Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Приготовление фильтрата культуры микобактерий туберкулеза для понимания патогенеза туберкулеза

1.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/67540

⸱

28 марта 2025 г.

 , 
1CSIR-Centre for Cellular and Molecular Biology (CSIR-CCMB), 2Academy of Scientific and Innovative Research (AcSIR), 3National Institute of Immunology

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы демонстрируем получение фильтрата культуры Mtb (CF), который представляет собой бактериальную питательную среду, состоящую из белков, выделяемых бактериями. Mtb секретирует белки для модуляции передачи сигналов хозяина и иммунного ответа, которые имеют решающее значение для патогенеза. Полученные КФ анализируются с помощью масс-спектрометрии для выявления всех секреторных факторов.

Аннотация

Mycobacterium tuberculosis (Mtb) выделяет множество белков в организм хозяина, чтобы модулировать различные клеточные процессы, такие как передача сигналов хозяина, иммунный ответ, апоптоз и т. д., для повышения выживаемости. В то время как функция нескольких секреторных факторов была выяснена, многие из них еще предстоит охарактеризовать. Следовательно, изучение секреторного белка Mtb является важной областью исследований. Mtb секретирует белки во внецитоплазматическое пространство с помощью трех различных систем секреции: общей, твин-аргининовой и специализированной системы секреции VII типа. Необходимо подготовить секретом для идентификации новых секреторных молекул и функциональной характеристики известных факторов. Здесь мы опишем метод получения секретома и подготовки образца для масс-спектрометрии. Препарат секретома требует особой осторожности, чтобы избежать контаминации цитозольных белков, которую можно контролировать путем зондирования антителами хорошо охарактеризованных мембранных, секреторных и цитозольных белков. Полученный таким образом культуральный фильтрат может быть использован для различных целей, в том числе для исследования иммуномодулирующих свойств хозяина.

Введение

Микобактерии туберкулеза (МБТ), один из самых смертоносных патогенов во всем мире, заражают здоровых людей через аэрозоли, передаваемые от инфицированного человека во время чихания или кашля1. Как только он попадает в легкие, он поглощается альвеолярными макрофагами, захватывая иммунную систему хозяина, чтобы выжить. Среди различных модулирующих механизмов выживания МБТ является одним из них, одним из них являются факторы секреторной вирулентности. Белки, секретируемые бациллами в культуральную среду во время ее роста, называются белками культурального фильтрата (CF)2. Эти белки фильтрата культур помогают бактериям выживать в суровых условиях внутри клеток хозяина. Mtb оснащен тремя различными типами систем секреции: специализированной системой секреции типа VII (T7SS), общей системой секреции Sec (система Sec) и системой секреции двойного аргинина (система Tat). T7SS является наиболее эксклюзивной системой секреции у актинобактерий, в отличие от типа I-VI у грамотрицательных бактерий3. Секреция развернутого белка через мембрану в основном участвует в системе Sec, и белки распознаются по N-концевой сигнальной последовательности 4,5. Свернутые или частично свернутые белки транспортируются через систему Tat, идентифицированную N-концевой сигнальной последовательностью с мотивомиз двойного аргинина 6,7. Как система Sec и Tat регулирует секрецию белка, еще предстоит определить.

Некоторые известные белки фильтрата культур в Mtb, которые помогают противостоять и выживать при окислительном натиске хозяина при инфекции, являются ферментами, такими как KatG и SodA 8,9, необходимыми для разложения активных форм кислорода. Кроме того, CFP10-ESAT6, гетеродимерный белковый комплекс, играет жизненно важную роль в регуляции цитокиновых реакций, ускользания бактерий, продукции АФК и т. д.10. Локус RD1 участвует в модуляции системы секреции VII типа, которая включает секрецию CFP10-ESAT6, а генетическая делеция cpf10-esat6 ставит под угрозу выживание бактерий в моделях инфекции ex vivo и in vivo. Mycobacterium bovis Вакцинный штамм БЦЖ не имеет локуса RD1, ответственного за секрецию факторов вирулентности, и поэтому может быть использован в качестве живой аттенуированной вакцины11. Различные неизученные клеточные процессы жестко регулируют процесс секреции. Белки фильтрата культуры содержат факторы, способствующие реанимации (RpF), которые помогают бактериям восстанавливаться из латентного состояния. Факторы, способствующие реанимации (Rpfs), представляют собой пептидогликан-гидролизующие ферменты, которые, как известно, играют роль в состоянии покоя. Mtb кодирует пять rpf-подобных генов (rpf A-E), которые помогают бактериям восстанавливаться из состояния покоя либо самостоятельно, либо взаимодействуя с другими белками. Rpfs обнаруживаются в фильтрате бактериальных культур и, как известно, участвуют в вирулентности Mtb и иммунитете хозяина 13,14. Широко изученные гены rpf rpfE и rpfB демонстрируют защитный иммунитет in vitro13 и усиливают иммунные реакции in vivo. Следовательно, rpfE и rpfB могут быть использованы в качестве кандидатов на вакцину против МТБ.

Обратимое фосфорилирование15 представляет собой посттрансляционную модификацию, которая изменяет различные клеточные процессы, клеточный гомеостаз, деление клеток и т.д. Например, фосфорилирование CFP10 играет важную регуляторную роль, когда как фосфораблативные, так и миметические мутанты CFP10 не могут восстановить наблюдаемый фенотип в делеционном штамме CFP10-ESAT6 16. SecA2, с другой стороны, является секреторным белком, участвующим в повреждении ДНК клетки-хозяина17. Секретома мутанта SecA2 достаточно для изменения иммунного ответа хозяина и сигнального каскада 18,19. Таким образом, важно и интересно исследовать секретом H37Rv и мутантов Mtb, где гены секреторных белков удаляются (неопубликованные данные), чтобы получить представление о том, как они влияют на иммуномодуляцию и выживание хозяина.

В этом отчете основное внимание уделяется трем аспектам: этапам, связанным с приготовлением фильтрата культуры Mtb , обработкой образцов для масс-спектрометрии и проведением экспериментов ex vivo с культуральными фильтратами для изучения иммуномодулирующих функций. Более ранние исследования показали идентификацию белков фильтрата культуры с помощью 2D гель-электрофореза с последующим масс-спектрометрическим анализом8. Белки фильтрата культур из чувствительных к лекарствам и устойчивых штаммов были идентифицированы с помощью масс-спектрометрии для получения представления об изменениях секретома и выявления факторов вирулентности, которые могут играть роль в лекарственной устойчивости. Ранее мы исследовали секретом и фосфосекретом Mtb с помощью масс-спектрометрии16. Такие методы, как 2D-гель-электрофорез, имеют низкую производительность и не используются для исследования глобальных изменений в протеоме или секретоме. Белки фильтрата культуры будут варьироваться в зависимости от штаммов бактерий, стадий роста клеток и даже в различных стрессовых условиях. В зависимости от различных ситуаций, изменение пулов секреторных белков внутри клеток позволяет исследовать весь секретом целостно и предоставляет больше информации о системе бактериальной секреции для терапевтических вмешательств. Было бы еще более привлекательно рассмотреть секретом в нокаутах или истощенных штаммах секреторных систем, чтобы получить более глубокое понимание путей и мишеней каждого секреторного пути. Обработка клеток белками фильтрата культуры вместо бактерий изменяет уровни цитокинов и других иммуномодулирующих факторов17. С помощью исследования секретома можно выявить новые факторы вирулентности и их роль в вирулентности.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь мы используем патогенный лабораторный штамм H37Rv Mtb. Необходимо выполнить шаги, необходимые для выращивания бактериальной культуры и выделения надосадочной жидкости в лаборатории биобезопасности уровня 3 (BSL-3). От оживления культуры до подготовки фильтрата используется установка BSL-3.

1. Инокуляция культуры Mtb

  1. Подготовка рабочей зоны в BSL-3
    1. Перед использованием включите ультрафиолетовый свет шкафа биобезопасности на 10 минут. Очистите шкаф биобезопасности 75% этанолом до и после использования. Утилизируйте использованные материалы в соответствующих мусорных баках в соответствии с рекомендациями по биобезопасности.
  2. Приготовление первичных и вторичных культур Mtb H37Rv
    1. Возьмите глицериновый бульон от -80 °C и разморозьте бульон при комнатной температуре. Используйте четыре независимых подвоя для биологических четверняшек.
    2. Возьмите 10 мл среды 7H9 (табл. 1), содержащей 10% АЦП (9 мл среды 7H9 и 1 мл АЦП) в автоклавную коническую колбу объемом 100 мл с завинчивающейся крышкой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: 7H9 + ADC: 7H9 - это богатая питательными веществами среда, полученная промышленным путем, к которой мы добавляем ADC (ADC: альбумин, декстроза и каталаза; Таблица 2). Для выращивания культуры можно использовать как ADC, так и OADC. Конические колбы обеспечивают большую аэрацию культуры; Тем не менее, можно также использовать колбу для культуры тканей для выращивания бактериальных клеток.
    3. Инокулируйте весь запас глицерина в среду, чтобы оживить культуру, которая становится первичной культурой. Возьмем культуру Mtb 600 ~ 0,8 для производства запасов глицерина. Смешайте 15% глицерина и растущую культуру Mtb в криовиальной камере и храните при температуре -80 °C.
    4. Инкубировать колбы с культурой при температуре 37 °С в встряхивателе инкубатора в течение 3-4 суток при 100 об/мин.
    5. На5-й день измерьте поглощение на длине волны 600 нм (А600). Когда культуры достигнут A600 ~ 0,8-1, используйте культуру для инокуляции вторичной культуры при A600 ~ 0,2 в 100 мл среды 7H9 +10% ADC в колбе объемом 500 мл. Выполните те же действия для реплик.
      1. Измерьте A600 первичной культуры. Если A600 составляет ~ 0,8, гранулируйте культуру центрифугированием при 2100 x g в течение 10 минут. Выбросьте надосадочную жидкость, повторно суспендируйте гранулу в 5 мл среды 7H9 + 10% ADC и измерьте A600. Рассчитайте, сколько инокулюма будет добавлено в 100 мл вторичной культуры А600 ~ 0,2. Например, если используется A600 ~ 4, то 5 мл этой культуры необходимо добавить к 100 мл свежей 7H9 + 10% вторичной культуры ADC A600 ~ 0,2.
    6. Выращивайте их при 37 °C в шейкере инкубатора при 100 об/мин в течение 2-3 дней до наружного диаметра A600 ~ 0,8.
    7. Извлеките 10 μL с помощью дозатора с фильтрующим наконечником и найдите посев на планшете LB Agar, который не содержит антибиотиков в бактериальном колпаке. Инкубируйте планшет при температуре 37 °C в течение 12-16 часов, чтобы визуализировать бактериальное загрязнение (если таковое имеется). Выбросьте культуры и оживите новые культуры эксперимента, если обнаружено бактериальное загрязнение.
  3. Рост бактерий в средах Sauton
    1. При А600 ~ 0,8 инокулируйте бактерии при А600 ~ 0,2 в 100 мл среды Саутона в колбу объемом 500 мл (Таблица 3) и выращивайте в течение 3-4 дней после того, как ОД достигнет ~0,8.
    2. Используйте культуры, выращенные до А600 ~ 0,8 в среде Саутона (первичная культура Саутона) для инокуляции культур, которые будут использоваться для приготовления фильтрата культур.
      ПРИМЕЧАНИЕ: 7H9 + ADC - это богатая питательными веществами среда, содержащая альбумин. Альбумин не может быть использован в анализе секретома, так как альбумин может маскировать белки фильтрата культуры. Следовательно, среда Sauton используется для приготовления фильтрата культуры. Среда Sauton подготавливается путем восстановления компонентов, упомянутых в таблице 3.

2. Приготовление белков фильтрата культуры МТБ

  1. Центрифугирование для надосадочной жидкости для культур
    1. Используйте первичную культуру Саутона для инокуляции 300 мл вторичной культуры Саутона при А600 ~0,2. Выращивайте культуры до ОД А600 ~0,4-0,5. Используйте активно растущие культуры ранней фазы логарифма, чтобы избежать загрязнения мертвыми клетками.
      1. Измерьте OD вторичной культуры. Если внешний диаметр достигает A600 ~0,8, гранулируйте культуру центрифугированием при 2,100 x g в течение 10 минут. Выбросьте надосадочную жидкость, повторно суспендируйте гранулу в 10 мл среды Саутона и снова возьмите OD. Рассчитайте, сколько инокулюма будет добавлено в 300 мл культуры с 0,2 OD от измеренного OD. Например, если OD равен 8, то 7,5 мл этой культуры должно быть добавлено к 300 мл свежей среды Sauton с 0,2 OD.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Придерживайтесь упомянутого OD, чтобы уменьшить лизис клеток и загрязнение GroEL. GroEL является шапероном и конститутивно экспрессируется в бактериальных клетках. В некоторых литературных работах было показано присутствие GroEL в фильтратах культур из-за стресса во время роста. Здесь мы используем среду Sauton для приготовления культурального фильтрата, который обеспечивает мягкий стресс для клеток; следовательно, GroEL может присутствовать в фильтрате культуры. Кроме того, если OD культуры больше 1, произойдет лизис клеток, что приведет к загрязнению GroEL фильтрата культуры.
    2. Гранулируйте 300 мл выращиваемых культур в 6 пробирках по 50 мл при концентрации 2 100 x g в течение 10 мин при 4 °C (рис. 1A).
    3. В каждом случае извлеките 45 мл надосадочной жидкости, оставив гранулу нетронутой, серологической пипеткой объемом 25 мл в новую пробирку. Отложите гранулу в сторону для приготовления лизата цельных клеток (WCL).
    4. Повторите центрифугирование при температуре 2 100 x g в течение 10 минут при температуре 4 °C. Извлеките 40 мл надосадочной жидкости (оставив 5 мл культуры нетронутыми) с помощью серологической пипетки объемом 25 мл в новую пробирку и повторите этап центрифугирования.
    5. Влейте 35 мл надосадочной жидкости в свежую пробирку и отфильтруйте надосадочную жидкость культуры с помощью шприцевого фильтра 0,2 мкм. Отфильтруйте в свежую пробирку, чтобы устранить патогенное бактериальное загрязнение. Из 300 мл культуры извлекают 210 мл фильтрата культуры на одну реплику.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Фильтр, который был использован здесь для фильтрации культур, представляет собой стерильный шприцевой фильтр размером 0,22 мкм (тип SY25PL-S).
    6. После фильтрации фильтрата культуры инокулируют 1 мл аликвоты фильтрата отфильтрованной культуры на агаровую тарелку и инкубируют в инкубаторе при температуре 37 °С в течение 4 недель, чтобы убедиться в наличии других патогенных бактериальных загрязнений в фильтрате культуры. Примите 1 мл аликвоты из лизата целых клеток (WCL) и соблюдайте те же меры безопасности.
    7. Протрите пробирки с образцами 75% этанолом и извлеките их из BSL-3 через пропускную коробку.
  2. Получение лизата цельных клеток (WCL)
    1. Повторно суспендируйте гранулу в 1 мл 1x PBSG, содержащей фенилметилсульфонилфторид (PMSF), 1x коктейль ингибиторов протеазы, и перенесите лизат в трубки для взбивания шариков с завинчивающейся крышкой объемом 2 мл, содержащие 1/3 объема 0,1 мм гранул диоксида циркония.
      ПРИМЕЧАНИЕ: 1x PBSG состоит из 1x PBS + 5% глицерина. Возьмем, к примеру, отношение гранул к массе буфера 1:3.
    2. Лизируйте образцы путем взбивания бусин в мини-бисерной машине: 1 минута взбивания бусин, а затем 2 минуты инкубации на льду. Повторите это 8 раз.
    3. Центрифугируйте пробирки при давлении 18 000 x g в течение 15 мин при 4 °C. Соберите надосадочную жидкость в свежую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл и держите ее на льду.
    4. Повторите этап центрифугирования. Пропустите надосадочную жидкость через шприцевой фильтр 0,2 мкм для устранения патогенного бактериального загрязнения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Фильтр, используемый здесь для фильтрации фильтрата культур, представляет собой стерильный шприцевой фильтр толщиной 0,22 мм (тип SY25PL-S).
    5. Протрите образцы 75% этанолом и извлеките их из BSL-3 через проходной ящик. Проверьте концентрацию лизатов с помощью набора для анализа BCA, как указано ниже. Храните лизаты при температуре -80 °C.
  3. Концентрируйте белки фильтрата культуры с помощью центробежных фильтровальных установок.
    1. Сконцентрируйте 210 мл белков культуры Mtb для фильтрации белков с помощью центробежных фильтровальных установок. Используйте трубки центробежного фильтрующего блока емкостью 3 кДа 15 мл (центриконы) для концентрации фильтрата культуры в ~1 мл (рис. 1A). Трубки центробежного фильтрующего блока с массой 3 кДа удерживают белки того же размера или более 3 кДа.
    2. Добавьте примерно 15 мл каждой реплики фильтрата культуры в одну пробирку centricon и центрифугируйте при температуре 2100 x g в течение 1 ч при 4 °C.
    3. Отбросьте проточный поток в соответствии с нормой и повторите шаг 2.3.2 в течение 15–16 раз до 210 мл концентрата фильтрата культуры до ~1 мл.
    4. Аликвоту 100 мкл концентрированной культуры отфильтровать белки в десять микроцентрифужных пробирок с низким связыванием белка и оценить концентрацию белка с помощью набора BCA.
  4. Оценка концентрированных белков
    1. Оценивайте концентрацию белка по отношению к БСА в качестве стандарта. Используйте 1 мкг, 2 мкг, 3 мкг и 4 мкг BSA в объеме 25 мкл в двух экземплярах. Если образец был неразбавленным, для оценки используйте 5-кратно разбавленный (в PBS) образец объемом 25 мкл в двух экземплярах. Расчеты выполнены на 96 планшетах скважин. Используйте контрольный прибор без отбора проб (бланк), содержащий 25 мкл PBS.
    2. Добавьте 175 мкл смешанного реагента в соответствии с инструкциями производителя. Смешайте образцы с помощью многоканальной пипетки и инкубируйте при температуре 37 °C в течение 1 ч. Измерьте показания на длине волны 562 нм с помощью считывателя ELISA. Вычтите значения из пустых значений, чтобы получить значения для BSA и образцов.
    3. Подгонка стандартной кривой к кривой линейной регрессии и оценка выборок относительно стандарта. Следуйте инструкциям по оценке белка в наборе BCA.

3. Подтверждение белков фильтрата культуры с помощью различных маркеров

  1. Определение белков с помощью окрашивания по Кумасси
    1. Чтобы подтвердить присутствие белков в фильтрате культуры, возьмите 30 мкг белка и растворите на 10% Додецилсульфат натрия – полиакриламид гель для электрофореза (SDS-PAGE; Таблица 4).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Следуйте описанию таблицы, чтобы сделать SDS-PAGE, Coomassie staining и destaining solutions буферами.
    2. Добавьте в гель 20 мл раствора для окрашивания Кумасси (табл. 5) и выдерживайте 30 мин на коромыслах при комнатной температуре. Выбросьте раствор для окрашивания.
    3. Добавьте в гель 30 мл раствора для удаления жидкости (табл. 6) и выдержите 30 мин на коромысле при комнатной температуре. Выбросьте раствор для задержания и добавьте новый раствор для задержания. Повторяйте до тех пор, пока гель не закрепится должным образом.
    4. Проверьте прожилку белка на трансиллюминаторе (рис. 1B). Поскольку белок фильтрата культуры содержит несколько белков, после распыления в геле можно увидеть полосу белковых полос (рис. 1B).
  2. Подтверждение вестерн-блоттинга на маркер секретируемого белка
    1. Используйте антитела секретируемого белка для проверки наличия секретируемого белка в фильтрате культуры. Ag85B (ab43019) является хорошо известным белком, секретируемым Mtb в культуральном фильтрате и присутствующим в цитозоле; антитело Ag85B (концентрация 5 мг/мл) (разведение 1:5000 в 5% БСА) используется в качестве положительного контроля для секретируемого белка.
    2. Загрузите в WCL белки фильтрата культуры для дифференциации цитозольных/мембранных и секретируемых белковых фракций. Ag85B является цитозольным и секретируется, поэтому он должен присутствовать в обеих фракциях; с другой стороны, известно, что PknB локализован в мембране и не присутствует в фильтрате культуры.
    3. Определите концентрацию белков в фильтрате WCL/культуры с помощью набора BCA. Смешайте 30 г фильтрата WCL/культуры с 2-кратным ламелли-буфером в объеме 30 мл (Таблица 7). Разрешите образцы в 10% SDS-PAGE для PknB и 12% SDS-PAGE для Ag85B до тех пор, пока фронт красителя не достигнет дна, используя буфер SDS gel runnimg (Таблица 8). Не допускайте переднего стекания красителя с геля.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Размер Ag85B составляет ~35 кДа, поэтому используется 12 % SDS-PAGE.
    4. Вырежьте 9 см х 6 см 0,2 мкм нитроцеллюлозную мембрану для переноса (табл. 9) белка из геля на мембрану. Настройте перенос с помощью кассеты для переноса, замочив кассеты, поролоновые подушечки, промокательную бумагу, гель и мембрану в 1x ледяном буфере для переноса.
    5. Поместите поролоновую губку с одной стороны кассеты, затем положите промокательную бумагу, поместите гель, наложите нитроцеллюлозную мембрану поверх геля, снова положите промокательную бумагу и, наконец, положите еще одну поролоновую губку и закройте держатель кассеты. Поместите держатель кассеты в передаточный бак так, чтобы сторона мембраны была обращена к аноду, а сторона геля — к катодному.
    6. Подсоедините катод и анодный провод к баку, чтобы закрыть установку, и установите ее на ток 120 мА в течение 120 минут. Начните перекачку в холодном помещении.
    7. Поместите мембрану в небольшую пластиковую коробку после окончания переноса. Заблокируйте мембрану с помощью 10 мл 5% раствора BSA, изготовленного в 1x PBST20 , чтобы уменьшить неспецифическое связывание в течение 1 часа при комнатной температуре на коромысле.
    8. Удалите блокирующий раствор, добавьте 5-10 мл первичного антитела, которое является антителом против мыши Ag85B (1:5000 разведений в 5% растворе BSA), и инкубируйте при 4 °C в течение ночи в коромысле. Храните антитело при температуре -20 °C и повторно используйте до 3 раз.
    9. Удалите первичное антитело, добавьте 5-10 мл 1x PBST20 и промойте мембрану в течение 8 минут при комнатной температуре путем энергичного встряхивания. Снимите первую промывку, добавьте 5-10 мл 1x PBST20 еще раз и промойте. Повторите это 2 раза.
    10. Добавьте 5-10 мл 1x PBST20 , содержащего вторичное антитело, которое представляет собой конъюгированное антитело против мышиной окислительно-восстановительной пероксидазы (HRP) (разведение 1:10 000), и инкубируйте в течение 2 часов при комнатной температуре на коромысле.
    11. Промойте мембрану после вторичного антитела, следуя шагу 3.2.9. Добавьте равное количество подложки HRP и усилителя для проявления мембраны под хемилюминометром (Рисунок 1C).
      Примечание: Чтобы подтвердить отсутствие контаминации цитозольного белка, мы исследовали вестерн-блот антителом к PknB (рис. 1C). Антитело было выращено в Национальном институте иммунологии (National Institute of Immunology) против очищенного экстрацитоплазматического домена PknB. Полосу PknB можно наблюдать в WCL, а не в фильтратах культуры, а PknB является исключительно цитозольным и мембраносвязанным и не должен присутствовать в фильтрате культуры.

4. Подготовка образцов для масс-спектрометрии

  1. Выполните расщепление белка в растворе с помощью трипсина.
    1. Возьмите 100 μг белка фильтрата культуры, добавьте в 6 раз объем ледяного ацетона и держите его при температуре -20 °C в течение ночи.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте стеклянную посуду для подготовки всех реагентов для образца масс-спектрометрии. Используйте микроцентрифужные пробирки с низким содержанием белка и наконечники для связывания с низким содержанием белка. Не используйте пластиковый материал, чтобы избежать загрязнения полимерами при масс-спектрометрическом анализе.
    2. Осаждение белков методом центрифугирования при 18 000 x g при 4 °C в течение 30 минут. Выбросьте надосадочную жидкость.
    3. Промойте гранулу 500 μл ацетона, задавите гранулу при 18 000 x г в течение 10 минут при 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость. Удалите остатки ацетона с помощью вакуумного концентратора.
    4. Добавьте 20 мкл 8 М мочевины, растворенной в 25 мМ бикарбонате аммония (2 М бульона, приготовленных в воде класса MS). Сделайте образцы вихревыми и инкубируйте в течение 30 минут при комнатной температуре.
    5. При 60 мкл 25 мМ бикарбоната аммония развести 8 М мочевины до 2 М. Инкубировать при комнатной температуре в течение 1 ч. Добавьте 4 мкл TCEP (конечная концентрация 10 мМ в 25 мМ бикарбонате аммония) и инкубируйте при комнатной температуре в течение 30 минут, встряхивая при 1800 x g.
    6. Добавьте 4 мкл IAA (конечная концентрация 25 мМ в 25 мМ бикарбонате аммония) и инкубируйте при комнатной температуре в течение 30 минут, встряхивая при 1800 x g в темноте. Добавьте 110 мкл 25 мМ бикарбоната аммония.
    7. Добавьте трипсин (1:20; Трипсин: белок в мкг) в раствор и выдерживать его при температуре 37 °C, встряхивая при 300 об/мин, для ночного переваривания (рис. 2). Остановите реакцию пищеварения, добавив 10% TFA (трифторуксусную кислоту). Быстро пропылесосьте образцы до полного высыхания.
  2. Обессоливание образца
    1. Добавьте к расщепленным пептидам 100 мкл 5% ACN + 0,1% TFA. Вихрь в течение 30 минут при 1 500 об/мин при комнатной температуре.
    2. Центрифуга при 18 000 x g в течение 10 минут при комнатной температуре. Возьмите надосадочную жидкость (пептид), не прикасаясь к грануле, в свежие микроцентрифужные пробирки и приступайте к обессоливанию. Сделайте все моющие и элюирующие растворы перед этапом обессоления.
    3. Уравновесьте наконечник колонки C-18 100 мкл 100% ACN + 0,1% TFA, дозируя раствор и повторив процесс 5 раз.
    4. Добавьте 100 мкл 50% ACN + 0,1% TFA и повторите процесс 5 раз. Добавьте 100 μL 5% ACN + 0,1% TFA и повторите процесс 5 раз.
    5. Дайте пептидному связыванию на кончике колонки С-18 с помощью пипетирования 30x. Держите раствор при температуре -20 °C до тех пор, пока образец не будет обработан для масс-спектрометрии. Теперь пептид связывается с колонкой С-18.
    6. Промойте колонку C-18 100 μл воды класса MS + 0,1% TFA путем пипетирования и повторите процесс 5 раз.
    7. Промойте колонку C-18 100 мкл 5% ACN + 0,1% TFA с помощью пипетирования и повторите процесс 5 раз. Элюируйте пептиды из колонки С-18 в 100 мкл 50% ACN + 0,1% TFA путем пипетирования 30x (рис. 2).
      ПРИМЕЧАНИЕ: После элюирования наконечник колонки C-18 можно хранить при температуре 4 °C до тех пор, пока не будет завершена масс-спектрометрия.
    8. Быстро вакуумируйте полностью элюированный пептид и храните его при температуре -20 °C до тех пор, пока образец не будет передан на масс-спектрометрию.
  3. Введение образцов пептида в масс-спектрометрию.
    1. Добавьте 20 мкл раствора А (предоставленного масс-спектрометрической установкой) к высушенным образцам пептида. Обработайте образцы вихревыми в течение 30 минут и центрифугируйте в течение 90 минут при температуре 4 °C.
    2. Введите 20 мкл образца в масс-спектрометрический аппарат для выполнения градиента в течение 90 минут.

5. Анализ данных на секретируемые белки, присутствующие в фильтрате культуры

  1. Идентификация белков
    1. Анализируйте протеомные образцы с помощью квадрупольного масс-спектрометра. Запросите полученные спектры по базе данных Mtb H37Rv UniprotKB.
    2. Установите допуски по массе прекурсора и фрагмента на уровне 10 ppm и 0,5 Да. Установите фермент на трипсин с максимальным значением пропущенного расщепления, равным двум.
    3. Используйте программное обеспечение протеома с Sequest в качестве алгоритма поиска с карбамидометилированием цистеина в качестве фиксированной модификации.
    4. Определите все совпадения пептидного спектра (ПСМ) с вероятностью ложного обнаружения 1%. Примените настройки по умолчанию для всех остальных параметров.
    5. Сопоставьте необработанные файлы масс-спектрометрии пептидной последовательности с идентификатором UniProt соответствующих белков Mtb. Перечислите все белки Mtb, их идентификаторы Uniprot и функциональную классификацию с помощью базы данных Mycobrowser.
    6. Для дальнейшего анализа сопоставьте идентификаторы UniProt идентифицированных белков с их соответствующим номером Rv . Передача данных секретома масс-спектрометрии в консорциум ProteomeXchange через партнера Pride.

6. Обработка H37Rv белком фильтрата культуры для проверки изменения сигнализации хозяина

  1. Выделение перитонеальных макрофагов у мышей.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следуйте ссылке21 для выделения перитонеальных макрофагов, посева клеток и инфекции.
    1. Вводите мышам Balb/c (в возрасте 4-6 недель) 1 мл 4% тиогликолата и изолируйте перитонеальные макрофаги из брюшины мыши на4-й день инфекции21 (Рисунок 3).
    2. Соберите клетки макрофагов путем введения 1x PBS в брюшину мыши. Центрифугируйте клетки при давлении 1800 x g в течение 5 минут, выбросьте надосадочную жидкость и добавьте 5 мл среды 1640-RPMI с добавлением 10% FBS (фетальная бычья сыворотка; полная среда) и 1x пен-стрептококк (антибиотики).
    3. Высадите 3 x 10по 5 клеток в лунку в 24-луночные планшеты и инкубируйте планшеты в инкубаторе с температурой 37 °C на ночь. На следующий день смените среду на свежую, полноценную среду, и клетки будут готовы к заражению или обработке белками фильтрата культуры.
  2. Обработка перитонеальных макрофагов белками фильтрата культуры
    1. Перенесите клетки макрофагов в BSL-3 и держите их в инкубаторе. Обработайте клетки белками фильтрата культуры с концентрацией 1 мг/мл (рис. 3). Соберите клетки в разные моменты времени через 4 ч, 24 ч и 48 ч после обработки филтрата.
      1. Засейте изолированные клетки макрофагов в 24 луночных планшета в трех экземплярах в каждой временной точке. Обрабатывайте клетки 1 мг/мл белков фильтрата культуры и инкубируйте при температуре 37 °C в инкубаторе в присутствии CO2. Соберите клетки в трех временных точках: через 4 ч, 24 ч и 48 ч после обработки.
      2. Обрабатывайте клетки i) 2x-ламельным буфером для получения лизатов макрофагальных клеток и проверки на наличие различных маркеров клеток-хозяев путем проведения вестерн-блоттинга, и ii) различными буферами для иммунологических анализов, предоставленных производителями вместе с наборами.
    2. Подготовьте клеточные лизаты хозяина и проверьте наличие различных маркеров, цитокинового профилирования клеток хозяина и экспрессии различных белков сигнального пути на обработанных культуральным фильтратом макрофагальных клетках.
      Примечание: Если в лаборатории имеется мутант замещения гена белка секреторного пути, культуральные фильтраты, полученные из Mtb H37Rv и мутанта Mtb , могут быть использованы для оценки их влияния на иммуномодулирующие параметры хозяина.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

В этом протоколе мы продемонстрировали выделение белков фильтрата культуры из микобактерий (рис. 1A). Затем белки фильтрата культуры проверяли на наличие различных маркеров, чтобы подтвердить выделение фильтрата культуры. Как упоминается в протоколе, для проверки белковой нагрузки проводилось окрашивание по Кумасси. Во фракции WCL (на последней полосе рис . 1B) можно наблюдать полосатую полосу белка, тогда как на полосах CF (культурального фильтрата) не...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Одним из важнейших направлений исследований является понимание патогенеза МТБ и разработка эффективных средств диагностики и вакцин22,23. Выделение белков фильтрата культуры из питательных сред Mtb является процессом, который позволяет идентифицировать факторы вирулентности, секретируемые патогеном. Исследование роли секреторных белков в модуляции патогенеза Mtb дает представление о механизмах, а также ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,2 & микро; m Шприцевые фильтрыmdiSYPL0601MNXX204
0,2&микро; m Нитроцеллюлозная мембранаAmersham10600001
37% HClMerckH1758
АцетонEMPLURA MERCKSL9F690866
АцетонитрилSigma-Aldrich34851-2L
АкриламидBIORAD1610107
АльбуминBio Basic КанадаНомер кота: AD0023
Amicon Ultra-15Merck, MilliporeUFC900396
Аммоний биокарбонатSigma-Aldrich09830-500G
Персульпа аммонияSigma-AldrichA3678-100G
анти-Ag85BAbcamAB43019
против мыши HRP конъюгированное вторичное антителоThermo Fischer62-6520
АспарагинSigma-AldrichA0884-500G
бис-акриламидSIGMA146072-500G
BSAMerckMB083-500G
C-18 колонкаThermo FischerSEM SS18V
Catalase Сигма-ОлдричC1345
Лимонная кислотаСигма-ОлдричC0759-500Г
ДекстрозаСигма-ОлдричG7021-1KG
Дифко Средний ручей 7H9 бульон   Fisher Scientific271310
Цитрат железа аммония(III)Sigma-AldrichF5879-100G
Муравьиная кислота 98-100%MerckZ0823704246
Ледяная уксусная кислота 100%MerckCD0C700160
глицинSigma-AldrichG8898-1KG
ГлицинSIGMAG8898-1KG
ГицеролСигма-ОлдричG5516
Иммобилион Западный хемилюминесцентный субстратHRPМерк WBKLS0500
ЙодоацетамидАмершамRPN6302V
Сульфата магнияСигма-ОлдричM7506-500G
Микобросвер
Олеиновая кислотаСигмаКат No: O1008
Набор для анализа белка Pierce BCAThermo Fischer23225
Pierce Trypsin ProtaseThermo Fischer90058
Proteome Discoverer 2.0Thermo Fischer Scientific
Q-Exactive HF (Thermo Scientific) (протеомные эксперименты - пептидное секвенирование, идентификация и количественное определение белка)Thermo Fischer Scientific
Хлорид натрияSigmaCat No: S3014
Sodium ChlorideSigma-AldrichS7773-1KG
Додецилсульфат натрияSigma-AldrichL3771-1KG
TCEPSigma-AldrichC4706-25
TemedSigma-AldrichT9281-100ML
Tris BaseBioRad161-0719
Tris-HClAMRESCO0234-500G
Tween 80Sigma-AldrichP1754
UniProt protein data base
UreaMP Bio194857

Ссылки

  1. Campbell, I. A., Bah-Sow, O. Pulmonary tuberculosis: diagnosis and treatment. Br Med J. 332 (7551), 1194-1197 (2006).
  2. Sonnenberg, M. G., Belisle, J. T. Definition of Mycobacterium tuberculosis culture filtrate proteins by two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis, N-terminal amino acid sequencing, and electrospray mass spectrometry. Infect Immun. 65 (11), 4515-4524 (1997).
  3. Burts, M. L., Williams, W. A., DeBord, K., Missiakas, D. M. EsxA and EsxB are secreted by an ESAT-6-like system that is required for the pathogenesis of Staphylococcus aureus infections. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (4), 1169-1174 (2005).
  4. Braunstein, M., Brown, A. M., Kurtz, S., Jacobs, W. R. Jr Two nonredundant SecA homologues function in Mycobacteria. J Bacteriol. 183 (24), 6979-6990 (2001).
  5. Feltcher, M. E., et al. Label-free quantitative proteomics reveals a role for the Mycobacterium tuberculosis SecA2 pathway in exporting solute binding proteins and Mce transporters to the cell wall. Mol Cell Proteomics. 14 (6), 1501-1516 (2015).
  6. McDonough, J. A., Hacker, K. E., Flores, A. R., Pavelka, M. S. Jr, Braunstein, M. The twin-arginine translocation pathway of Mycobacterium smegmatis is functional and required for the export of mycobacterial beta-lactamases. J Bacteriol. 187 (22), 7667-7679 (2005).
  7. Saint-Joanis, B., et al. Inactivation of Rv2525c, a substrate of the twin arginine translocation (Tat) system of Mycobacterium tuberculosis, increases beta-lactam susceptibility and virulence. J Bacteriol. 188 (18), 6669-6679 (2006).
  8. Braunstein, M., Espinosa, B. J., Chan, J., Belisle, J. T., Jacobs, W. R. Jr SecA2 functions in the secretion of superoxide dismutase A and in the virulence of Mycobacterium tuberculosis. Mol Microbiol. 48 (2), 453-464 (2003).
  9. Zulauf, K. E., Sullivan, J. T., Braunstein, M. The SecA2 pathway of Mycobacterium tuberculosis exports effectors that work in concert to arrest phagosome and autophagosome maturation. PLoS Pathog. 14 (4), e1007011(2018).
  10. Guinn, K. M., et al. Individual RD1-region genes are required for export of ESAT-6/CFP-10 and for virulence of Mycobacterium tuberculosis. Mol Microbiol. 51 (2), 359-370 (2004).
  11. Lewis, K. N., et al. Deletion of RD1 from Mycobacterium tuberculosis mimics bacille Calmette-Guerin attenuation. J Infect Dis. 187 (1), 117-123 (2003).
  12. Kana, B. D., et al. The resuscitation-promoting factors of Mycobacterium tuberculosis are required for virulence and resuscitation from dormancy but are collectively dispensable for growth in vitro. Mol Microbiol. 67 (3), 672-684 (2008).
  13. Russell-Goldman, E., Xu, J., Wang, X., Chan, J., Tufariello, J. M. A Mycobacterium tuberculosis Rpf double-knockout strain exhibits profound defects in reactivation from chronic tuberculosis and innate immunity phenotypes. Infect Immun. 76 (9), 4269-4281 (2008).
  14. Biketov, S., et al. The role of resuscitation promoting factors in pathogenesis and reactivation of Mycobacterium tuberculosis during intra-peritoneal infection in mice. BMC Infect Dis. 7, 146(2007).
  15. Verma, R., et al. Quantitative proteomic and phosphoproteomic analysis of H37Ra and H37Rv strains of Mycobacterium tuberculosis. J Proteome Res. 16 (4), 1632-1645 (2017).
  16. Malakar, B., et al. Phosphorylation of CFP10 modulates Mycobacterium tuberculosis. mBio. 14 (5), e0123223(2023).
  17. Lochab, S., Singh, Y., Sengupta, S., Nandicoori, V. K. Mycobacterium tuberculosis exploits host ATM kinase for survival advantage through SecA2 secretome. Elife. 9, e51466(2020).
  18. Kurtz, S., McKinnon, K. P., Runge, M. S., Ting, J. P., Braunstein, M. The SecA2 secretion factor of Mycobacterium tuberculosis promotes growth in macrophages and inhibits the host immune response. Infect Immun. 74 (12), 6855-6864 (2006).
  19. Sullivan, J. T., Young, E. F., McCann, J. R., Braunstein, M. The Mycobacterium tuberculosis SecA2 system subverts phagosome maturation to promote growth in macrophages. Infect Immun. 80 (3), 996-1006 (2012).
  20. Putim, C., et al. Secretome profile analysis of multidrug-resistant, monodrug-resistant and drug-susceptible Mycobacterium tuberculosis. Arch Microbiol. 200 (2), 299-309 (2018).
  21. Naz, S., Dabral, S., Kumar, D., Nandicoori, V. K. Protocol for ex vivo competition and sequencing of Mycobacterium isolated from infected guinea pigs. STAR Protoc. 3 (4), 101804(2022).
  22. Xu, D. D., et al. Discovery and identification of serum potential biomarkers for pulmonary tuberculosis using iTRAQ-coupled two-dimensional LC-MS/MS. Proteomics. 14 (2-3), 322-331 (2014).
  23. Prasad, T. S., et al. Proteomic analysis of purified protein derivative of Mycobacterium tuberculosis. Clin Proteomics. 10 (1), 8(2013).
  24. Miller, B. K., et al. Mycobacterium tuberculosis SatS is a chaperone for the SecA2 protein export pathway. Elife. 8, e40063(2019).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Секреторные белкисистемы секрециимасс-спектрометрияконцентрация белкабактериальные факторы вирулентностииммуномодуляция хозяинацентрифугирование
Приготовление фильтрата культуры микобактерий туберкулеза для понимания патогенеза туберкулеза
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.