепления желаемого белка внеклеточного матрикса к гелю15.

6. Эксплуатация растягивающего устройства, калибровка деформации и оценка разрешения

  1. Подготовьте растягивающее кольцо PDMS с флуоресцентными шариками для калибровки деформации.
    1. Приготовьте разведение 1:50000 0,1 мкм или 0,2 мкм флуоресцентного шарика (см. Таблицу материалов) в растворе фосфатного буферного раствора (PBS) путем последовательного разведения (1:500 промежуточный раствор 1 мл в PBS с 2 мкл исходного раствора гранул с последующим окончательным разбавлением 10 мкл из промежуточного раствора в 1 мл PBS).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Высокая плотность гранул на мембране является оптимальной для этапа калибровки; Не обрабатывайте раствор ультразвуком, так как комочки шариков помогают работе во время калибровки.
    2. Поместите каплю объемом 10-30 мкл в центр PDMS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Монтажная опора может быть удобно спроектирована с насаждением образца крест-накрест по центру
    3. Дайте высохнуть при температуре не выше 40 °C, чтобы избежать проблем со смешением после отверждения.
  2. Подготовьте стретч-кольцо PDMS с флуоресцентными шариками для оценки разрешения.
    1. Следуйте протоколу Коула и др.19 для приготовления раствора гранул с использованием шариков диаметром меньше дифракционного предела, обычно диаметром шариков 0,1 мкм.
      (см. Таблицу материалов). Тщательно обрабатывайте растворы шариков на каждом промежуточном этапе.
    2. Используйте обработку коронным разрядом в центре кольца для активации подложки PDMS.
    3. Немедленно нанесите 20 мкл раствора в гранулах поверх обработанной центральной области PDMS и дайте ей высохнуть.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этом случае раствор шариков сильно разбавляют и инкубируют на гидрофильном PDMS для обеспечения обширного распределения и получения единичных гранул размером 0,1 мкм, адсорбированных на подложке.
  3. Установка растягивающего устройства на держатель предметного столика микроскопа (рис. 1F).
    1. Установите растяжительный столб в микроскоп.
    2. Обильно нанесите смазку (вазелин) сверху на круглую область стойки (средняя часть, рисунок 1D, F).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Использование смазки является обязательным для того, чтобы подложка PDMS преодолевала трение и скользила по стойке, а также необходимо обновлять смазку между каждым образцом. Вазелин используется в качестве очень удобной смазки в установке, представленной в данном протоколе.
    3. Установите стретч-кольцо, подготовленное на шаге 6.1, в стретч-стойку и закрутите верхнюю крышку, чтобы герметизировать сборку.
    4. Подключите контроллер вакуума к источнику вакуума и натяжной стойке (Рисунок 3A).
      1. Подключите заднюю часть блока управления вакуумом к источнику вакуума (рис. 3A).
      2. Подсоедините переднюю часть коробки к стретч-стойке (рис. 1B, D, F).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Источником вакуума может быть вакуумная линия, имеющаяся в инфраструктуре здания. Умеренный вакуум необходим для достаточного растяжения, но зависит от диаметра растяжимого кольца (меньшая деформация будет получена при том же уровне вакуума для меньшего диаметра). В качестве альтернативы коммерчески доступны вакуумные насосы (Fluigent или Elveflow предлагают автономные вакуумные насосы); В этом случае следуйте инструкциям производителя по подключению к источнику вакуума. Не используйте источник вакуума без источника вакуумного управления (например, специально изготовленный блок управления вакуумом, представленный в этом протоколе, или коммерчески доступные системы)
  4. Калибровка деформации
    1. Выберите область интересов, которая включает в себя высокую плотность валиков по всему полю зрения и узнаваемые для пользователя комки бусин (см. рисунок 3B).
    2. Получить изображение "в покое" выбранного поля зрения (сохранить положение).
    3. Применяйте стретч при низком уровне вакуума (в этой конфигурации -20 мбар). Образец будет двигаться во всех направлениях (X-Y-Z).
    4. Сначала перефокусируйтесь в плоскости z.
    5. Переместите рабочую область в направлениях x-y, чтобы найти ту же область интереса, изображенную в состоянии покоя, точно сфокусируйте изображение бусин в растянутом состоянии и получите изображение.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если образец сильно смещен от центра, интересующая область будет значительно смещаться в зависимости от величины деформации. Смещение будет больше вдали от центра, но величина деформации не зависит от расположения образца на подложке. Записывайте изображения без группирования, с разрешением 2048x2048.
    6. Ослабьте напряжение. Повторите шаги 6.4.3-6.4.5 с более высоким уровнем вакуума (-30 мбар, -40 мбар и т.д.).
      ПРИМЕЧАНИЕ: В целях калибровки всегда возвращайтесь в состояние покоя перед повторным растяжением (см. дополнительный рисунок 3A), так как PDMS имеет поведение гистерезиса при деформации.
    7. Установите второе растягивающее кольцо и повторите шаги 6.4.1-6.4.6. Выполните эту калибровку как минимум для 3 различных колец растяжения.
    8. Храните полученные изображения в папке, упорядоченной по образцам.
    9. В каждой папке укажите эталонное изображение бусины, полученное в состоянии покоя reference_str1, и изображения, растянутые при нарастающем вакууме stretched_str1, stretched_str2, stretched_str3 и т.д.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап представляет собой калибровку ядра системы. В зависимости от потребностей пользователя необходимо выполнить дополнительную калибровку с использованием аналогичных образцов валиков, но с использованием других протоколов вакуумного применения. Примените протокол штамма, аналогичный штамму, примененному к биологическому образцу (см. раздел репрезентативных результатов).
  5. Используйте код Matlab для количественной оценки штамма20.
    1. Скачать всю папку Matlab можно по следующей ссылке https://github.com/xt-prc-lab/Le_Roux_et_al_2024_JOVE
      ПРИМЕЧАНИЕ: Основной код, который должен быть запущен, называется gel_strain и вызывает другие файлы кода Matlab, которые должны храниться в той же папке, что и основной код.
    2. Откройте Matlab и откройте код gel_strain.
    3. Задайте параметры (рекомендуемые настройки см. в таблице 3, Code_Parameter ).
    4. Определите пути к родительской папке и папке эксперимента, как указано в коде.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если папка не существует, код покажет всплывающее окно с предупреждением; Выберите «Добавить в путь » и перейдите к экспериментальной папке, в которой хранятся изображения.
    5. Запустите код gel_strain .
    6. Откройте stretched_str1 как того требует код.
    7. Откройте reference_str1 как того требует код.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Удобно обрабатывать все растянутые изображения при разных уровнях вакуума одновременно, как указано в данном протоколе; Все файлы должны храниться в одной экспериментальной папке, но код запрашивает только открытие первого растянутого изображения. Имена изображений должны заканчиваться именами strX, где X - это порядковые цифры 1, 2, 3 и т.д., как указано в пункте 6.4.9 этой главы.
    8. Убедитесь, что папка результатов отображается с 4 подпапками: Croppeddata, содержащими обрезанные и выровненные данные; Смещения, содержащие файл смещения борта; Изображения , содержащие график радиальных перемещений и деформаций; Деформации , содержащие таблицу матрицы деформаций, полученной для каждого уровня вакуума.
      1. Рассчитайте медиану матрицы деформаций для каждого уровня вакуума.
      2. Повторите для каждого образца (минимум 3).
      3. Постройте график зависимости медианной матрицы деформации от уровня вакуума для 3 образцов, чтобы получить калибровочную кривую (рис. 3C).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые параметры могут быть изменены в случае, если изображение бусины не обрабатывается должным образом из кода. Для этого откройте set_settings_stretch файла в Matlab и измените Settings.Resolution и Settings.Overlap в соответствии с рекомендациями в комментариях к коду (также см. Таблицу 3). В зависимости от экспериментальных потребностей, штамм, применяемый к биологическому образцу, может варьироваться (циклическая деформация, большая деформация и т. д.): рекомендуется калибровка этих условий (см. примеры на дополнительном рисунке 2 и дополнительном рисунке 3).
  6. Оценка разрешающей способности (в соответствии с протоколом Cole et al.19)
    1. Установите натяжное кольцо, подготовленное в шаге 6.2.
    2. Изобразите поле зрения, содержащее отдельные точки бусин (представьте стопку с расстоянием по Z, соответствующим используемому объективу).
    3. Используйте MetroloJ (плагин для Фиджи), как указано в Cole et al., для определения разрешения X-Y-Z установки растяжения (Рисунок 3D и Дополнительный рисунок 4).

7. Посев и растяжение ячеек

  1. Покрытие PDMS белком клеточной адгезии
    1. Простерилизуйте кольцо PDMS, подвергнув его воздействию ультрафиолетового света в течение 15 минут (рисунок 4A). Выполняйте все последующие этапы протокола под биокапюшоном, чтобы обеспечить стерильность.
    2. Промойте тарелку под капотом стерильным ПБС.
    3. Инкубируйте белок клеточной адгезии 11,14,15, нанося каплю раствора объемом 100-200 мкл в центр кольца (рисунок 4А).
      Примечание: Как правило, целесообразным является раствор 10 г/мл фибронектина11. Другие белки адгезии, представляющие интерес, могут быть использованы для покрытия PDMS (например, ламинин, кератин15; могут потребоваться специфические методы лечения/протоколы). Рекомендуется проводить инкубацию на предмет покрытия фибронектином в течение ночи при температуре 4 °C; альтернативный метод – 1 ч при 37 °C.
    4. Нарисуйте перманентным маркером периметр капли с нижней стороны мембраны PDMS. Это помогает найти образец в следующих шагах.
  2. Посев клеток на кольцо PDMS (рис. 4A).
    1. При необходимости трансфектируйте интересующие клетки флуоресцентным белком до эксперимента с растяжением (для транзиторной трансфекции за 1-3 дня до эксперимента, в зависимости от метода трансфекции и характеристик) или используйте специальные протоколы для визуализации интересующих флуоресцентных маркеров.
      Примечание: Для начальных экспериментов удобно использовать маркер плазматической мембраны, такой как GFP-mem11,12, для визуализации реакции клеточной мембраны и потенциальных разрывов. Маркер легко трансфицируется, и рекомендуется растягивать трансфицированные клетки при возрастающем уровне деформации, чтобы оценить порог деформации, который приведет к разрыву плазматической мембраны. Смотрите карту плазмид в Дополнительной папке 5. Это зависит от типа клетки и будет ниже в экспериментах с одиночными клетками по сравнению с клеточными монослоями. Этот мембранный маркер совместим с растяжением клеток, в отличие от некоторых мембранных красителей, которые, как было замечено, приводят к разрыву плазматической мембраны при низких уровнях растяжения.
    2. В день эксперимента согрейте клеточные среды и приготовьтеCO2-независимые среды.
      Примечание: Если микроскоп имеет контроль CO2 , совместимый с системой стретч, эксперименты можно проводить в обычных средах для культивирования клеток (это было бы необходимой установкой для чувствительных образцов, которые не могут выжить вCO2-независимых средах). Рекомендуется использоватьCO2-независимый с добавкой антиотбеливающего агента (например, для белков GFP добавка рутина21 в концентрации 10 мг/мл).
    3. Трипсинизируйте клетки и посчитайте их.
    4. Засейте соответствующее количество клеток в небольшом объеме (20-50 мкл) стандартной клеточной средой для стимулирования прикрепления клеток и храните в инкубаторе с контролируемой влажностьюCO2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для плоских и больших фибробластов и экспериментов с одиночными клетками, 5000 клеток; Числа зависят от типа клетки и самого эксперимента.
    5. После 20-30 минут инкубации (проверьте первоначальное прикрепление клеток) аккуратно добавьте 500 мкл среды поверх клеток. Поместите обратно в инкубатор, чтобы обеспечить дальнейшее распространение клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Время посева зависит от типа ячейки и от требований эксперимента; Также возможно формирование монослоя с ночной инкубацией. Объем питательных сред должен быть соответствующим образом отрегулирован. Вторичное окрашивание клеток: после прикрепления клетки могут быть окрашены красителем, таким как SpyDNA (см. Таблицу материалов) для визуализации ядер (дополнительный рисунок 5) или другим окрашиванием для визуализации любой интересующей структуры. Всегда имейте в виду, что окрашивание живых клеток или чрезмерная экспрессия белков при трансфекции могут повлиять на реакцию клеток на растяжение, особенно в коре головного мозга, плазматической мембране или механочувствительных белках/структурах.
    6. Замените наCO2-независимый носитель и немедленно используйте в устройстве для растяжения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Теперь образец готов к эксперименту по растяжению.
  3. Эксперимент по растяжению клеток: пример одного цикла растяжения-высвобождения и визуализация плазматической мембраны (ПМ) для захвата динамического ремоделирования фибробластов ТЧ.
    1. Установите стретч-кольцо на предметный столик микроскопа, как показано в разделе 6, шаг 6.2.
    2. Найдите интересующую вас ячейку, запишите ее положение и сделайте снимок предварительно растянутой ячейки (рисунок 4B).
    3. Подайте желаемый вакуум, который в соответствии с калибровочной кривой соответствует желаемому напряжению подложки.
    4. Чтобы найти растянутую ячейку, сначала сфокусируйтесь по оси Z, а затем двигайтесь в направлении X-Y, чтобы найти и центрировать ячейку обратно в поле зрения.
    5. Записывайте изображения в течение нужной длительности (рис. 4B).
      Примечание: Первоначальные эксперименты обычно необходимы для определения реакции клетки на растягивающую деформацию в зависимости от ее типа (в среднем). Растяните клетки при различных деформациях субстрата, чтобы определить максимальную растягивающую нагрузку, которую они могут вынести. Разрыв плазматической мембраны произойдет, как визуализируется с помощью маркера флуоресцентной мембраны плазматической мембраны, если напряжение является чрезмерным для клетки.
    6. Для высвобождения клеток вернитесь в положение ячейки в состоянии покоя и включите режим сбора микроскопа, чтобы сбор данных мог начаться, как только образец будет перефокусирован.
    7. Отпустите растяжку и быстро перефокусируйтесь вручную в Z.
    8. Запишите изображения освобожденной ячейки за нужное время (рисунок 4B). Благодаря гибкому характеру мембраны PDMS образец со временем легко расфокусируется. Поэтому вручную настраивайте фокус на протяжении всего процесса получения изображения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для успешной перефокусировки во время съемки после отпускания, изображения должны визуализироваться достаточно часто; Разумно вести видео каждые 3-5 минут каждые 3 секунды. Подложка PDMS несовместима с идеальной системой фокусировки микроскопа, поэтому обычно требуется ручная настройка пользователем для быстрого захвата. Программная фокусировка может быть решена, но остерегайтесь возможных ошибок и больших движений сцены, которые могут повредить цель, ударив растянутую стойку. Пользователь может выбрать выполнение нескольких растяжек образца в зависимости от эксперимента.
  4. Постобработка: Выровняйте изображения с помощью Fiji
    1. Откройте изображения в состоянии покоя и напрягитесь.
    2. Используйте сопоставление шаблона плагина Fiji и выберите область ячейки для выравнивания (рисунок 4C).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Относительные смещения выровненного изображения деформации визуализируются Фиджи, а изображения обрезаются и выравниваются. Скачать плагин template_matching можно по этой ссылке: https://sites.google.com/site/qingzongtseng/template-matching-ij-plugin

8. Посев клеток на предварительно растянутый субстрат

  1. Установите растянутое кольцо, покрытое адгезионным белком, в устройство для растяжения.
  2. Растяните подложку PDMS до нужного уровня деформации.
  3. Засейте ячейки, как показано в разделе 7.
    Примечание: В этом эксперименте посев не проводится в стерильных условиях, поэтому протокол может не подходить для всех типов клеток.
  4. После того, как клетки прилипнут, замените среду наCO2-независимую среду.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выбирайте быстро адгезирующие ячейки, чтобы свести к минимуму время прилипания.
  5. По истечении желаемого времени инкубации отпустите растяжку и сфотографируйте интересующую вас клетку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе трудно найти ту же самую клетку после высвобождения растяжения, так как положение клетки в состоянии покоя неизвестно, а движение субстрата PDMS трудно предсказать.

9. Фиксация растянутых или расслабленных клеток

  1. Фиксация клеток в растянутом состоянии (работа под химическим колпаком)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Параформальдегид (PFA) является стандартным фиксирующим агентом; используйте его теплым при температуре 37 °C, чтобы обеспечить быструю фиксацию. В качестве альтернативы, глиоксальный раствор22 обеспечивает быструю фиксацию образца с хорошей сохранностью образца.
    1. Приготовьте фиксирующее средство.
    2. Затравите ячейки на кольца после выполнения шага 7.2.
    3. Установите натяжную стойку и контроллер внутри химического колпака и подключите его к источнику вакуума.
    4. Поместите кольцо с засеянными ячейками в растяжку.
    5. Чтобы зафиксировать растянутое состояние, растягивайтесь до нужной деформации. Удалите питательную среду для клеточных культур и зафиксируйте, добавив в клетки 4% раствор PFA в течение 10 минут при 37 °C. Затем постирайте PBS, всегда удерживая растяжку. Медленно отпустите пылесос и мойте с большим количеством PBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не забудьте подготовить контрольное состояние без растяжения (для этого небольшой кусочек PDMS можно разрезать и высушить с небольшим количеством 96% раствора этанола под ним, поверх стеклянного покровного стекла). Чтобы отобразить неподвижный образец, рекомендуется растянуть образец обратно на ту же величину. Поскольку PFA токсична, на этом этапе необходимо принять адекватные меры предосторожности. Удобно использовать небольшую духовку, которую можно держать под колпаком, см. Таблица материалов).
    6. Изобразите образец, желательно снова подавая вакуум, до того же уровня, который использовался при фиксации, что обеспечивает «сплющивание» образца (рисунок 4D).
  2. Фиксируйте ячейку после растяжения-отпускания (работа под химическим колпаком).
    1. Растяните клетки до нужного напряжения и времени. Непосредственно перед растяжением удалите большую часть среды, не высушив образец полностью, и ослабьте напряжение. В качестве альтернативы можно применить циклическую растяжку определенной продолжительности.
    2. Быстро удалите носитель и немедленно зафиксируйте фиксирующим раствором на 10 минут. Умойте PBS и сфотографируйте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Образец также может быть засеян на предварительно растянутую подложку и, после определенного пользователем времени посева, зафиксированный выпуск после растяжения, как показано на шаге 9.2.2.
  3. Иммунофлюоресценция фиксированного образца: соблюдение стандартных протоколов иммунофлюоресценции на растянутом или высвобожденном образце; Блокирование рыбным желатином предпочтительнее, чем BSA17.
  4. Сделайте изображение образца (рисунок 4E).
  5. Консервация образцов
    1. Подготовьте монтажный носитель для консервации образца (Mowiol или Prolong).
    2. Снимите PBS и добавьте каплю (около 75 мкл) монтажного материала.
    3. Возьмите покровный лист пинцетом и аккуратно положите его сверху (избегайте пузырей, которые могли бы затруднить визуализацию).
    4. Сушить не менее 48 часов при комнатной температуре (RT).
    5. Разрежьте вокруг PDMS неподвижный образец и установите другой стеклянный покровный лист для последующей визуализации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг несовместим с последующим получением изображения образца на растянутой мембране, так как установка мембраны PDMS на покровное стекло с консервационной средой предполагает сохранение мембраны только в расслабленном состоянии.

10. Фиксация сеткой для визуализации одной и той же области образца в разных режимах - на примере СЭМ-визуализации

Примечание: Этот протокол может быть использован для получения изображений одной и той же отдельной клетки в двух разных микроскопах, флуоресцентной микроскопии и сканирующей электронной микроскопии, как представлено здесь. Коррелятивная визуализация требует расширенной обработки изображений, которая не входит в сферу действия этого протокола. Другими полезными приложениями могут быть, например, визуализация образца в реальном режиме, дальнейшая фиксация под капотом и визуализация той же клетки после иммуноокрашивания (протокол, используемый для дополнительного рисунка 5).

  1. Приготовьте стрейч-кольцо с помощью узорчатых пластин из ПММА из раздела 4.
  2. Засейте клетки, как показано в шаге 7.2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Имейте в виду, что решение для нанесения покрытия должно быть нанесено осторожно, чтобы обеспечить полное покрытие PDMS, даже в небольших отверстиях решетки.
  3. Фиксируйте так, как описано в разделе 8, но с использованием соответствующего фиксатора и протокола, совместимого с образцом и электронным микроскопическим изображением.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании смеси PFA + глутаральдегид (например, 2%-2,5%), остерегайтесь автофлуоресценции, возникающей в присутствии реагента глутарового альдегида, и в конечном итоге выполните стадиюгашения 23.
  4. Визуализируйте образец в флуоресцентном режиме и запишите положение ячейки (например, распечатайте сетку и отметьте положение крестиком).
  5. После того, как все снимки будут сделаны, подготовьте образец для ЭМ, сначала разрезав PDMS вокруг образца (предварительно удалив смазку).
  6. Обработка мембраны PDMS + образец для сканирующей электронной микроскопии (которая включает стандартный протокол обезвоживания образца и распыления металлов)12.
  7. При визуализации в микроскопе SEM найдите положения сетки и найдите клетки, ранее изображенные в флуоресцентном режиме (рис. 4F, G).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Калибровка и радиальность
Правильная характеристика полученного штамма является гарантией воспроизводимости и контроля экспериментов. В то время как флуоресцентные шарики могут быть добавлены к каждому образцу для точной регистрации деформации, предыдущий этап калибровки обеспечивает надлежащее планирование эксперимента, зная величину деформации, которую экспериментатор хочет применить к образцу, до фактического растяжения. Деформация будет зависеть не только от приложенного вакуума, но и от размеров ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Большое количество устройств для растяжения было использовано для нанесения механического растяжения на биологические образцы, имитирующие физиологические условия в организме24,25. В литературе доступны многочисленные установки, и наблюдение за реакцией образца обычно выполняется путем сопряжения растягивающих устройств с атомной силой26 или флуоресцентной микроскопией27,11

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы не заявляем о конфликте интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана финансированием Фонда "la Caixa" (грант 406 LCF/PR/HR20/52400004 X.T., J.V.R. и P.R.-C., а также стипендиями LCF/BQ/DR19/11740009 407 I.G.-M. и LCF/BQ/DR19/11740009 M.M.J.), Министерством науки и инноваций Испании 408 (PID2022-142672NB-I00 - P.R.-C., PID2021-128635NB-I00 к X.T., и PID2022-141040NA-I00 409 к I.A.), Женералитат Каталонии (2021 SGR 01425 к X.T. и P.R.-C.), Премия "ICREA 410 Academia" за выдающиеся достижения в исследованиях P.R.-C., Fundació la Marató de TV3 (201936-30-31 до 411 P.R.-C.), Европейский Союз (ERC, MECHANOSYNTH, грант 101097753 для P.R-C. и ERC, Adv-412 883739 Epifold to X.T.). Тем не менее, выраженные взгляды и мнения принадлежат только авторам (авторам) и не обязательно отражают точку зрения Европейского Союза или Исполнительного агентства Европейского исследовательского совета. Ни Европейский Союз, ни орган, предоставляющий грант, не могут нести за них ответственность. A.E.M.B. был поддержан стипендией сэра Генри Уэллкома (210887/Z/18/Z). Авторы выражают признательность за финансирование от стипендии Хуана де Ла Сиерва, поддерживаемой MCIU/AEI/10.13039/501100011033 и Европейским социальным фондом плюс (FSE+) (JDC2023-051559-I to V.V.). МБЭС является лауреатом премии Severo 415 Ochoa Award of Excellence от MINCIN. Мы благодарим V González-Tarragó за помощь с системой стретч-контроля и Evelyn Coderch за техническую поддержку. Мы также хотели бы выразить признательность за поддержку, оказанную Unitat de Criomicroscòpia Electrònica TEM/SEM (Centres Científics i Tecnològics de la Universitat de Barcelona, CCiTUB) и MicroFabSpace and Microscopy Characterization Facility, Unit 7 ICTS 'NANBIOSIS' от CIBER-BBN в IBEC. Мы также благодарим Марию Гарсию Парахо за содействие в общении с механической мастерской ICFO и Tecnifill за бесперебойную помощь в проектировании деталей.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Ацетатная маскаФотоданные JD
АкриламидБиорад161-014040% раствор акриламида
АПССигма ОлдричА3678Персульфат аммония для электрофореза, ≥ 98%
АптесСигма Олдрич281778(3-аминопропил)триэтоксисилан
Автономный микрофлюидный насосЭльвефлоу КобальтКобальт ДуалКобальт Дуал
БисаакриламидБиорад161-01422% раствор Bis
ЛезвиеНаучный центр Фишера11733919Дидактическая группа Hoja did&aute; ctica X100 LAME BISTOURI STERILE N° 23  LAMD23 
КлипыСпринтисAKXX000001Зажимы для бульдогов, 32 мм, металлические, вместимость 10 мм, никелированные
Средство для лечения короныЭлектротехнические изделияBD-20AC, Артикул:12051ABD-20AC ЛАБОРАТОРНЫЙ ПРОТРАВИТЕЛЬ КОРОНЫ
ЧашкиВВР611-1368VWR, стаканы, одноразовые, 250 мл
DAPIРош10236276001Окрашивание DAPI
Этанол 96%Panreac Quí слюда, SLU131085-1212Этанол 96% v/v в паре с острым; lisis, ACS- 2,5 л
ФибронектинСигмаФ0895Фибронектин, Из плазмы человека, жидкий  0.1%
Флюосферы Карбоксилат-модифицированные микросферы, 0,1 & микро; mТехнологии LifeФ8801, Ф8803Желто-зеленые и красные флуоресцентные бусины для оценки разрешения
Флюосферы Карбоксилат-модифицированные микросферы, 0,2 & микро; mНаучный центр ФишераФ8809, Ф8810Желто-зеленые и красные флуоресцентные шарики для калибровки деформации
ГлутаральдегидСигма ОлдричГ6403Раствор глутарового альдегида 50% в H2O
ИнтерферометрVeeco Вайко NT1100Интерферометр для измерения толщины мембран PDMS
ИзопропанолPanreac Quí слюда, SLU131090-1212 2-Propanol (Reag. Ph. Eur.) para aná lisis, ACS, ISO
Лайтон веситИзготовление на заказ
Безворсовые тканиБеркширDURX670, DR670090920Нетканые салфетки
Лубрикант (вазелин)Сигма16415Вазелин
Выравниватель масокSü ss MicroTec MJB4 Выравниватель масок для фотолитографии на пластинах из ПММА
МовиолCalbiochem - Merck475904MOWIOL 4-88 Реагент
Микроскоп NIKON вращающийся диск конфокальныйКомпания NikonЗатмение Ti-E/Bоснащен Nikon Ti-S-ER  сцена
Микроскоп NIKON вертикальныйКомпания NikonЗатмение Ni-Eоснащен столиком Nikon NI-SH-E
Цель 60xКомпания NikonCFI Apo NIR 60X ВтNIR Apo 60X/1.0w DIC N2 WD 2.8
Решение PBSGibco14200067DPBS, 10x
ПДМСDow Corning2401673921Sylgard - 184 Комплект силиконовых эластомеров DN 109
Крышка кольца чашки Петри (большая)Прокинорте93060Plato de cultivo celular TPP Артикул: 07177925 diametro 100
Крышка кольца чашки Петри (маленькая)Прокинорте93060Plato de cultivo celular TPP SKU: 07177924
Плазменный очистительХаррик ПДК-002Кислородный плазменный генератор
Пластины и кольца из ПММАТаблицу спецификаций Excel см. в дополнительных документах
ПродлеватьИнвитрогенП36930 /П36934Реагент ProLong Gold против выцветания
Репел-СиланGE Healthcare17-1332-01PlusOne Репел-Силан ЭС
Кольца / резиновое кольцоТекнифилИзготовление на заказ
Прядильный аппарат для нанесения покрытийЛаврWS-650SzПрядильный аппарат для нанесения покрытий
SPY650-ДНКСпирохромПК 501SPY650-ДНК
Рулевая ложкаВВР231-0416Короткий одноразовый шпатель Eco, двусторонняя ложка и совок, полипропилен и добавка EcoPure
Смола SU8 2100МикрохимY111075СУ8-2100
SU8-РазработчикСигма-Олдрич484431Ацетат монометилового эфира пропиленгликоля
ТЕМЕДСигма-ОлдричТ9281-50МЛN,N,N',N'-Тетраметилэтилендиамин, биореагент суитаб. Реагент для электрофореза
Трихлор(1H,1H,2H,2H-перфтороктил)силан Сигма Олдрич448931  Трихлор(1H,1H,2H,2H-перфтороктил)силан
ПинцетИЕСМАТТ5039 Пинцет Dumont HP 7 из нержавеющей стали. Наконечник 0,17 x 0,10 мм. (Агар Сайентиал Лтд)
Вакуумный контроллерГАРКАП/Паркер  990-005203-005 Controlador de vacio 
Вакуумный контроллер fluigentФлуигентЛУ-ФЕСКА-Н800LineUp Flow EZ (n800mbar)
Белая скамья бумагиРайма931.1001  Бумага Raima 42 x 52

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Huang, L., Mathieu, P. S., Helmke, B. P. A stretching device for high-resolution live-cell imaging. Ann Biomed Eng. 38 (5), 1728-1740 (2010).
  2. Meza, D., Abejar, L., Rubenstein, D. A., Yin, W. A shearing-stretching device that can apply physiological fluid shear stress and cyclic stretch concurrently to endothelial cells. J Biomech. Eng. 138 (3), 4032550(2016).
  3. Constantinou, I., Bastounis, E. E. Cell-stretching devices: advances and challenges in biomedical research and live-cell imaging. Trends Biotechnol. 41 (7), 939-950 (2023).
  4. Trepat, X., et al. Viscoelasticity of human alveolar epithelial cells subjected to stretch. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 287 (5), L1025-L1034 (2004).
  5. Kaunas, R., Nguyen, P., Usami, S., Chien, S. Cooperative effects of Rho and mechanical stretch on stress fiber organization. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (44), 15895-15900 (2005).
  6. Barbee, K. A., Macarak, E. J., Thibault, L. E. Strain measurements in cultured vascular smooth muscle cells subjected to mechanical deformation. Ann Biomed Eng. 22 (1), 14-22 (1994).
  7. Wipff, P. J., et al. The covalent attachment of adhesion molecules to silicone membranes for cell stretching applications. Biomaterials. 30 (9), 1781-1789 (2009).
  8. Wen, H., Blume, P. A., Sumpio, B. E. Role of integrins and focal adhesion kinase in the orientation of dermal fibroblasts exposed to cyclic strain. Int Wound J. 6 (2), 149-158 (2009).
  9. Chu, S. Y., et al. Mechanical stretch induces hair regeneration through the alternative activation of macrophages. Nat. Commun. 10 (1), 1524(2019).
  10. Le Roux, A. L., et al. Dynamic mechanochemical feedback between curved membranes and BAR protein self-organization. Nat. Commun. 12 (1), 6550(2021).
  11. Kosmalska, A. J., et al. Physical principles of membrane remodelling during cell mechanoadaptation. Nat. Commun. 6 (1), 7292(2015).
  12. Quiroga, X., et al. A mechanosensing mechanism controls plasma membrane shape homeostasis at the nanoscale. Elife. 12, e72316(2023).
  13. Casares, L., et al. Hydraulic fracture during epithelial stretching. Nat Mater. 14 (3), 343-351 (2015).
  14. Beedle, A. E. M., et al. Fibrillar adhesion dynamics govern the timescales of nuclear mechano-response via the vimentin cytoskeleton. bioRxiv. , (2023).
  15. Kechagia, Z., et al. The laminin-keratin link shields the nucleus from mechanical deformation and signalling. Nat Mater. 22 (11), 1409-1420 (2023).
  16. Andreu, I., et al. The force loading rate drives cell mechanosensing through both reinforcement and cytoskeletal softening. Nat. Commun. 12 (1), 4229(2021).
  17. Phuyal, S., et al. Mechanical strain stimulates COPII -dependent secretory trafficking via Rac1. EMBO J. 41 (18), e110596(2022).
  18. Oria, R., et al. Force loading explains spatial sensing of ligands by cells. Nature. 552 (7684), 219-224 (2017).
  19. Cole, R. W., Jinadasa, T., Brown, C. M. Measuring and interpreting point spread functions to determine confocal microscope resolution and ensure quality control. Nat Protoc. 6 (12), 1929-1941 (2011).
  20. Faure, M. L., Gómez-González, M., Baguer, O., Comelles, J., Martínez, E., Arroyo, M., Trepat, X., Roca-Cusachs, P. 3D Micropatterned Traction Force Microscopy: A Technique to Control 3D Cell Shape While Measuring Cell-Substrate Force Transmission. Advanced Science. 46, 2406932(2024).
  21. Bogdanov, A. M., Kudryavtseva, E. I., Lukyanov, K. A. Anti-fading media for live cell GFP imaging. PLoS One. 7 (12), 53004(2012).
  22. Richter, K. N., et al. Glyoxal as an alternative fixative to formaldehyde in immunostaining and super-resolution microscopy. EMBO J. 37 (1), 139-159 (2018).
  23. Kopek, B. G., et al. Diverse protocols for correlative super-resolution fluorescence imaging and electron microscopy of chemically fixed samples. Nat Protoc. 12 (5), 916-946 (2017).
  24. Balachandran, K., et al. Cyclic strain induces dual-mode endothelial to mesenchymal transformation of the cardiac valve. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (50), 19943-19948 (2011).
  25. Kamble, H., Barton, M. J., Jun, M., Park, S., Nguyen, N. T. Cell stretching devices as research tools: Engineering and biological considerations. Lab Chip. 16 (17), 3193-3203 (2016).
  26. Jorba, I., et al. Nonlinear elasticity of the lung extracellular microenvironment is regulated by macroscale tissue strain. Acta Biomater. 92, 265-276 (2019).
  27. Mayer, C. R., Arsenovic, P. T., Bathula, K., Denis, K. B., Conway, D. E. Characterization of 3D printed stretching devices for imaging force transmission in live-cells. Cell Mol Bioeng. 12 (4), 289-300 (2019).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи