Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Хирургическое удаление сложного органа чувств при высокорегенеративных гребневищах

830 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/67546

⸱

8 августа 2025 г.

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, New Jersey Institute of Technology

В этой статье

Краткое содержание

Мы описываем простой протокол удаления статоцисты и связанных с ней тканей у гребневика Mnemiopsis leidyi, который поддается визуализации в реальном времени.

Аннотация

Гребневик Mnemiopsis leidyi является классической животной моделью регенерации всего тела. Повышенная пластичность многих лабораторных методов и их филогенетическое размещение в качестве вероятной сестринской группы для оставшихся Metazoa привели к недавнему возобновлению научного интереса к работе с гребневыми гребнями. Они могут регенерировать любой отсутствующий орган или тип клеток, включая полную регенерацию всего тела из фрагмента размером ~15% тела, в течение нескольких дней. Как и у большинства гребневиков, у M. leidyi есть аборально расположенный гравитационный чувствительный орган, который связывает сенсорный вход с моторным выходом для контроля положения и ориентации тела. Этот протокол демонстрирует хирургическое удаление комплекса аборальных органов (АО) и связанных с ним структур у M. leidyi , а также методы культивирования, обработки и монтажа, подходящие для визуализации процессов заживления и регенерации ран, которые происходят в последующие часы или дни. Эти простые методы в целом адаптируются к различным экспериментальным парадигмам и лабораторным контекстам.

Введение

Гребневики, также известные как гребенчатые медузы, космополитичны морской среде Земли и могут быть основными игроками в экосистемах, особенно как часть пищевой цепи. Гребневик Mnemiopsis leidyi является исторической и все более популярной животной моделью регенерации всего тела 1,2. Их способность к регенерации любого отсутствующего органа или типа клеток возникает к концу эмбриогенеза и сохраняется на протяжении всей постэмбриональной жизни 3,4 (~ от 0,1 до > 1000 мм по размеру тела). Они также прозрачны на протяжении всего срока службы и поддаются различным методам визуализации в реальном времени и стационарной визуализации. Самый последний общий предок всех гребневиков имел множество типов клеток и сложных органов; Большинство современных гребневиков обладают большинством из них, по крайней мере, на одной стадии жизни: аборальным, чувствительным к гравитации органом (исторически называемым апикальным органом, а здесь – аборальным органом, АО), специализированными локомоторными структурами, состоящими из высокоорганизованных макроцилий, которые бьются скоординированным образом (гребневые ряды), втягивающимися питательными щупальцами и фотоцитами, которые биолюминесцируют в ответ на вредные стимулы (рис. 1).

Несмотря на их многочисленные типы клеток и сложное, зависящее от контекста поведение, надежный массив геномных данных поддерживает положение гребневиков как вероятной сестринской группы для всех других живых животных 5,6,7,8. Существенные отличия клеточной и функциональной основы гребневой нервной системы от других животных, обладающих нервной системой (билатерий и книдарий), позволяют выдвинуть гипотезу о том, что гребневая нервная система имеет самостоятельное происхождение; Тем не менее, это остается неопределенным 9,10,11,12.

Комплекс органов чувственного контроля аборальной зоны включает в себя статоцисту, которая включает в себя многие типы клеток, в том числе несколько типов предполагаемых нейросенсорных клеток 13,14,15,16,17,18, и находится под постоянным содержанием в неманипулируемых гребневых копьях. Механосенсорные клетки несут большие цилиарные пучки, которые отклоняются статолитом, состоящим из биоминерализованных клеток (называемых литоцитами) для обнаружения гравитации. Два «полярных поля», которые содержат предполагаемые сенсорные структуры с неизвестной функцией14 и вероятные фотосенсорные клетки16, примыкают к статоцисте.

Экспериментальное исследование регенеративной способности M. leidyi охватило самых мелких животных на этапе перехода от эмбриона к вылуплению (~100 мкм) до свободно живущих макроскопических взрослых особей (>2 см). M. leidyi диаметром тела ~1 мм достаточно велики, чтобы их можно было проводить ручные хирургические манипуляции без специальных инструментов, таких как микроманипуляторы, но достаточно малы, чтобы их можно было установить на стандартное предметное стекло микроскопа для визуализации с помощью мощных объективов. Этот протокол демонстрирует хирургическое удаление аборального органа чувств и связанных с ним структур, а также методы культивирования и визуализации, подходящие для документирования процессов заживления и регенерации ран, которые происходят в последующие часы или дни.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Подготовьте инструменты и принадлежности

  1. С помощью стандартной горелки Бунзена вручную вытяните иглы для рассечения стекла от стеклянных капиллярных микропипеток. Для животных ростом более 1 мм используйте калиброванные микропипетки из натриево-известкового стекла, предназначенные для работы с жидкостями.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Размер 100 мкл хорошо подходит для диапазона фокусных расстояний 0,5-3 мм.
    1. Установите острый синий конус пламени в горелке Бунзена.
    2. Удерживайте центральную точку стеклянной пипетки в пламени, пока она не станет достаточно мягкой, чтобы двигаться под легким давлением.
    3. Снимите пипетку с пламени и сразу же раздвиньте две стороны, чтобы получилась короткая и прочная игла.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Стеклянная игла может быть переплавлена, если удовлетворительный результат не был получен с первой попытки, а сломанные иглы могут быть сохранены и вытянуты повторно. На рисунке 2 приведены примеры пригодных и непригодных для использования игл, вытягиваемых этим методом.
      АЛЬТЕРНАТИВА: Иглы 26 G 1/2 дюйма также хорошо работают, особенно на большем конце диапазона фокусных размеров.
  2. Приготовьте стерильную морскую воду, пропустив естественную или искусственную морскую воду через фильтр 0,22 мкм.
  3. Создание измерительных пипеток.
    1. С помощью острых ножниц или бритвенного лезвия вырежьте пластиковую переводную пипетку, чтобы получить отверстие с внутренним диаметром желаемого размера. Держите наготове по крайней мере одну пипетку для верхней части желаемого диапазона и одну для нижней части нужного диапазона. На рисунке 3 приведен пример набора измерительных пипеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эти пипетки хорошо работают до ~8 мм. Также есть возможность оценить размер с помощью микрометра или измерительных приборов по фотографиям.

2. Подготовьте животных к эксперименту

  1. Отбирайте морфологически нормальных особей нужного размера и стадии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мы считаем, что животные диаметром ~0,5-3 мм являются оптимальными для установки на горках. Убедитесь, что животные не помещаются в пипетку нижнего размера, но удобно помещаются в пипетку верхнего размера.
  2. Подопытных животных морить голодом в течение 8-16 ч.
    Примечание: В то время как M. leidyi оптически прозрачны и не обладают высокой автофлуоресцентностью, пища, циркулирующая через их пищеварительную систему, обычно непрозрачна и часто автофлуоресцентна.

3. Выполнение резов

  1. Используйте передаточную пипетку шире, чем размер тела подопытного животного, чтобы перенести ее в 35-миллиметровую полистирольную чашку, содержащую стерильную морскую воду.
  2. Визуализируйте образец с помощью препарирующего микроскопа. Переверните одно животное на его пищеводную сторону (рисунок 1). Такой вид дает самый легкий доступ для удаления аборального органа. Сосредоточьтесь на аборальном органе.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Наиболее полезное увеличение может варьироваться в зависимости от размера животного и предпочтений пользователя. В целом 12-20-кратное увеличение работает хорошо.
  3. Аккуратно удерживайте животное на месте одной стеклянной иглой с помощью недоминирующей руки.
  4. Доминирующей рукой введите кончик иглы немного ниже аборального органа. Введите наискось, чтобы сделать один надрез от одного видимого края аборального органа ниже его основания. Извлеките иглу и сделайте второй надрез, чтобы удалить клиновидный кусок ткани, содержащий все структуры аборального органа (см. рисунок 4, верхняя панель). Внимательно осмотрите животное и иссеченные ткани, чтобы убедиться, что операция прошла успешно.
  5. Используйте ту же передаточную пипетку, чтобы переместить только что разрезанное животное в свежую посуду со стерильной морской водой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рана будет быстро закрываться, поэтому в зависимости от целей эксперимента (например, для получения нескольких синхронно регенерирующих образцов или для визуализации ранних стадий заживления и регенерации), необходимо действовать быстро, чтобы получить несколько образцов. Используйте таймер, чтобы ограничить время хирургического вмешательства, чтобы когорты регенерирующих животных находились ближе друг к другу.

4. Проверьте правильность разрезов

ПРИМЕЧАНИЕ: Даже при тщательной проверке под вскрывающим микроскопом иногда можно пропустить хирургические ошибки.

  1. Следуйте приведенным ниже инструкциям по монтажу, чтобы временно установить каждого послеоперационного пациента на предметное стекло, чтобы проверить под составным микроскопом с DIC, что все предполагаемые структуры были правильно удалены. Выполняйте эту проверку, даже если в настоящее время не проводите дальнейшую визуализацию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Превосходные заживляющие способности гребневиков хорошо подходят для экспериментов по прививке; Мы всегда удаляем вырезанные органы аборальной системы из сосуда для культивирования, чтобы предотвратить возможность того, что разрезанные стороны удаленного АО и остальная часть животного, из которого он был удален, могут слипнуться и срастись.
    Если вы не приступаете непосредственно к долговременной визуализации, не запечатывайте предметное стекло. Это будет способствовать быстрому выздоровлению и возвращению к культуре этого подопытного животного. Рекомендуется проверять хирургическую точность при большом увеличении. В частности, статолит может быть выбит из купола без завершения операции.

5. Живая визуализация

  1. Установка
    1. Обработайте стандартное предметное стекло микроскопа силанизатором, например, водоотталкивающим средством для обработки стекла, и дайте ему полностью высохнуть.
    2. Переложите одно послеоперационное животное на подготовленное предметное стекло с помощью передаточной пипетки. Убедитесь, что вода стекает вместе с животным внутри.
    3. Нанесите небольшое количество пластилина (~1,5 мг) на каждый угол покровного стекла, чтобы образовались «ноги», которые будут служить прокладкой для поднятия покровного стекла от животного.
    4. Аккуратно положите покровное стекло, глиняным пухом, поверх животного. Удерживая каждый угол покровного стекла, сверните животное в положение для визуализации. Надавите, чтобы слегка сжать животное, удерживая его на месте. Переместите образец настолько, насколько это необходимо, чтобы получить удовлетворительный обзор.
    5. Для получения изображений продолжительностью более ~30 минут нанесите тонкий слой вазелина на каждый край покровного стекла, чтобы предотвратить высыхание образца.
      Примечание: M. leidyi, установленный таким образом, может быть легко восстановлен для дальнейшего культивирования или других анализов. Тем не менее, животные, как правило, освобождаются и меняют свое положение в течение 1-2 часов, поэтому непрерывная покадровая съемка продолжительностью более 2 часов потребует другого подхода к визуализации.

6. Культивирование

  1. Условия культивирования цидиппид
    1. Культивирование хирургически манипулируемых животных и контрольных животных в отфильтрованной естественной или искусственной морской воде температурой близкой к комнатной. Используйте инкубатор, настроенный на 20-22 °C, чтобы обеспечить стабильные результаты.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

M . leidyi цидиппидной стадии обычно завершает закрытие раны в течение ~20 минут после травмы (Рисунок 4 и Рисунок 5), в то время как полная регенерация органа может занять 1-3 дня. Это время имеет некоторую биологическую изменчивость, но почти всегда завершается к 72 ч после операции (Рисунок 6).

Хирургическое удаление клеток и мезоклеи из комплекса органов аборальной железы и близлежащих тканей...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Подобные эксперименты могут быть проведены на любом желаемом размере M. leidyi; Морфогенез органа завершается одновременно с наступлением регенеративной способности4. Животные могут быть собраны в дикой природе19 или выращены в лаборатории20,21. Если требуется определенный размер тела, животным можно позволить нереститься, а потомство вырастить до желаемого размера. Размер ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Благодарности

Авторы с благодарностью выражают признательность Джовите Джозеф.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,2 μ m Шприцевой фильтр SFCAТермо/Налген723-2520Создание стерильной морской воды
Чашка Петри из полистирола 35 ммСокол/Корнинг351008выполнять монтажи; Выращивание мелких животных
Одноразовый шприц с люэровским замком объемом 60 млПоставки BHBH60LLСоздание стерильной морской воды
Калиброванные стеклянные пипетки, 100 мкм; LДраммонд2-000-100Выполнение резов
чехолы, #1.5, 18 мм квадратВВР16004-326Крепление для визуализации
гребневикиОбразцы из Персидского заливаживые животные
Направляющие с двойным полостью и углублением стекла, 1,3 ммВВР470200-930Крепление для визуализации
предметные стекла для микроскопаВВР16004-398Крепление для визуализации
Растворимая морская сольМгновенный океанСреда для культивирования животных
мини линейкаТед Пелла13623Измерьте пластиковые пипетки
пластилин для лепки (пластилин)Пепи ПластилинаКрепление для визуализации
Желе из вазелинаВазелинКрепление для визуализации
пластиковые переводные пипетки (разные размеры)Коул-Пармер06226-13, 06226-12, 06226-01перемещать мелких животных
Обработка стекла Rain-XДождь-ХПредметные стекла для микроскопа Silanize
линейкаУэсткотт10564Измерьте пластиковые пипетки
ножницыОХСВырезанные пластиковые пипетки

Ссылки

  1. Edgar, A., Mitchell, D. G., Martindale, M. Q. Whole-body regeneration in the lobate ctenophore Mnemiopsis leidyi. Genes. 12 (6), 867(2021).
  2. Martindale, M. Q., Henry, J. Q. Ctenophora. Evolutionary Developmental Biology of Invertebrates 1. , Springer. 179-201 (2015).
  3. Martindale, M. Q. The onset of regenerative properties in ctenophores. Curr Opin Genet Dev. 40, 113-119 (2016).
  4. Martindale, M. Q. The ontogeny and maintenance of adult symmetry properties in the ctenophore, Mnemiopsis mccradyi. Dev Biol. 118 (2), 556-576 (1986).
  5. Dunn, C. W., et al. Broad phylogenomic sampling improves resolution of the animal tree of life. Nature. 452 (7188), 745-749 (2008).
  6. Ryan, J. F., et al. The genome of the ctenophore Mnemiopsis leidyi and its implications for cell type evolution. Science. 342 (6164), 1242592-1242592 (2013).
  7. Whelan, N. V., et al. Ctenophore relationships and their placement as the sister group to all other animals. Nat Ecol Evol. 1 (11), 1737-1746 (2017).
  8. Schultz, D. T., et al. Ancient gene linkages support ctenophores as sister to other animals. Nature. 618, 110-117 (2023).
  9. Burkhardt, P. Ctenophores and the evolutionary origin(s) of neurons. Trends Neurosci. 45 (12), 878-880 (2022).
  10. Sachkova, M. Y., et al. Neuropeptide repertoire and 3D anatomy of the ctenophore nervous system. Curr Biol. 31 (23), 5274-5285.e6 (2021).
  11. Moroz, L. L., et al. The ctenophore genome and the evolutionary origins of neural systems. Nature. 510 (7503), 109-114 (2014).
  12. Burkhardt, P., et al. Syncytial nerve net in a ctenophore adds insights on the evolution of nervous systems. Science. 380 (6642), 293-297 (2023).
  13. Tamm, S. L., Tamm, S. Novel bridge of axon-like processes of epithelial cells in the aboral sense organ of ctenophores. J Morphol. 254 (2), 99-120 (2002).
  14. Jager, M., et al. New insights on ctenophore neural anatomy: Immunofluorescence study in Pleurobrachia pileus (Müller, 1776). J Exp Zool B Mol Dev Evol. 316B (3), 171-187 (2011).
  15. Hernandez-Nicaise, M. -L. The nervous system of ctenophores III. Ultrastructure of synapses. J Neurocytol. 2 (3), 249-263 (1973).
  16. Schnitzler, C. E., et al. Genomic organization, evolution, and expression of photoprotein and opsin genes in Mnemiopsis leidyi: a new view of ctenophore photocytes. BMC Biol. 10 (1), 107(2012).
  17. Harrison, F. W., Westfall, J. A. Ctenophora. Microscopic Anatomy of Invertebrates. 2: Placozoa, Porifera, Cnidaria, and Ctenophora. , Wiley. New York. 359-418 (1991).
  18. Horridge, G. A. Presumed photoreceptive cilia in a ctenophore. J Cell Sci. S3-105 (71), 311-317 (1964).
  19. Ramon-Mateu, J., Edgar, A., Mitchell, D., Martindale, M. Q. Experimental methods to study ctenophore whole-body regeneration. Methods Mol Biol. 2450, 95-119 (2022).
  20. Soto-Àngel, J. J., et al. Stable laboratory culture system for the ctenophore Mnemiopsis leidyi. Methods Mol Biol. 2757, 123-145 (2022).
  21. Presnell, J. S., Bubel, M., Knowles, T., Patry, W., Browne, W. E. Multigenerational laboratory culture of pelagic ctenophores and CRISPR-Cas9 genome editing in the lobate Mnemiopsis leidyi. Nat Protoc. 17 (8), 1868-1900 (2022).
  22. Coonfield, B. R. Apical dominance and polarity in Mnemiopsis leidyi, Agassiz. Biol Bull. 70 (3), 460-471 (1936).
  23. Freeman, G. Studies on regeneration in the creeping ctenophore, Vallicula multiformis. J Morphol. 123, 71-84 (1967).
  24. Bading, K. T., Kaehlert, S., Chi, X., Jaspers, C., Martindale, M. Q., Javidpour, J. Food availability drives plastic self-repair response in a basal metazoan-case study on the ctenophore Mnemiopsis leidyi A. Agassiz. Sci Rep. 7 (1), 16419(2017).
  25. Mateu, J. R., Ellison, S. T., Angelini, T. E., Martindale, M. Q. Regeneration in the ctenophore Mnemiopsis leidyi occurs in the absence of a blastema, requires cell division, and is temporally separable from wound healing. BMC Biol. 17 (1), 80(2019).
  26. Mitchell, D. G., Edgar, A., Mateu, J. R., Ryan, J. F., Martindale, M. Q. The ctenophore Mnemiopsis leidyi deploys a rapid injury response dating back to the last common animal ancestor. Commun Biol. 7 (1), 203(2024).
  27. Jokura, K., Anttonen, T., Rodriguez-Santiago, M., Arenas, O. M. Rapid physiological integration of fused ctenophores. Curr Biol. 34 (19), R889-R890 (2024).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Mnemiopsis leidyi
Хирургическое удаление сложного органа чувств при высокорегенеративных гребневищах
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.