Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Забор вестибулярных конечных органов в физиологических условиях при лабиринтезии

1.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/67523

⸱

29 ноября 2024 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Otolaryngology - Head & Neck Surgery, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Solomon H. Snyder Department of Neuroscience, Johns Hopkins University School of Medicine, 3Department of Functional Anatomy and Evolution, Johns Hopkins University School of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

В данной статье мы описываем методику забора вестибулярных конечных органов человека в физиологических условиях во время лабиринтэктомии и их анализ с помощью иммуноокрашивания.

Аннотация

Живое внутреннее ухо человека сложно изучить, потому что оно заключено в плотную глазную капсульную кость, которая ограничивает доступ к биологической ткани. Традиционные методы гистопатологии височной кости основаны на длительных и дорогостоящих протоколах декальцинации, которые занимают 9-10 месяцев и сокращают количество видов анализа тканей, возможных из-за деградации РНК. Существует острая необходимость в разработке методов доступа к свежим тканям внутреннего уха человека, чтобы лучше понять отологические заболевания, такие как болезнь Меньера, на клеточном и молекулярном уровне. В данной статье описана методика забора вестибулярных конечных органов человека у живого донора в физиологических условиях. Пациенту с болезнью Меньера и «приступами падений», которые были рефрактерны к внутритимпанальной инъекции гентамицина, была выполнена лабиринтэктомия. Сначала была выполнена традиционная мастоидэктомия, в ходе которой были определены горизонтальные и верхние полукружные каналы (ПКК). Сосцевидная полость была заполнена сбалансированным солевым раствором, чтобы лабиринт мог быть открыт в более физиологических условиях для сохранения клеточной целостности. Для визуализации погруженной сосцевидной полости использовали эндоскоп нулевого градуса с системой орошения оболочки для очистки линз, а для скелетирования и вскрытия горизонтального и верхнего ПКК с последующим преддверием был использован алмазный жернов толщиной 2 мм. Были собраны ампулы и часть протоков канала для верхнего и бокового ПКК. Утрикулу собирали аналогичным образом. Собранную ткань немедленно помещали в ледяной буфер, а затем фиксировали в течение одного часа в 4% параформальдегиде в фосфатно-солевом буфере (PBS). Салфетку несколько раз промывали в 1x PBS и хранили в течение 48 ч при 4 °C. Образцы тканей подвергали иммуноокрашиванию комбинацией первичных антител против тенасцина-С (Calyx), онкомодулина (стреолярные волосковые клетки), кальретинина (Calyx и волосковые клетки II типа), синаптического везикулярного белка 2 (эфферентные волокна и бутоны), β-тубулина 1 (Calyx и афферентные бутоны) с последующей инкубацией с флуорофор-конъюгированными вторичными антителами. Затем образцы тканей промывали и устанавливали для конфокального микроскопического исследования. Изображения показали наличие ампулярных и макулярных волосковых клеток и нервных структур. Этот протокол демонстрирует, что можно получить неповрежденную, высококачественную ткань внутреннего уха человека от живых доноров и может стать важным инструментом для изучения отологических заболеваний.

Введение

Живое внутреннее ухо человека сложно изучить из-за его расположения в плотной глазной капсуле височной кости. Следовательно, доступ к внутренним тканям человека был ограничен, и исследователи в основном полагались на посмертный забор тканей. Посмертная гистопатология височной кости (ТГК) уже более 100 лет является важнейшим инструментом для понимания отологических заболеваний человека 1,2,3. Ткань для ТГБ подготавливается путем посмертного забора височной кости, длительного (9-10 месяцев) процесса декальцинации и подготовки тканей с последующим окрашиванием гематоксилином и эозином. В то время как TBH останется важным инструментом для получения новой информации о здоровом и больном внутреннем ухе человека, длительное время вскрытия и длительные и жесткие методы обработки тканей ограничивают его полезность для определенных целей, что требует дополнительных методов изучения тканей внутреннего уха человека. Магнитно-резонансная томография с высоким разрешением позволяет визуализировать органы внутреннего уха, но не обладает достаточным разрешением для просмотра структур на клеточном или молекулярном уровне 4,5. Из-за этих проблем многие заболевания внутреннего уха человека остаются малоизученными.

Альтернативным подходом является забор тканей внутреннего уха во время операции. Во время лабиринтэктомии или транслабиринтной вестибулярной резекции шваннома ткани внутреннего уха намеренно приносятся в жертву. Утрикулы, собранные у пациентов во время транслабиринтной вестибулярной резекции шванномы, были использованы для характеристики морфологии вестибулярных волосковых клеток 6,7,8 и изучения регенерации волосковых клеток 9,10. В последнее время были разработаны методы забора органов внутреннего уха у доноров органов с использованием трансканального подхода, который может быть использован для удаления утрикулы и, возможно, других вестибулярных конечных органов через расширенное овальное окно с минимальной травматизацией тканей11,12. Используя эту методику, стало возможным охарактеризовать транскриптомные профили одиночных клеток для человеческого утрикулы13. Тем не менее, эти методы подвергают органы внутреннего уха воздействию нефизиологических условий во время сбора урожая. В частности, органы внутреннего уха могут подвергаться отсутствию перилимфатической жидкости и погружению в воду при обычном орошении солевым раствором, который имеет ионный состав, существенно отличающийся от перилимфатической жидкости. Кроме того, обезвоженный мембранный лабиринт трудно визуализировать, даже при максимальном увеличении операционного микроскопа, что затрудняет атравматичное хирургическое рассечение. Механическая травма может еще больше повредить ткани, и наш анекдотический опыт показывает, что хирургическая ткань часто имеет недостаточное качество иммуноокрашивания из-за механического повреждения и клеточной дегенерации. Существует потребность в новых методах атравматичного забора тканей внутреннего уха человека для биологических исследований, которые могут пролить свет на плохо изученные заболевания внутреннего уха человека. Здесь мы опишем подводную технику забора вестибулярных конечных органов человека в более физиологических условиях во время лабиринтэктомии и их анализ с помощью иммуноокрашивания.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Этот протокол был разработан с одобрения институционального наблюдательного совета (IRB) Медицинской школы Университета Джонса Хопкинса (IRB00203441) и в соответствии с институциональной политикой использования человеческих тканей и потенциально инфекционного материала. Забор тканей проводился во время лабиринтэктомии, которая является частью стандартной клинической помощи при стойкой болезни Меньера с приступами падения.

1. Лабиринтэктомия и забор тканей

  1. Получите одобрение местного институционального наблюдательного совета (IRB), ознакомьтесь с политикой учреждения в отношении использования человеческого и инфекционного материала, а также получите согласие на донорство тканей перед использованием этого протокола. Выполняйте забор тканей во время хирургической лабиринтэктомии или транслабиринтного доступа к внутреннему слуховому проходу, что является частью стандартной клинической помощи.
  2. Подготовьте пациента.
    1. Перед введением анестезии обсудите с анестезиологической бригадой, как избежать паралича длительного действия, чтобы можно было контролировать лицевой нерв.
    2. После введения общей анестезии интубируйте пациента и поверните операционный стол на 180°. Установите электроды для мониторинга лицевого нерва и убедитесь, что проводится предоперационная антибиотикопрофилактика.
    3. Введите 1% лидокаин с соотношением 1:100 000 адреналина в наружный слуховой проход и постоушную область. Подготовьте ухо стандартным образом с помощью бетадина.
  3. Используйте лезвие #15 для создания стандартного (5-6 см) постаурикулярного криволинейного разреза на 1 см позади заушной складки.
  4. Подтяните мягкие ткани постоушной раковины.
    1. Определите височную фасцию сверху и поднимите постоушный кожный лоскут спереди по направлению к ушному каналу.
    2. Сделайте стандартный 7-образный надкостничный разрез и приподнимайте надкостницу спереди до тех пор, пока не будут идентифицированы позвоночник Генле и костный слуховой проход. Разместите самообучающиеся втягивающие устройства.
  5. Провести мастоидэктомию.
    1. Выполнить полную мастоидэктомию, определив тегмен сверху, сигмовидный синус сзади и истончив наружный слуховой проход спереди.
    2. Определите горизонтальный полукружный канал и короткий отросток инкуса.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сосцевидный отросток не должен быть тарелкой, чтобы он оставался сосудом, способным удерживать жидкость для подводного сбора тканей.
  6. Определите полукружные каналы (СК).
    1. Под операционным микроскопом (2-4-кратное увеличение) с помощью крупнозернистого алмазного заусенца толщиной 3 мм удалите перилабиринтные воздушные ячейки, боковые по отношению к верхнему СК, субдуарные воздушные ячейки и ретролабиринтные воздушные ячейки за задним СК, простирающиеся вверх к обыкновенной голени.
  7. Погрузите лабиринт.
    1. Погрузите сосцевидную полость в сбалансированный раствор соли (БСС) и визуализируйте лабиринт с помощью эндоскопа нулевого градуса с системой орошения оболочки для очистки линз.
    2. Используйте систему орошения оболочки хрусталика для орошения сосцевидной полости с помощью BSS, смывая кровь и обеспечивая улучшенную визуализацию лабиринта.
  8. Синяя линия КА.
    1. Поддерживая достаточный уровень BSS в сосцевидной полости и используя эндоскоп для визуализации, используйте алмазный заусенец диаметром 3 мм для «синей линии» всех трех полукружных каналов, осторожно просверливая кость глазной капсулы до тех пор, пока полукружный канал не станет выглядеть как голубоватая линия при просмотре эндоскопом.
    2. Периодически орошайте раствором BSS, используя ирригационную систему для смывания крови и достижения адекватной визуализации, как показано на рисунке 1.
  9. Сбор урожая SC ampullae.
    1. Под BSS войдите в купол бокового полукружного канала и следуйте по нему спереди до тех пор, пока не будут идентифицированы его ампулы. Войдите в верхнюю СК и следуйте по ней медиально к ампулам, которые могут быть собраны с ампулами верхней СК. Резко разрежьте боковой проток СК для облегчения удаления.
    2. С помощью иглы Розена поднимите горизонтальные и верхние ампулы SC от кристы и отделите афферентные волокна от эпителия и перепончатого лабиринта. Затем удалите эти конструкции.
    3. Пересеките купол задней СК и следуйте по нему ниже и спереди от его ампул. Аналогичным образом соберите задние ампулы SC и поместите всю ткань в BSS на лед.
  10. Соберите урожай макулы.
    1. Удалите кость между горизонтальной и задней ампулами СК, чтобы обнажить преддверие. Перепончатые стенки утрикулы будут разорваны при удалении ампул. До тех пор, пока поддерживается уровень жидкости, макулы будут оставаться прикрепленными спереди; Поднимите и снимите его.
    2. Мешочек находится внутри сферического углубления; Резко приподнимите и удалите его из углубления. Аналогичным образом поместите образцы тканей в BSS на лед.
  11. Транспортировка образцов тканей на льду из операционной в лабораторию для фиксации в течение 1 ч после забора.

2. Иммуногистохимия и визуализация

  1. Исправьте образец.
    1. Поместите образец ткани в 4% параформальдегид (PFA) в 1x фосфатно-солевой буфер (1x PBS) при комнатной температуре (RT) с легким покачиванием или встряхиванием орбиты (100 об/мин) в течение 1 часа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: 4% раствор PFA (всего 5 мл): 625 мл 32% стокового раствора PFA + 500 мл 10xPBS + 3875 мл ddH2O.
  2. Перенесите образцы тканей в 1x раствор PBS и промойте 3x 15 мин (или дольше, если это необходимо) в RT с легким покачиванием или орбитальным встряхиванием.
  3. Удалите излишки соединительной ткани под препарирующим микроскопом в режиме 1x PBS при ЛТ.
  4. Очистите образец от накипи.
    1. Перенесите образцы тканей в 5% этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА) в 1x раствор PBS для очистки сенсорного эпителия от мелких костных остатков и отоконии. Проводить инкубацию в течение 15-30 мин при RT, с легким покачиванием или орбитальным встряхиванием.
  5. Снова перенесите образцы тканей в 1x раствор PBS и промойте 3x 15 мин (или дольше, если это необходимо) в RT с легким покачиванием или орбитальным встряхиванием.
  6. Нанесите 125-200 мл 2x блокирующего буфера (2x BB) на каждый образец и инкубируйте в течение 1,5-5 ч при RT или в течение ночи (ON) при 4 °C. Запускайте инкубацию при постоянном встряхивании орбиты.
    ПРИМЕЧАНИЕ: 2x Блокирующий буфер (2x BB): 1 г бычьего сывороточного альбумина (BSA), растворенного в 5 мл 1x PBS с добавлением 0,5% Triton X-100. BSA служит блокирующим агентом для неспецифических сайтов связывания антигенов.
  7. Окрашивание с помощью первичных антител.
    1. Внесите 120-150 мл комбинации первичных антител, растворенных в 1х ВВ, до нужного разведения. Применяйте антитела к тенасцину-С у кроликов в разведении 1:200 (2,5 мкг/мл), антитела к онкомодулину коз в разведении 1:200 (2,5 мкг/мл), мышиный антикальретинин в разведении 1:300 (2,2 мкг/мл) и DAPI в разведении 1:1000 (1 мкг/мл). Затем перенесите образец (в закрытом виде) при температуре 4 °C (холодильник или холодильная камера) под легкое встряхивание орбиты для инкубации ON.
      ПРИМЕЧАНИЕ: 1x BB: Смешайте равный объем 2x BB и 1x PBS с добавлением 0,5% Triton X-100.
  8. Промойте образцы тканей в 1x растворе PBS, 3x 15 мин (или дольше, если это необходимо), в режиме RT с легким покачиванием.
  9. Окрашивание с помощью вторичного антитела.
    1. Внесите 120-150 мл комбинации флуорконъюгированных вторичных антител, растворенных в 1x BB в разведении 1:2000 (1 мкг/мл). Применяют конъюгированное вторичное антитело против кролика с длиной волны 488 нм, вторичное антитело против мыши с длиной волны 568 нм и вторичное антитело против козы длиной волны 647 нм.
    2. Затем инкубируйте образец (в закрытом виде) при ОТ под легким орбитальным встряхиванием в течение 1,5-2 ч (или ON при 4 °C).
  10. Промойте образцы тканей в 1x растворе PBS, 3x 15 мин (или дольше, если это необходимо), в режиме RT с легким покачиванием.
  11. Выполните микродиссекцию и монтаж.
    1. Под препарирующим микроскопом удалите излишки тканей и оболочек вокруг сенсорного вестибулярного эпителия. Используйте 70% этанол для очистки поверхности стекла гистологического предметного стекла, высушите на воздухе и нанесите каплю 55 мл соответствующей монтажной среды.
    2. Перенесите образцы сенсорной ткани в монтажную среду. С помощью тонких щипцов аккуратно сориентируйте образцы пучком волос вверх в монтажной среде.
    3. Аккуратно положите покровное стекло соответствующего размера на монтажную среду, содержащую образцы, стараясь ограничить количество пузырьков воздуха. Убедитесь, что покровное стекло имеет класс толщины #1,5, необходимый для конфокальной микроскопии.
    4. Поместите горки в темное место (например, в ящик скамейки), чтобы закрепился монтажный материал. Приклейте покровное стекло к предметному стеклу прозрачным лаком для ногтей и дайте ему высохнуть в темном месте, прежде чем рассматривать его с помощью конфокального микроскопа. После этого храните запечатанные слайды в темноте (в коробке слайдов или папке для слайдов) при температуре 4° до момента создания изображения.
  12. Для получения изображения образца используйте конфокальный микроскоп с увеличением 40x-100x и каналами 488 нм и длиной волны 657 нм.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

С помощью этой техники утрикулы человека, а также ампулы латерального и верхнего канала были собраны неповрежденными с минимальной травматизацией (рис. 2). Как видно на рисунке 2, ампулы можно собирать со значительной частью пленчатого протока. Иммунофлуоресцентное мечение анти-тенасцином-С (белок внеклеточного матрикса) и антионкомодулином (малый кальций-связывающий белок семейства белков парвальбумина) показало интактные вестибулярные волосковые клетки 1-го ти...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В данной работе описана новая методика подводного забора вестибулярных конечных органов при БСС с использованием эндоскопов и их анализа с помощью иммунофлуоресцентной визуализации. Здесь мы демонстрируем сбор интактных вестибулярных конечных органов с интактными вестибулярными волосковыми клетками и достаточным качеством тканей для успешного иммуномечения. Плотность волосковых клеток в нашем образце была аналогична полученной в других исследованиях от живых доноров органов

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Мы благодарим Мохамеда Лехара за помощь в реализации этого проекта. Эта работа была поддержана Национальным институтом глухоты и других коммуникативных расстройств (U24DC020850).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
10x Фосфатный буферный физиологический растворSigma-AldrichP5493
32% параформальдегидный стоковый растворThermoFisher Scientific50-980-495
Alexa Fluor 488 Вторичное антитело против кроликаJackson Immunoresearch111545144
Alexa Fluor 568 Вторичное антитело против мышиJackson Immunoresearch115575146
Alexa Fluor 647 Anti-Goat Вторичное антителоJackson Immunoresearch705607003
Сбалансированный раствор солиThermoFisher Scientific14040117
Сыворотка крупного рогатого скота АльбуминSigma-Aldrich10711454001
конфокальный микроскопNikon A1 A1
Покровное стекло (18 мм x 18 мм, толщина #1.5 )Corning 2850-18
Эндо-скраб 2 Оболочка для чистки линзMedtronicIPCES2SYSKIT
раствор этилендиамитетрауксусной (ЭДТА) кислотыSigma-AldrichE8008
Антитела к онкомодулину козыR& D SystemsAF6345
Телескоп Хопкинса 0 градусовStorz
Мышиный антикальретининантитела BD Biosciences610908
ProLong Gold антифейдящий реагентInvitrogenP10144
Кролик против тенасцина C антителаMilliporeAB19013
Triton X-100Sigma-Aldrich9036-19-5
Karl

Ссылки

  1. Monsanto, R. D. C., Pauna, H. F., Paparella, M. M., Cureoglu, S. Otopathology in the United States: History, Current Situation, and Future Perspectives. Otol Neurotol. 39 (9), 1210-1214 (2018).
  2. Nager, G. T. Pathology of the Ear and Temporal. , Williams and Wilkins Pubs. Baltimore, MD. (1993).
  3. Schuknecht, H. Pathology of the Ear. , Lea and Febiger Pubs. Philadelphia, PA. (1993).
  4. Swartz, J. D., Loevner, L. A. Imaging of the Temporal Bone. , 4th edition, Thieme Medical Pubs. Stuttgart. (2009).
  5. Nagururu, N. V., Akbar, A., Ward, B. K. Using magnetic resonance imaging to improve diagnosis of peripheral vestibular disorders. J Neurol Sci. 439, 120300(2022).
  6. Hızlı, Ö, et al. Quantitative vestibular labyrinthine otopathology in temporal bones with vestibular schwannoma. Otolaryngol Head Neck Surg. 154 (1), 150-156 (2016).
  7. Sans, A., Bartolami, S., Fraysse, B. Histopathology of the peripheral vestibular system in small vestibular schwannomas. Am J Otol. 17 (2), 326-324 (1996).
  8. Johnson Chacko, L., et al. Growth and cellular patterning during fetal human inner ear development studied by a correlative imaging approach. BMC Dev Biol. 19 (1), 11(2019).
  9. Taylor, R. R., et al. Regenerating hair cells in vestibular sensory epithelia from humans. Elife. 7, e34817(2018).
  10. Warchol, M. E., Lambert, P. R., Goldstein, B. J., Forge, A., Corwin, J. T. Regenerative proliferation in inner ear sensory epithelia from adult guinea pigs and humans. Science. 259 (5101), 1619-1622 (1993).
  11. Aaron, K. A., et al. Selection criteria optimal for recovery of inner ear tissues from deceased organ donors. Otol Neurotol. 43 (4), e507-e514 (2022).
  12. Vaisbuch, Y., et al. Surgical Approach for rapid and minimally traumatic recovery of human inner ear tissues from deceased organ donors. Otol Neurotol. 43 (4), e519-e525 (2022).
  13. Wang, T., et al. Single-cell transcriptomic atlas reveals increased regeneration in diseased human inner ear balance organs. Nat Commun. 15 (1), 4833(2024).
  14. Creighton, F. X., Zhang, L., Ward, B., Carey, J. P. Hearing outcomes for an underwater endoscopic technique for transmastoid repair of superior semicircular canal dehiscence. Otol Neurotol. 42 (10), e1691-e1697 (2021).
  15. Schoo, W. W., Schoo, D. P., Chen, J. X., Carey, J. P. Underwater plugging of superior canal dehiscence via the middle cranial fossa is possible. Otolaryngol Head Neck Surg. 169 (6), 1702-1703 (2023).
  16. Basura, G. J., et al. Clinical practice guideline: Ménière's disease. Otolaryngol Head Neck Surg. 162 (2_suppl), S1-S55 (2020).
  17. Chandrasekhar, S. S., et al. Clinical practice guideline: Sudden hearing loss (Update). Otolaryngol Head Neck Surg. 161 (1_suppl), S1-S45 (2019).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Методика лабиринтэктомииткани внутреннего ухавнутреннее ухо человекаболезнь Меньерапроцедура мастоидэктомиисбалансированный солевой растворэндоскопическая визуализацияиммунофлуоресцентное мечениевестибулярные волосковые клетки
Забор вестибулярных конечных органов в физиологических условиях при лабиринтезии
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.