ВыделениеМСК свысоким уровнемMFGE8 BAMBI, одной из трех основных подгрупп, составляющих гетерогенные МСК человека с высоким уровнем MFGE8, полезно для полного понимания характеристик и функций этого подтипа для его будущего применения для повышения клинической эффективности при конкретных заболеваниях. Здесь мы представляем метод сортировки BAMBIс высоким MFGE8высоким UC-MSCs.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Выделение мезенхимальных стромальных клеток человеческого BAMBIс высоким уровнемMFGE8
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Полученные из пуповины мезенхимальные стромальные/стволовые клетки (ЯК-МСК) обладают низкой иммуногенностью и мощными иммуномодулирующими эффектами при лечении различных заболеваний. ЯК-МСК человека представляют собой гетерогенную популяцию, состоящую из трех основных субпопуляций с различной формой клеток, скоростью пролиферации, дифференцировочными способностями и иммунными регуляторными функциями. Ранее было обнаружено, что BAMBIс высоким уровнемMFGE8и высоким уровнем ЯК-МСК, первая подгруппа, успешно выделенная из ЯК-МСК, не облегчают лечение волчаночного нефрита. Следовательно, функция и основной механизм этой подгруппы в терапии МСК при заболеваниях остаются неизвестными. Необходимо изолировать и дополнительно исследовать МСК свысокимуровнем MFGE8 BAMBI с точки зрения их фенотипа, метаболизма и функции, чтобы полностью понять природу этой подгруппы МСК. В этом протоколе мы подробно описываем метод выделениясубпопуляции BAMBIс высоким уровнемMFGE8 от UC-MSC человека. Субпопуляция UC-MSCs мечется двумя поверхностными маркерами, BAMBI и MFGE8, с помощью сортировки проточной цитометрией. Выделенные клетки культивируются и верифицируются с помощью анализа проточной цитометрии. Специфические гены, экспрессируемые в МСК свысокимуровнем MFGE8 BAMBI, идентифицируются с помощью ОТ-кПЦР. Этот протокол приводит к высокоэффективной и чистой сортировке клеток и описывает маркерные профили BAMBIс высоким MFGE8и высоким уровнем UC-MSCs.
Введение
Мезенхимальные стромальные/стволовые клетки человека (МСК) являются соматическими предшественниками, способными дифференцироваться в остеоциты, адипоциты, хондроциты и другие типы клеток1. МСК были впервые выделены из костного мозга и широко распространены из пуповины, жировой ткани и других тканей2. Поскольку ЯК-МСК легко получают и проявляют низкую иммуногенность и иммуносупрессивное действие, они широко применяются в клинических испытаниях для лечения различных заболеваний 3,4,5. Несмотря на то, что терапия МСК демонстрирует многообещающий потенциал в лечении заболеваний, терапевтические эффекты неодинаковы у разных людей6. Однако причина нестабильности терапии МСК до сих пор неясна.
Молекулярные флуктуации, морфология, дифференцировочная способность и терапевтическая функция составляют гетерогенность МСК. В некоторых исследованиях также постулируется, что МСК представляют собой субпопуляции с различными функциями 7,8, и изучается гетерогенность МСК с помощью секвенирования РНК одиночных клеток (scRNA-seq)9,10. Результаты показали, что ЯК-МСК человека имеют различные субпопуляции со специфическими транскриптомными особенностями, в то время как в немногих исследованиях были успешно выделены так называемые субпопуляции МСК. Ранее мы препарировали человеческие UC-MSC на три подгруппы в соответствии с их сигнатурами с помощью scRNA-seq и биоинформатического анализа, в котором субпопуляция BAMBIс высоким MFGE8и высоким уровнем UC-MSC была дополнительно очищена ифункционально протестирована. Тем не менее, этой подгруппе не удалось облегчить волчаночный нефрит. Таким образом, необходимо проверить терапевтические эффектыМСК с высокимMFGE8 BAMBI при других расстройствах, чтобы понять их подлинные функции.
В этом протоколе описаны методы выделенияподгруппы высокого уровняMFGE8 BAMBI из МСК человека с помощью сортировки клеток, активируемой флуоресценцией (FACS) с помощью проточной цитометрии, а такжехарактеристики подгруппы высокого уровня MFGE8 свысокимуровнем BAMBI.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Это исследование было проведено в соответствии с принципами, изложенными в Хельсинкской декларации 1989 года и одобренными Комитетом по этике в аффилированной больнице Drum Tower Медицинской школы Нанкинского университета (номер одобрения: 202019701). Человеческие пуповины были получены от здоровых матерей в больнице Аффилированной башни Драм Тауэр Медицинской школы Нанкинского университета после естественных родов, которые дали свое информированное согласие на их использование в этой работе. Первичные ЯК-МСК были выделены из пуповины человека, как сообщалось ранее11.
1. Бактериологическое исследование и идентификация ЯК-МСК перед изоляцией
- Как только МСК достигнут 70-80% конфлюенции (P0), промойте клетки PBS один раз и добавьте 1 мл 0,25% трипсина-ЭДТА в течение 2 минут при 37 °C. Затем добавьте 9 мл готовой среды для нейтрализации трипсина, перенесите клеточную суспензию в центрифужную пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте при 300 × г в течение 5 минут для сбора клеток. Выбросьте надосадочную жидкость и добавьте соответствующую полноценную среду для ресуспендирования клеток. Перенесите клетки из каждой чашки в три колбы T75 (P1) и культивируйте в клеточном инкубаторе при 37 °C и 5%CO2.
- После 2-кратного пассирования UC-MSCs с помощью трипсинизации, в точке P3, соберите клетки с помощью тех же этапов, которые описаны в шаге 1.1. После центрифугирования выбросьте надосадочную жидкость. Повторно суспендируйте клетки в буфере для окрашивания FACS (1x PBS, содержащий 2% FBS) и подсчитайте их. Добавьте окрашивающий буфер FACS до конечной концентрации 5-10 ×10 6 клеток/мл и держите клеточную суспензию на льду.
- Распределите по 100 мкл на пробирку этой клеточной суспензии в разные пробирки по 1,5 мл. Добавьте контроль изотипа и антитела FACS против CD29, CD73, CD90, CD105, CD14, CD34, CD45, CD79 и HLA-DR (все в соотношении 1:200) в клетки при 4 °C в течение 30 минут.
- Промойте ячейки 2 раза с помощью буфера для окрашивания FACS и центрифугируйте при 300 × г в течение 5 минут. Отбраковать надосадочную жидкость и ресуспендировать преципитаты в 200 мкл окрашивающего буфера FACS для анализа проточной цитометрии с целью выявления маркеров МСК.
2. Выделение BAMBIс высоким уровнем MFGE8и высоким уровнем UC-MSCs методом проточной цитометрии
- Культивирование UC-MSC до плотности примерно 5-10 × 106 клеток при выделенииBAMBI с высоким MFGE8высоким UC-MSCs. Диссоциируйте клетки 0,5 мМ ЭДТА в течение 5 мин до тех пор, пока они не начнут иметь круглую морфологию, добавьте всю среду для переноса клеток в коническую трубку объемом 15 мл и несколько раз пипетируйте клеточную суспензию вверх и вниз для получения одноклеточной суспензии. Используйте 10 мкл клеточной суспензии для подсчета клеток и расчета общего количества собранных клеток. Центрифугируйте коническую пробирку с клеточной суспензией при 300 × г в течение 5 мин для сбора клеток.
- Ресуспендируйте клетки в 1 мл полной среды до конечной концентрации 5-10 ×10 6 клеток/мл и держите клеточную суспензию на льду.
- Разделите ячейки на четыре микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл (только пустые ячейки; BAMBI-меченые клетки; MFGE8-меченые клетки; и клетки, меченные BAMBI и MFGE8).
- Добавьте первичные антитела в соответствующих концентрациях (MFGE8 и BAMBI, оба в соотношении 1:100) в пробирки, перемешайте и инкубируйте клетки при комнатной температуре в течение 15 минут.
- Промойте помеченные клетки один раз 1x PBS и центрифугируйте при 300×г в течение 5 минут. Выбросьте надосадочную жидкость. Ресуспендируйте клетки в 1 мл готовой среды, добавьте в клетки конъюгированные флуоресцентные вторичные антитела (козий антикроличий IgG H&L Alexa Fluor 488 и Alexa Fluor 647, все в концентрации 1: 1000), перемешайте и инкубируйте клетки при комнатной температуре в течение 15 минут в темноте.
- Промойте помеченные ячейки один раз с помощью 1x PBS, как описано в шаге 2.5. Ресуспендируйте клетки в 500 мкл готовой среды, отфильтруйте через клеточный фильтр 70 мкм для удаления комков и мусора и перенесите фильтрат в пробирку объемом 15 мл для сортировки проточной цитометрии.
- Запустите пробирку с пустыми клетками без добавления антител (отрицательный контроль) и отрегулируйте прямое рассеяние (FSC) и боковое рассеяние (SSC), чтобы увеличить масштаб отрицательной популяции с помощью окрашивания антителами.
- Запустите клеточные пробирки, меченные одним антителом (например, MFGE8 + козий антикролиацкий IgG H&L Alexa Fluor 488 или BAMBI + козий антикролик IgG H&L Alexa Fluor 647) в качестве контроля стробирования, чтобы определить, где начинается положительный результат на участке.
- Запустите пробирку с экспериментальным образцом для сортировки и сбора популяцииклеток с высоким уровнемMFGE8 BAMBI.
- ОтсортированныеМСК BAMBIс высоким содержаниемMFGE8 в 24-луночный планшет и культивируйте клетки в клеточном инкубаторе при 37 °C и 5%CO2.
- Когда отсортированныеМСК BAMBIс высоким уровнемMFGE8 выросли в течение двух пассажей для получения достаточного количества клеток, диссоциируйте клетки и проведите постсортировочный анализ, чтобы обеспечить чистоту отсортированных клеточных популяций с помощью проточной цитометрии, как описано в шагах 2.1-2.9. В качестве альтернативы можно исследовать чистоту отсортированных клеток с помощью обычной иммунофлюоресценции против экспрессии BAMBI человека и MFGE8, если количество собранных клеток слишком мало.
3. Характеристикавысоких МСК BAMBIMFGE8
- Выращивайте отсортированные МСК свысоким содержаниемMFGE8BAMBI в 12-луночном планшете, изучайте их клеточную морфологию под микроскопом и сравнивайте ее с морфологией несортированных МСК.
ПРИМЕЧАНИЕ: В целом, клетки свысоким содержаниемMFGE8 BAMBI растут быстрее, чем несортированные UC-МСК. - Когда клетки слились примерно на 90% в 12-луночном планшете, аспирируйте среду для культивирования клеток, промойте клетки один раз 1x PBS и добавьте в клетки 500 мкл реагента для экстракции РНК. Медленно встряхивайте тарелку при комнатной температуре (RT) в течение 5 минут.
- Пипеткой нанесите смесь и переложите ее в пробирку, не содержащую РНКазы и ДНКазы. Добавьте 100 μл хлороформа, закройте пробирку крышкой и энергично встряхивайте смесь, вортексируя в течение 15 с. Затем дайте трубке постоять при температуре RT в течение 3 минут.
- Центрифугируйте пробирку в течение 15 минут при 11 000 × г и 4 °C.
- Перелейте примерно 200 мкл верхнего водного слоя в новую пробирку. Добавьте одинаковый объем изопропанола и тщательно пипеткой вверх и вниз несколько раз. Затем дайте смеси постоять при RT в течение 10 минут.
- Центрифугируйте в течение 15 минут при 11 000 × g и 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость.
- Добавьте 500 μL 75% этанола в гранулу в пробирке и осторожно переверните трубку несколько раз.
- Центрифугируйте пробирку в течение 5 минут при 6 000 × g и 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость. Повторите центрифугирование один раз в течение 10 с при 6 000 × g, осторожно отасуньте оставшуюся жидкость с помощью пипетки и высушите пробирку при RT.
- Добавьте 10 мкл воды, не содержащей РНКазы, чтобы растворить гранулу РНК, и измерьте концентрацию РНК с помощью спектрофотометра.
- Следуйте инструкциям производителя для синтеза кДНК первой цепи из общего количества РНК до 1 мкг.
- Используйте набор для количественной ПЦР для обнаружения и количественной оценки экспрессии генов в соответствии с инструкциями производителя.
ПРИМЕЧАНИЕ: Последовательности используемых ДНК-праймеров перечислены в Таблице 1.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
На рисунке 1 показаны профили экспрессии маркеров клеточной поверхности ЯК-МСК человека. Культивируемые МСК были сильно положительными в отношении экспрессии CD44, CD73, CD90 и CD105 и отрицательными в отношении экспрессии CD14, CD34, CD45, CD79 и HLA-DR. МСК свысоким уровнемMFGE8 BAMBI сортировали из культивируемых UC-MSC человека, а их экспрессию BAMBI и MFGE8 повторно анализировали с помощью проточной цитометрии после расширения на 3-4 пассажа (р...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В этом протоколе описывается, как изолировать и обогатить субпопуляцию BAMBIс высоким уровнемMFGE8 из UC-MSC человека. Метод важен для дальнейшего изучения морфологии, роста и функции этой подгруппы МСК. Некоторые этапы жизненно важны для успешной изоляции иполучения высоких клеток BAMBIс высоким содержаниемMFGE8.
Во-первых, наиболее важным техническим аспектом, который следует учитывать, является использование соотв...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.
Благодарности
Работа выполнена при поддержке Национального фонда естественных наук Китая (грант No 82271843).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 0,6 мл микроцентрифужная пробирка | Corning | Axygen MCT-060-A | |
| 1,5 мл микроцентрифужные пробирки | Beijing Labgic Technology | MCT-001-150 | |
| 100 мм чашка для клеточных культур | Beijing Labgic Technology | 12311 | |
| 12-луночная пластина | Beijing Labgic Technology | 11210 | |
| 15 мл центрифужная трубка | Nanjing Vazyme Material Technology | TCF00115 | |
| 24-луночная пластина | Beijing Labgic Technology | 11310 | |
| 50 мл центрифужная трубка | Nanjing Vazyme Material Technology | TCF00150 | |
| 5 мл Трубки с круглым дном | Corning | FALCON 352003 | |
| 70 μ m клеточный фильтр | Falcon | 352350 | Разведение: 1:1000 |
| APC античеловеческий CD79a (Igα) Антитело | BioLegend | 333505 | 581 Разведение: 1:200 |
| APC/Cyanine7 против человеческого CD73 (экто-5'-нуклеотидазы) Антитело | BioLegend | 344022 | G46-6 Разведение: 1:200 |
| APC-Cy7 Мышь IgG1, κ Контроль изотипа | BD Bioscience | 557873 | MOPC-31C (контроль изотипа) Разведение: 1:200 |
| Антитело BAMBI | Bioss | bs-12418R | |
| Brilliant Violet 510 антимышиное/человеческое антитело CD44 | BioLegend | 103044 | 5E10 Разведение: 1:200 |
| Brilliant Violet 510 Крыса IgG2b, κ Isotype Ctrl Антитело | BioLegend | 400646 | MOPC-21 (контроль изотипа) Разведение: 1:200 |
| CD105 (эндоглин) моноклональное антитело APC | eBioscience | 17-1057-42 | HM47 Разведение: 1:200 |
| Камера подсчета клеток Слайды | Шанхайская центрифуга QIUJING | XB-K-25 | |
| Пекин | BAIYANG | BY-320C | |
| ChamQ Универсальная SYBR qPCR Master Mix | Vazyme | Q711-02 | |
| Хлороформ | XILONG Scientific | 13700908 | |
| DMEM/F-12 (1:1) базовый (1x) | Gibco | C11330500BT | |
| ЭДТА (0,5 М), pH 8,0, свободный от РНАЗы | Инвитроген | AM9260G | Разведение: 1:1000 |
| этанола | XILONG Scientific | 12803405 | |
| Фетальная сыворотка крупного рогатого скота (FBS) | Gibco | 10099-141C | |
| FITC Мышиный античеловеческий CD34 | BD Bioscience | 555821 | IM7 Разведение: 1:200 |
| FITC Мышиный античеловеческий CD45 | BD Bioscience | 555482 | AD2 Разведение: 1:200 |
| FITC Мышиный античеловеческий HLA-DR | BD Bioscience | 555811 | SN6 Разведение: 1:200 |
| Проточный цитометр | BD Bioscience | FACSAria™ III Сортировщик клетокAria | |
| Flowjo | BD Bioscience | V10 | |
| Щадящий реагент для диссоциации клеток | STEMCELL Technologies | 100-0485 | |
| Козий антимышиный IgG H& L (Alexa Fluor 488) | abcam | ab150113 | HI30 Разведение: 1:200 |
| Goat Anti-Rabbit IgG H& L (AlexaFluor 594) | abcam | ab150080 | Разведение: 1:1000 |
| HiScript II Q RT SuperMix для qPCR (+gDNA wiper) | Vazyme | R223-01 | |
| Инвертированные микроскопы | Nikon | ECLIPSE Ts2 | |
| Изопропиловый спирт | XILONG Scientific | 12802505 | |
| MFGE8 антитело | Biorbyt | orb388429 | Разведение: 1:100 |
| Микроцентрифуга | Thermo Fisher Scientific | FRESCO 21 | |
| мышь IgG1 каппа контроль изотипа APC | eBioscience | 17-4714-42 | P3.6.2.8.1 (контроль изотипа) Разведение: 1:200 |
| мышь IgG1 каппа контроль изотипа FITC | eBioscience | 11-4714-42 | eBMG2b (контроль изотипа) Разведение: 1:200 |
| мышь IgG2b каппа контроль изотипа FITC | eBioscience | 11-4732-42 | RTK4530 (контроль изотипа) Разведение: 1:200 |
| PBS (10x) | Sangon Biotech (Shanghai) | E607016-0500 | |
| PE-Cy5 Мышиный античеловеческий CD90 | BD Bioscience | 555597 | P3.6.2.8.1 (контроль изотипа) Разведение: 1:200 |
| PE-Cy5 мышь IgG1 κ Контроль изотипа | BD Bioscience | 550618 | |
| пенициллин-стрептомицин 100x | Цитива | SV30010 | Разведение: 1:100 |
| Система ПЦР в реальном времени | Applied Biosystems byThermo Fisher Scientific | Q6 | |
| РНКаза вода без РНКаза | QIAGEN | 129112 | |
| спектрофотометр | Thermo Fisher Scientific | NanoDrop One(840-317400) | |
| Стерильные наконечники для микропипеток | Beijing Labgic Technology | Разведение: 1:100 | |
| T75 колба для клеточных культур | Beijing Labgic Technology | 13212A | |
| Термоамплификатор | Applied Biosystems byThermo Fisher Scientific | Veriti | |
| Tri реагент | Sigma Aldrich | T9424 | |
| Typsin-EDTA Solution | Bio-Channel Biotechnology | BC-CE-005 | |
| CO2 Инкубатор | Thermo Fisher Scientific | 3111 |
Ссылки
- Liechty, K. W., et al. Human mesenchymal stem cells engraft and demonstrate site-specific differentiation after in utero transplantation in sheep. Nat Med. 6 (11), 1282-1286 (2000).
- Zhou, T., et al. Challenges and advances in clinical applications of mesenchymal stromal cells. J Hematol Oncol. 14 (1), 24(2021).
- Xie, Z., et al. Tnf-alpha-mediated m(6)a modification of elmo1 triggers directional migration of mesenchymal stem cell in ankylosing spondylitis. Nat Commun. 12 (1), 5373(2021).
- Mcguire, J. J., et al. Mesenchymal stem cell-derived interleukin-28 drives the selection of apoptosis resistant bone metastatic prostate cancer. Nat Commun. 12 (1), 723(2021).
- Yuan, X., et al. Mesenchymal stem cell therapy induces flt3l and cd1c(+) dendritic cells in systemic lupus erythematosus patients. Nat Commun. 10 (1), 2498(2019).
- Wang, D., et al. Umbilical cord mesenchymal stem cell transplantation in active and refractory systemic lupus erythematosus: A multicenter clinical study. Arthritis Res Ther. 16 (2), R79(2014).
- Ortiz, L. A., et al. Mesenchymal stem cell engraftment in lung is enhanced in response to bleomycin exposure and ameliorates its fibrotic effects. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (14), 8407-8411 (2003).
- Phinney, D. G. Functional heterogeneity of mesenchymal stem cells: Implications for cell therapy. J Cell Biochem. 113 (9), 2806-2812 (2012).
- Wang, Z., et al. Single-cell transcriptome atlas of human mesenchymal stem cells exploring cellular heterogeneity. Clin Transl Med. 11 (12), e650(2021).
- Chen, P., et al. Single-cell and spatial transcriptomics decodes wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells heterogeneity and a subpopulation with wound repair signatures. Adv Sci (Weinh). 10 (4), e2204786(2023).
- Chen, H., et al. Dissecting heterogeneity reveals a unique bambi(high) mfge8(high) subpopulation of human uc-mscs. Adv Sci (Weinh). 10 (1), e2202510(2022).
- Tsuji, K., et al. Effects of different cell-detaching methods on the viability and cell surface antigen expression of synovial mesenchymal stem cells. Cell Transplant. 26 (6), 1089-1102 (2017).
- Lai, T. Y., et al. Different methods of detaching adherent cells and their effects on the cell surface expression of fas receptor and fas ligand. Sci Rep. 12 (1), 5713(2022).
- Avinash, K., Malaippan, S., Dooraiswamy, J. N. Methods of isolation and characterization of stem cells from different regions of oral cavity using markers: A systematic review. Int J Stem Cells. 10 (1), 12-20 (2017).
- Galvao, I., et al. Rock inhibition drives resolution of acute inflammation by enhancing neutrophil apoptosis. Cells. 8 (9), 964(2019).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
