Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Механическое картирование сфероидов с использованием спектроскопии Бриллюэна

2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/67538

⸱

12 декабря 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centre for the Cellular Microenvironment, Advanced Research Centre, 11 Chapel Lane, University of Glasgow, 2LightMachinery Inc.

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

В этой статье описывается протокол механической характеристики живых сфероидов в 3D-матрице с использованием микроспектроскопии Бриллюэна. Этот полностью оптический метод позволяет визуализировать сфероиды с микромасштабным разрешением и количественными механическими свойствами. Этот подход имеет последствия для механической фенотипизации; например, определение патологических состояний сфероидов опухолей в 3D-микросреде.

Аннотация

Спектроскопия Бриллюэна — новая техника, приобретающая значительный интерес в биомедицинской науке, — позволяет исследователям собирать информацию, связанную с механикой и структурой, изучая вязкоупругие и архитектурные свойства образцов неразрушительно, без контактов. Этот подход оценивает механические свойства 3D-образцов путём измерения взаимодействия видимого света с термически индуцированными акустическими волнами/фононами. Информация, предоставляемая спектроскопией Бриллюэна, имеет потенциал для in vivo оценки биофизики и возможной диагностики патологий заболеваний. Значительным преимуществом спектроскопии Бриллюэна является возможность оценивать микромасштабную механику внутри биологического образца; другие традиционные методы, способные достичь такого разрешения, такие как атомно-силовая микроскопия, могут исследовать образцы только в 2D, поскольку они требуют прямого контакта. В этой работе описывается применение микроспектроскопии Бриллюэна для изучения биомеханики живых сфероидов, встроенных в 3D-гидрогельную матрицу. Инкапсуляция клеточных сфероидов в трёхмерной микросреде создаёт сфероидную систему, которая в живом виде отражает интерфейс между клетками и внеклеточным матриксом. В нашем протоколе мы описываем подготовку образцов сфероидов и измерения спектров Бриллюэна с помощью последовательной флуоресцентной визуализации. Кроме того, мы обсуждаем процедуры анализа спектральных данных и технические детали оптической системы.

Введение

Культивирование клеток в 3D-моделях выгодно по сравнению с типичными методами 2D-культивирования, поскольку оно лучше воспроизводит структуры тканей и взаимодействия между клетками, встречающиеся in vivo. Сфероиды — это трёхмерные клеточные агрегаты, способствующие комплексному взаимодействию между клетками; Эти взаимодействия нарушаются в клетках, выращиваемых как монослой на пластической культуре тканей. Сфероиды можно выращивать внутри строительных каркасов, имитирующих микроокружение, откуда произошла клетка. Например, гидрогели являются популярным биоматериалом для культивирования клеток/сфероидов, поскольку они позволяют точно контролировать такие параметры, как жёсткость, разлагаемость, размер пор и включение факторовроста 1 (рисунок 1A). Механические сигналы часто предшествуют биохимическим изменениям в патологиях заболеваний, таких как рак ифиброз 2,3, поэтому получение биомеханической подписи в клинически значимых 3D-моделях заболеваний является ключевым для разработки диагностических вмешательств, информирующих терапевтическую практику и понимание базовой патофизиологии4.

Микроскопия Бриллюэна (BM) — это метод визуализации, позволяющий измерять механические свойства биологических материалов в двумерныхплоскостях 5,6,7. BM обладает ключевыми преимуществами по сравнению с другими, более распространёнными методами, такими как атомно-силовая микроскопия (AFM) и эластография. Хорошо задокументировано, что AFM способен достигать высокого пространственно-временного механического разрешения, а эластография может исследовать механику внутриобразцов 8,9. BM не требует прямого контакта с исследуемым материалом, что делает его идеальной техникой по сравнению с AFM для труднодоступных образцов/клеток, таких как сфероиды внутри гидрогелей. Ещё одним важным преимуществом BM является отсутствие потребности в маркировке образцов и возможность обеспечивать микромасштабное разрешение внутри биологических образцов, чего обычно используемые методы эластографии не могутдостичь 7; Более продвинутые методы оптической эластографии могут работать с микромасштабнымразрешением 10. Следует отметить, что точное эффективное разрешение в образах Бриллюэна гетерогенных биологических образцов несложно определить. Во-первых, для заданной длины волны освещения она зависит от оптических свойств, описывающих размер фокусного пятна (числовая апертура, NA, объективной линзы и непрозрачность образца). Кроме того, точность изучения механических свойств образца, а также форма спектра Бриллюэна зависят от акустических характеристик материала (длина волны фонона и длина распространения)11,12. Основным явлением, лежащим в основе спектроскопии Бриллюэна, является рассеяние Бриллюэна, когда падающий монохроматический лазерный свет взаимодействует со спонтанными, термически индуцированными акустическими фононами в биологической среде. Это приводит к неупругому рассеянию света и (сдвиг частоты Бриллюэна, BFS) на рисунке 1B обычно составляет несколько ГГц, и в зависимости от того, теряет ли фотон или приобретает энергию, пики Бриллюэна Стокса и анти-Стокса фиксируются в спектре рассеянного света соответственно. Благодаря своей зависимости от локальной звуковой скорости в среде, BFS связан с упругим продольным модулем, который, в свою очередь, эмпирически коррелирует с модулемЮнга 7,13; однако при сравнении этих модулей следует проявлять осторожность, поскольку (i) они не связаны напрямую друг с другом, (ii) модуль Юнга обычно находится в диапазоне Pa-kPa для биологических образцов и мягкого вещества, тогда как продольный модуль, полученный по Бриллюэну, находится в диапазоне GPa, и (iii) параметры, такие как изменения показателя преломления и плотность материала,должны учитываться 7. Ширина линии Бриллюэна (на рисунке 1B) — ещё одна мера, полученная из BM. Он связан с продольным модулем потерь, что даёт представление о вязкости образца; Эти свойства можно коррелировать с вязкоупругостью14. Таким образом, BM позволяет оценить вязкоупругие свойства, где большая BFS подразумевает более жёсткий материал, а большая ширина линии — более вязкий материал (рисунок 1B). Следует отметить, что упругое (Релеевское) рассеяние, при котором фотоны не подвергаются сдвигу частоты, имеет значительно большую вероятность возникновения по сравнению с рассеянием Бриллюэна. Поэтому спектрометры Бриллюэна должны быть оснащены для подавления сигнала Рэлея.

BM применялся для характеристики механических свойств различных тканей, биоматериалов и моделей 3D-клеточной культуры. Например, BM использовалась для различия меланомы от окружающей здоровой ткани, показывая, что нераковая ткань была значительно мягче, чеммеланома 15. Рад и др. показали, что увеличение концентрации полимеров гидрогелей приводит к увеличению BFS и ширины линии. При самых низких концентрациях полимеров гидрогели с клетками демонстрировали большее снижение сдвигов частоты Бриллюэна в течение семи дней по сравнению с пустыми гидрогелями, что предполагалось связано с клеточным ремоделированием гидрогеля. Это не наблюдалось при концентрации 10% полимера, что подчёркивает возможную недостаток жизнеспособности клеток в этихгидрогелях 16.

Наиболее значимым для настоящего исследования является то, что BM используется для изучения механических свойствсфероидов 17, 18, 19, 20. В частности, влияние локальной микросреды на механику сфероидов можно обнаружить с помощью BM20. По сравнению с опухолями, культивируемыми в гибких гидрогелях, сфероиды, выращенные в жёстких гидрогелях, демонстрировали более высокий BFS, что свидетельствует о повышенном упругоммодуле 20. Пространственные вариации механических свойств внутри сфероида также можно охарактеризовать с помощью BM. Например, было обнаружено, что BFS опухолевых сфероидов увеличивается в сторону ядрасфероидов 20,21. Кроме того, снижение BFS коррелирует с повышенной инвазивностью опухолевыхсфероидов 20. BM применялся для изучения механических изменений опухолевых сфероидов в ответ на осмотическийшок 22. В ходе исследования рост сфероидов отслеживали в течение 5 дней, и было обнаружено, что начальные механические различия между раком и здоровыми сфероидами, наблюдаемые при BM, со временем терялись. Другое исследование показало увеличение BFS сфероида через 7 дней, что объяснялось увеличением размера сфероидов и числаклеток 16.

Кроме того, были проведены мультимодальные исследования с использованием микроскопии Бриллюэна наряду с АФМ и реологией для изучения механических свойств клеток игидрогелей 16,23,24. Рад и др. использовали реологию для контекстуализации тенденций, измеренных с помощью BM, установив сильную положительную корреляцию между продольной и модулями сдвига накопления относительно концентрации полимеровгидрогелей 16. Для измерения механики раковых клеток, культивируемых в 3D-гидрогелях, использовались бриллюэновская микроскопия и оптическая микрореология пинцетом. В этом исследовании была обнаружена сниженная механическая гетерогенность клеток сфероидов по сравнению с отдельными клетками, взвешенными в гидрогелях.

В этой работе подробно описан протокол для изучения механических свойств живых сфероидов, встроенных в гидрогели, с помощью коммерческого микроскопа Бриллюэна (рисунок 1). Бергхаус и др. описали протокол, подробно описывающий шаги по созданию высокоразрешающего спектрометра Бриллюэна и метод его калибровки с помощьюэталонных материалов 25. Кроме того, протокол Ши и др. описывает использование микроскопии Бриллюэна для мониторинга изменений механических свойств эмбриональнойткани 26. Мы используем сфероиды мезенхимальных стволовых клеток (MSC) в гидрогелях полиэтиленгликоля (PEG)-малеимида для имитации ниши костного мозга и изучения механических свойств этой среды. Эта 3D-модель обладает потенциалом для выявления механических признаков заболеваний костного мозга, включая лейкемию, множественную миелому и вторичный рак костей. Таким образом, протокол напрямую переносим на трёхмерные модели других заболеваний, где нарушение механобиологии может играть важную роль в патологии. Методы подготовки сфероидов и гидрогеля, флуоресцентной визуализации и микроскопии Бриллюэна подробно описаны. Обсуждаются рекомендуемые процедуры, возможные недостатки и возможные улучшения техники. Подробное описание экспериментальной установки представлено на рисунке S1 и в разделе дополнительных материалов и методов, связанных с экспериментальной установкой.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Культура 2D клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: По возможности убедитесь, что все работы по культуре клеток проводятся в стерильной среде с использованием стандартной ламинарной вытяжки, чтобы избежать загрязнения. В настоящем протоколе использовались MSC, но для создания сфероидов могут применяться и другие типы клеток, в зависимости от конкретных целей исследования.

  1. Культура MSC в среде Modified Eagle Medium (DMEM) от Dulbecco, с достаточным объёмом для покрытия клеток, содержащим 4,5 г/л D-глюкозы + L-глутамин с добавлением 10% плодовой сыворотки крупного рогатого скота (FBS), 100 мкм пирувата натрия, 1% несущественных аминокислот (NEAA), 1% пенициллина и стрептомицина. Инкубировать клетки при 37 °C и 5%CO2.
  2. Проходящие клетки с 70-80% совпадения, инкубировав с 0,05% трипсин этилендиаминетрауксусной кислотой (ЭДТА) (объём добавленного трипсина должен составлять 1/3 объёма DMEM) в течение 3 минут при 37 °C и 5%CO2 для отделения клеток от пластины. Чтобы остановить реакцию, добавьте культурные материалы, содержащие FBS (хотя бы с объёмом добавленного трипсина). Считайте клетки с помощью гемоцитометра.

2. Подготовка сфероидов

ПРИМЕЧАНИЕ: По возможности убедитесь, что все работы по культуре клеток проводятся в стерильной среде с использованием стандартной ламинарной вытяжки, чтобы избежать загрязнения. В этом исследовании микроколодочные пластины использовались для создания сфероидов MSC. Эти плиты состоят из 24 скважин, каждая из которых содержит 1200 микроскважин диаметром 400 мкм. Это позволяет подготовить большое количество сфероидов (рисунок 2).

  1. Для подготовки пластины микроколодца предварительно обработайте скважины, добавив в каждую скважину 500 мкл раствора против прилипания. Центрифугная пластина при 1300 г в течение 5 минут при комнатной температуре. Под микроскопом при 20-кратном увеличении проверьте, есть ли воздушные пузырьки. Если да, повторите этап центрифуга. Удалите раствор для промывания против прилизания.
  2. Для мытья тарелки добавьте 1 мл физиологического раствора с фосфатным буфером (PBS) и аспирируйте. Сделайте это дважды, чтобы полностью удалить раствор для промывания.
  3. Определите количество клеток на сфероид и количество сфероидов на гель. Это зависит от конкретных исследовательских вопросов. Например, мы использовали 100 клеток на сфероид и 100 сфероидов на гель. Поэтому для этого протокола требовалась только одна яма микроколодца, так как это создаёт всего 1200 сфероидов. Чтобы рассчитать количество ячеек, необходимых для одной скважины, мы провели следующий вычисление: 1200 x 100 = 1,2 x 105. Рассчитайте объём суспензии ячейки, содержащей 1,2 x 105 ячеек. Центрифугуйте суспензию ячейки при 300 г в течение 5 минут при комнатной температуре и удалите супернатант.
  4. Ресуспендировать клетки в 1 мл DMEM (+4,5 г/л D-глюкозы + L-глутамин) с добавлением 100 мкм пирувата натрия, 1% NEAA, 1% пенициллина и стрептомицина. Добавьте 1 мл клеточной суспензии в одну из ямоч пластины микроколодца и аккуратно пипетируйте вверх и вниз, чтобы клетки равномерно распределялись по всей яме. Будьте осторожны, чтобы не появляться воздушные пузырьки. Центрифугуйте пластину при 100 г в течение 3 минут при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На данном этапе мы не добавляем FBS в СМИ. Это делается для предотвращения прикрепления клеток к пластику тканевой культуры.
  5. Осмотрите пластину под микроскопом, чтобы убедиться, что клетки равномерно распределены и опустились на дно микроскважин. Инкубировать клетки при 37 °C и 5%CO2. Наблюдайте формирование сфероидов через 24 часа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сфероиды могут оставаться в пластине до 48 часов, в зависимости от типа клетки и желаемой компактности сфероида.
  6. Чтобы собрать сфероиды из пластины, сначала медленно и аккуратно удалять культурную среду, чтобы не потревожить сфероиды. Чтобы предотвратить прилипывание сфероидов к пластиковой посуде, нанесите наконечники и трубки пипеток с помощью PBS с 1% FBS. Чтобы сфероиды не застревали в кончиках пипетки, отрежьте кончик, чтобы расширить отверстие. На этих этапах можно использовать наконечники максимального восстановления как дополнительную меру для предотвращения потери сфероидов. Добавьте 500 мкл PBS в каждую яме пластины микроколодца и пипеткой вверх и вниз, чтобы вытеснить сфероиды. Соберите PBS с помощью подвешенных сфероидов в трубку (рисунок 2).
  7. Осмотрите пластину под микроскопом при 20-кратном увеличении и повторяйте этот шаг, пока большинство сфероидов не будут успешно удалены.
  8. Чтобы подсчитать количество сфероидов в подвеске, перенесите 50 мкл из подвески в скважину пластины с 96 лунками. Посчитайте количество сфероидов в 50 мкл. Для облегчения подсчёта на дне колодца можно нарисовать крест с помощью перманентного маркера. Вычислим количество сфероидов с помощью уравнения (1):
    figure-protocol-1

3. Подготовка гидрогелей ПЭГ

ПРИМЕЧАНИЕ: По возможности убедитесь, что все работы по культуре клеток проводятся в стерильной среде с использованием стандартной ламинарной вытяжки, чтобы избежать загрязнения. В этом исследовании использовались гидрогели PEG-малеймид, но также могут применяться другие типы. Гидрогели PEG-малеимида были получены с помощью реакции добавлениятиол-Михаэля 27. Использовались перекрестные склейки, представлявшие собой смесь ПЭГ-дитиола и протеаз-разлагаемого пептида, окружённую двумя остатками цистеина (VPM пептид, GCRDVPMSMRGGDRCG). Гели в данном исследовании содержали 70% PEG-дитиол и 30% разлагаемый VPM пептид.

  1. Сделайте 200 мг/мл стандартного раствора VPM пептида и добавьте 2,4 мкл пептида на гель. Приготовьте 200 мг/мл раствора PEG-дитиола и добавьте 5,6 мкл на гель.
  2. Подвесьте сфероиды в PBS перед смешиванием с кросслинкерами (рисунок 2). Смешайте сфероидную суспензию с PEG-дитиолом (5,6 мкл на гель) и VPM (2,4 мкл на гель). Это решение называется Решением B.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе на гель добавлялось 100 сфероидов.
  3. Приготовьте 250 мг/мл раствор PEG-Maleimide. Добавьте 50 мкг фибронектина на гель. Смешать раствор ПЭГ-Малеймида и фибронектина; это называется раствором A. Pipette Solution A (40,3 мкл для гелей 100 мкл) на дно 12-луночной пластины для культивирования тканей. Добавьте раствор B (59,7 мкл для гелей 100 мкл) при молярном соотношении 1:1 малеимид:тиол для полной перекрёстной связи; Убедитесь, что гелирование происходит мгновенно. Конечный объём гидрогелей составляет 100 мкл.
  4. Инкубировать гели в течение 30 минут при 37 °C и 5%CO2 для желирования. Добавьте полный посевный материал (DMEM с добавлением 10% FBS, 100 мкм пирувата натрия, 1% NEAA и 1% пенициллина и стрептомицина) в колодцу, гарантируя, что гель полностью погружен в воду (рисунок 2). Инкубировать гель при 37 °C и 5%CO2 до готовности проводить измерения под микроскопом Бриллюэна.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Длительность культуры сфероидов в гидрогелях до измерений Бриллюэна будет зависеть от типа клетки и исследовательского вопроса. Например, в этом исследовании сфероиды обычно культивируются в гидрогелях до 7 дней, в течение которых сфероиды контролируются микроскопией Бриллюэна. Были охарактеризованы вязкоупругие свойства гидрогелей с инкапсуляцией сфероидов и без неё, но не показали значительного влияния сфероидов на механику геля (рисунок S2).

4. Флуоресцентное окрашивание и визуализация сфероидов в гидрогелях

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании ядра клеток и актиновые нити, составляющие цитоскелет, были флуоресцентно окрашены и сфотографированы до измерений по методу Бриллюэна.

  1. Чтобы окрасить актин, добавьте живую морилку в медиа с разбавкой 1 к 500 за 3 часа перед визуализацией. Держите образец вне света, завернув его в фальгу. Инкубировать гель при 37 °C и 5%CO2.
  2. Чтобы окрасить ядра, добавьте 2 капли живого ядерного окрашивателя в культурную среду вокруг геля за 40 минут до визуализации. Верните образцы в инкубатор.
  3. Сделайте флуоресцентные изображения как можно скорее после завершения инкубации окрашивания. Проверьте, выбран ли соответствующий оптический путь (экспонирование камеры микроскопа) и правильное положение колеса фильтра. Приглушите свет в комнате и запечатлейте фон. Включите светодиодный источник света (LED) и выберите длину волны в зависимости от протокола окрашивания (здесь для ядер использовалось 385 нм, а для актиновой визуализации — 621 нм). Получайте флуоресцентные изображения сфероидов с увеличением 20 раз с помощью желаемого программного обеспечения. Выключите источник светодиода, когда закончите.

5. Бриллюэновская микроскопия сфероидов

  1. Включение устройств и лазерное излучение
    1. Включите устройства: компьютер, спектрометр, камеры микроскопа, микроскоп, вентилятор лазерного охлаждения и лазерное излучение, включив ключ на контроллере. Убедитесь, что это сделано за 15 минут до оптимизации спектрометра, чтобы убедиться, что лазер термализирован. Проверьте, что излучаемая мощность лазера соответствует ожидаемому с помощью измерителя мощности (100 мВт в нашем эксперименте).
  2. Включите приложение для контроля температуры (см. Таблицу материалов) и убедитесь, что температура эталона оптимизирована, измеряя мощность пучка после эталона. Если он значительно ниже ожидаемого (с учётом используемого фильтра оптической плотности (OD), измените целевую температуру на 1 °C и наблюдайте, увеличивается ли мощность со временем. Если наблюдается уменьшение, обратите направление изменений. Когда мощность близка к ожидаемой, настраивайте их небольшими шагами (0,1 °C), пока не достигнет максимального.
  3. Установка фокусной точки объектива внутри акрилового куба
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подавление упругого рассеяния и соединения между «убийцей насоса» и спектрометром оптимизируется с помощью образца жёсткого, однородного эталонного материала перед каждым экспериментом. В этом исследовании используется акриловый куб.
  4. Откройте программу SpectraLok и дождитесь, пока все устройства будут обнаружены. Слева от главного окна (рисунок 3) выберите камеру спектрометра.
    1. Установите акриловый куб на держатель образцов микроскопа так, чтобы прозрачная сторона была обращена к объективу. Опустите объектив как можно ниже и центрируйте куб под ней. Убедитесь, что оптический путь в микроскопе выбран так, чтобы камера спектрометра была экспонирована (установите селектор вращающегося порта в L).
      ПРИМЕЧАНИЕ: В нашей конфигурации L-порт подключён к конфокальному циркулятору, а R — к порту камеры микроскопа.
    2. В окне камеры SpectraLok установите время экспозиции сенсора на 500 мс, а программное усиление — на 100. Настройка программного усиления только усиливает контраст для визуализации.
  5. Разблокируйте лазерный затвор.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку лазерное излучение включено, будьте осторожны, чтобы никогда не направлять голову или глаза в путь лазерного луча.
    1. Нажмите захват и поднимите объектив вверх. Интенсивность сигнала значительно увеличится, и появится насыщенный рисунок (рисунок 4A). Это вызвано сильным отражением лазерного света на границе воздух-акриловый куб. При большем подъёме линзы интенсивность сигнала уменьшается, и пики Бриллюэна становятся очевидными. Продолжайте переставлять объектив до тех пор, пока интенсивность пиков Бриллюэна не станет постоянной (рисунок 4B). Это соответствует фокусной точке, полностью расположенной внутри акрилового куба.
  6. Оптимизация давления эталона для минимизации остаточного упругого рассеянного света
    ПРИМЕЧАНИЕ: Цель следующих шагов — подавить упруго рассеянный сигнал Релея так, чтобы только частотно-смещённый свет Бриллюэна попадал в камеру спектрометра.
  7. В программном обеспечении SpectraLok откройте окно управления Pump Killer (PK) (рисунок 5).
  8. Увеличите один из самых ярких ордеров Бриллюэна и регулируйте положение привода давления шагом на 100 мкм, нажав кнопку move rel, чтобы минимизировать пиковую интенсивность Рэлея. Если сигнал Релея усиливается, обратите направление изменения назад, нажав назад. Затем тонкая настройка давления эталона шагом в 10 мкм.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В акриловом кубе свет Рэлея может быть полностью подавлен; Это может быть не так в гетерогенном биологическом образце.
  9. Оптимизация наложения полосат для «размёртки» спектральных данных
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следующая процедура гарантирует, что координаты пикселей (x, y) датчика камеры корректно сопоставлены с длиной волны с помощью таблицы поиска LUT.
  10. В окне камеры приблизьте один из заказов Brillouen.
  11. Нажмите s, чтобы визуализировать полосы, по которым LUT накладывается на изображение камеры (рисунок 6A). Откройте окно настроек и нажмите быструю калибровку , чтобы пересчитать оптимальное горизонтальное смещение полос. Если датчик насыщен, сократите время экспозиции перед этим этапом.
    1. В окне камеры убедитесь, что фиолетовые полосы хорошо наложены на центральную область пиков Бриллюэна (рисунок 6B).
  12. Оптимизация связи PK-спектрометра
  13. Регулировка осей линзы коллиматора позволяет максимизировать эффективность передачи света от PK к спектрометру.
  14. Откройте окно спектра и нажмите «развернуть », чтобы получить спектр (рисунок 7).
  15. Откройте окно управления PK . При приросте 0,0005° итеративно регулируйте оси коллиматоров 1 и 2 для максимизации сигнала Бриллюэна. При необходимости контроль давления эталона можно дополнительно оптимизировать. В однородном акриловом кубе сигнал Рэлея может быть полностью подавлен (рисунок 7A). Хотя точные измерения Бриллюэна с некоторым остаточным сигналом Рэлея возможны (см. рисунок 7B), в случаях плохого подавления (рисунок 7C) упругий рассеянный свет заслоняет сигнал Бриллюэна.
  16. Проверьте, что полученный сигнал Бриллюэна сопоставим с эталонной амплитудой. Например, в нашей системе при воздействии 500 мс и при OD 0,3 амплитуда максимальной интенсивности Бриллюэна составляет примерно 3000 счётов. Чтобы сохранить изменения параметров PK в конфигурационном файле, в окне PK нажмите обновить все и сохранить все. Кроме того, в главном окне нажмите сохранить в разделе ввода/вывода файла .
  17. Переход на программное обеспечение для сканирования и проверка оптимизации параметров
  18. Закройте SpectraLok и откройте программу для сканирования. В настоящем протоколе использовалось программное обеспечение на базе LabVIEW, которое подробно описано на рисунке S3. Для задания геометрии сканирования этот проприетарный пользовательский интерфейс (UI) используется для управления этапом трансляции Prior XY-Z; однако могут применяться и другие методы.
    1. Установите чашку Петри с стеклянным дном с образцом гидрогелевого сфероида вместо акрилового куба (рисунок 8). Чтобы предотвратить обезвоживание геля, инкубатор устанавливается на 37 °C и относительной влажности 95%. Снимите крышку чашки Петри и добавьте среду, чтобы погрузить гель. Добавьте верхнюю часть геля, чтобы предотвратить его движение.
    2. Найдите сфероид. Когда лазерный луч заблокирован, переключите оптический путь микроскопа на окуляр. Включите свет белого света. Используя джойстик вручную управляйте этапом сэмпла, найдите и сфокусируйтесь на сфероиде.
    3. Получите яркое изображение сфероида. Регулируйте яркость освещения, поворачивая колесо управления. Установите оптический путь на R, таким образом экспонируя камеру микроскопа. Время экспозиции можно регулировать по мере необходимости для получения изображения с высоким контрастом (то есть 50 мс).
    4. Проверьте, что параметры спектрометра и разворачивания всё ещё оптимизированы. Установите порт микроскопа на L и запечатлите фон с заблокированным лазером. Разблокируйте лазер, повернув колесо в режим включения. Исходя из желаемого отношения сигнал/шум, выбирайте время экспозиции. Время экспозиции, типичное для этих измерений, составляет 200–500 мс.
    5. Если с момента первоначальной калибровки прошло некоторое время (то есть несколько часов) или произошла механическая смучка системы, настройка давления эталона или связь PK-спектрометра могут больше не быть оптимальными. При необходимости повторяйте шаги 5.3-5.5, чтобы переоптимизировать вышеуказанное.
    6. Из неупакованного спектра выберите линейку Brillouin Peak Fitting. Скорректируйте пороговое значение примерно до половины интенсивности пиков Бриллюэна. Не обращайте внимания на пики Бриллюэна с амплитудой ниже этого порога. Корректируйте длину волны лазера по всем выявленным парам пиков Бриллюэна.
  19. Установка многомерной геометрии сканирования
  20. Выберите геометрию растрового сканирования, отрегулировав ширину области сканирования и размер шага.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для сфероидов размером примерно 70 мкм, для низкоразрешённого сканирования мы обычно используем площадь сканирования 150 мкм × 150 мкм и шаг 10 мкм. Это даёт низкоразрешённую двумерную карту примерно за 3,4 минуты.
    1. Начинайте сканирование.
  21. Отключение системы Бриллюэна
    1. Закрой программу и выключи компьютер. Отключите лазерное излучение с помощью клавиши на контроллере. Оставьте колесо затвора в заблокированном положении. Отключите охлаждение лазерного вентилятора. Выключите камеры микроскопа и спектрометра. Наконец, выключите микроскоп.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Файлы, полученные после сканирования, включают спектры, параметры подгонки сканирования (.csv), параметры и анализ сканирования, карты BFS и ширины линии, изображение яркого поля с идентифицированной областью сканирования и скриншот окна интерфейса. Для каждой точки многомерного сканирования Бриллюэна получается значение BFS. На рисунке 9 показан пример высокоразрешающего сканирования рядом с изображением яркого поля, а флуоресцентные изображения показывают ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Мы разработали протокол для использования микроскопии Бриллюэна для биомеханической визуализации сфероидов, встроенных в гидрогели, с микромасштабным разрешением. Гидрогель можно отличить от живого сфероида по различиям в полученных значениях BFS. В репрезентативных результатах мы использовали сфероиды MSC и гидрогели PEG-малеимида; однако этот протокол широко применим к другим типам клеток (например, к раковым клеткавым линиям). Клетки в этом исследовании были сфотографированы в реально...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы отмечают, что Т. Аллен и Г. Уордл являются сотрудниками компании LightMachinery, которая производит и продаёт спектрометр Бриллюэна, использованный в этом исследовании. Компания может получить выгоду от публикации этой работы. Все остальные авторы не заявляют о конкурирующих интересах.

Благодарности

Авторы признают финансирование, полученное из гранта MechanoMeds Phase 2, UKRI/EPSRC, номер гранта EP/X033554/1, для поддержки разработки этого метода.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Четырёхруковый PEG-Maleimide (20 кДа)Creative PEGWorksПСБ-455https://creativepegworks.com/product/4-arm-peg-mal-mw-20k
Пластины AggreWell 400Технологии STEMCELL34411http://stemcell.com/products/aggrewell400.html
Воздушно-пространственный эталонLightMachineryHF-16074-660https://lightmachinery.com/spectrometers/brillouin-spectroscopy-excitation-laser-optimization/
Раствор для промывания против прилипленияТехнологии STEMCELL7010https://www.stemcell.com/products/aggrewell-rinsing-solution.html
Жирная линия Top Stage IncubatorОколабH301-NIKON-NZ100/200/500-Nhttps://www.oko-lab.com/live-cell-imaging/stage-top-digital-gas/chamber/nikon/h301-nikon-nz100-200-500-n
Лазер Cobolt Flamenco-100 660 нмХюбнер0660-05-01-0100-700https://hubner-photonics.com/products/lasers/single-frequency-lasers/05-01-series/
Конфокальный циркуляторLightMachineryHF-13311Н/Д
Система флуоресцентного освещения D-LEDi NikonMBF83000https://www.microscope.healthcare.nikon.com/en_EU/products/light-sources/d-ledi
Модуль EPI-FLNikonTi2-LA-FL-3https://www.microscope.healthcare.nikon.com/en_EU/products/accessories/intermediate-modules
Фибронектин (человек)YoProteins663https://www.yoproteins.com/fibronectin-human-5-mg-663.html
Gibco Dulbecco' Модифицированный Eagle Medium (DMEM)ThermoFisher11965092https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11965092
Гипертонкий спектрометр БриллюэнаLightMachineryHF-8999-PK-660https://lightmachinery.com/spectrometers/brillouin-hyperfine-spectrometer/
LED-DA/FI/TR/Cy5-B Куб четырёхполосного фильтраNikonMXR00753https://www.microscope.healthcare.nikon.com/en_EU/products/accessories/fluorescent-filter-cubes
Мезенхимальные стволовые клетки (MSC)PromoCellC-12974https://promocell.com/us_en/human-mesenchymal-stem-cells-hmsc.html
Моторизованный этап перевода Предыдущая научная деятельностьH117E2NNhttps://www.prior.com/imaging-components/motorized-stages?filter=MicroscopeBrand-33
NucBlue™ Live ReadyProbes™ реагент (Hoechst 33342)ThermoFisherR37605https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/R37605
Цель: S Plan Fluor 20X NA 0.45, воздухNikonMRH08230https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/optics/selector/comparison/-1708
CMOS-камера ORCA-FusionХамамацуC14440-20UPhttps://www.hamamatsu.com/eu/en/product/cameras/cmos-cameras/C14440-20UP.html
PEG-дитиол, 2 кДаCreative PEGWorksPLS-613https://creativepegworks.com/product/hs-peg-sh-mw-2k-10g
sCMOS-камера и bbsp;Решения Teledyne Vision01-IRIS-15-USB-M-16-Chttps://www.teledynevisionsolutions.com/en-gb/products/iris/?model=01-IRIS-15-USB-M-16-C&vertical=tvs-photometrics&segment=tvs 
SPY555-actin СпирохромCY-SC202https://spirochrome.com/product/spy555-actin/
TemperatureAppПрограммное обеспечение для контроля температуры
Пептид VPM, GCRDVPMSMRGGDRCGGenScriptН/ДН/Д
Микроскоп Eclipse Ti-2ANikonEclipse Ti-2Ahttps://www.microscope.healthcare.nikon.com/en_EU/products/inverted-microscopes/eclipse-ti2-series 

Ссылки

  1. Caleb, J., Yong, T. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Front Mol Biosci. 7, 33(2020).
  2. Walker, M., Gourdon, D., Cantini, M. Beyond static models: mechanically dynamic matrices reveal new insights into cancer and fibrosis progression. Curr Opin Biomed Eng. 33, 100570(2025).
  3. Walker, M., Morton, J. P. Hydrogel models of pancreatic adenocarcinoma to study cell mechanosensing. Biophys Rev. 16 (6), 851-870 (2024).
  4. Ryu, S., Martino, N., Kwok, S. J. J., Bernstein, L., Yun, S. H. Label-free histological imaging of tissues using Brillouin light scattering contrast. Biomed Opt Express. 12 (3), 1437-1448 (2021).
  5. Zhang, J., Scarcelli, G. Mapping mechanical properties of biological materials via an add-on Brillouin module to confocal microscopes. Nat Protoc. 16 (2), 1251-1275 (2021).
  6. Kabakova, I., et al. Brillouin microscopy. Nat Rev Methods Primers. 4, 8(2024).
  7. Prevedel, R., Diz-Muñoz, A., Ruocco, G., Antonacci, G. Brillouin microscopy: an emerging tool for mechanobiology. Nat Methods. 16 (10), 969-977 (2019).
  8. Czajkowsky, D. M., Iwamoto, H., Shao, Z. Atomic force microscopy in structural biology: from the subcellular to the submolecular. J Electron Microsc. 49 (3), 395-406 (2000).
  9. Glaser, K. J., Manduca, A., Ehman, R. L. Review of MR elastography applications and recent developments. J Magn Reson Imaging. 36 (4), 757-774 (2012).
  10. Jordan, J., et al. Rapid stiffness mapping in soft biologic tissues with micrometer resolution using optical multifrequency time-harmonic elastography. Adv Sci. 12 (8), e2410473(2025).
  11. Mattarelli, M., Vassalli, M., Caponi, S. Relevant length scales in Brillouin imaging of biomaterials: the interplay between phonons propagation and light focalization. ACS Photonics. 7 (9), 2319-2328 (2020).
  12. Caponi, S., Fioretto, D., Mattarelli, M. On the actual spatial resolution of Brillouin imaging. Opt Lett. 45 (5), 1063-1066 (2020).
  13. Wu, P. H., et al. A comparison of methods to assess cell mechanical properties. Nat Methods. 15 (7), 491-498 (2018).
  14. Rodríguez-López, R., et al. Network viscoelasticity from Brillouin spectroscopy. Biomacromolecules. 25 (2), 955-963 (2024).
  15. Troyanova-Wood, M., Meng, Z., Yakovlev, V. V. Differentiating melanoma and healthy tissues based on elasticity-specific Brillouin microspectroscopy. Biomed Opt Express. 10 (4), 1774-1781 (2019).
  16. Rad, M. A., et al. Micromechanical characterisation of 3D bioprinted neural cell models using Brillouin microspectroscopy. Bioprinting. 25, e00179(2022).
  17. Conrad, C., Gray, K. M., Stroka, K. M., Rizvi, I., Scarcelli, G. Mechanical characterization of 3D ovarian cancer nodules using Brillouin confocal microscopy. Cell Mol Bioeng. 12 (3), 215-226 (2019).
  18. Yan, G., Monnier, S., Mouelhi, M., Dehoux, T. Probing molecular crowding in compressed tissues with Brillouin light scattering. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (4), e2113614119(2022).
  19. Hilai, K., et al. Mechanical evolution of metastatic cancer cells in 3D microenvironment. Small. 21, 2403242(2025).
  20. Mahajan, V., et al. Mapping tumor spheroid mechanics in dependence of 3D microenvironment stiffness and degradability by Brillouin microscopy. Cancers. 13 (21), 5549(2021).
  21. Margueritat, J., et al. High-frequency mechanical properties of tumors measured by Brillouin light scattering. Phys Rev Lett. 122 (1), 018101(2019).
  22. Zhang, J., Nikolic, M., Tanner, K., Scarcelli, G. Rapid biomechanical imaging at low irradiation level via dual line-scanning Brillouin microscopy. Nat Methods. 20 (5), 677-681 (2023).
  23. Nikolić, M., Scarcelli, G., Tanner, K. Multimodal microscale mechanical mapping of cancer cells in complex microenvironments. Biophys J. 121 (19), 3586-3599 (2022).
  24. Scarcelli, G., et al. Noncontact three-dimensional mapping of intracellular hydromechanical properties by Brillouin microscopy. Nat Methods. 12 (12), 1132-1134 (2015).
  25. Berghaus, K. V., Yun, S. H., Scarcelli, G. High speed sub-GHz spectrometer for Brillouin scattering analysis. J Vis Exp. (106), e53468(2015).
  26. Shi, C., et al. Monitoring the mechanical evolution of tissue during neural tube closure of chick embryo. J Vis Exp. (201), e66117(2023).
  27. Trujillo, S., et al. Engineered 3D hydrogels with full-length fibronectin that sequester and present growth factors. Biomaterials. 252, 120104(2020).
  28. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  29. Chiu, C. L., Clack, N. Napari: a Python multi-dimensional image viewer platform for the research community. Microsc Microanal. 28 (S1), 1576-1577 (2022).
  30. Passeri, A. A., et al. Brillouin spectroscopy for accurate assessment of morphological and mechanical characteristics in micro-structured samples. J Phys Photonics. 6 (3), 035016(2024).
  31. Scarcelli, G., Yun, S. H. In vivo Brillouin optical microscopy of the human eye. Opt Express. 20 (8), 9197(2012).
  32. Pollard, T. D., Cooper, J. A. Actin, a central player in cell shape and movement. Science. 326, 1208-1212 (2009).
  33. Antonacci, G., Braakman, S. Biomechanics of subcellular structures by non-invasive Brillouin microscopy. Sci Rep. 6 (1), 37217(2016).
  34. Coker, Z. N., et al. Brillouin microscopy monitors rapid responses in subcellular compartments. PhotoniX. 5 (1), 9(2024).
  35. Yang, F., et al. Pulsed stimulated Brillouin microscopy enables high-sensitivity mechanical imaging of live and fragile biological specimens. Nat Methods. 20 (12), 1971-1979 (2023).
  36. Antonacci, G., et al. Recent progress and current opinions in Brillouin microscopy for life science applications. Biophys Rev. 12 (3), 615-624 (2020).
  37. Savitzky, A., Golay, M. Smoothing and differentiation of data by simplified least squares procedures. Anal Chem. 36, 1627-1639 (1964).
  38. Yan, G., et al. Evaluation of commercial virtually imaged phase array and Fabry-Pérot based Brillouin spectrometers for applications to biology. Biomed Opt Express. 11 (12), 6933-6944 (2020).
  39. Elsayad, K. Spectral phasor analysis for Brillouin microspectroscopy. Front Phys. 7 (62), 1-8 (2019).
  40. Mahmodi, H., et al. Principal component analysis in application to Brillouin microscopy data. J Phys Photonics. 6 (2), 025009(2024).
  41. Antonacci, G., Foreman, M. R., Paterson, C., Török, P. Spectral broadening in Brillouin imaging. Appl Phys Lett. 103 (22), 221105(2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Механическое картирование сфероидов с использованием спектроскопии Бриллюэна
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.