Method Article

Эффективный метод визуализации легких мышей, сохраняющий пространственную динамику грибковых спор в дыхательных путях

DOI:

10.3791/67556

⸱

December 13th, 2024

 ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, New Jersey Medical School, Rutgers - The State University of New Jersey

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы представляем метод модели патогенеза грибов, который сохраняет естественное расположение спор грибов в дыхательных путях легких для анализа с помощью флуоресцентной микроскопии.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Грибки заражают человека при вдыхании спор окружающей среды в легкие. Легкое – неоднородный орган. Проводящие дыхательные пути, в том числе бронхи и бронхиолы, разветвляются до тех пор, пока не заканчиваются в альвеолярном воздушном пространстве, где происходит газообмен. Инфекции, возникающие в бронхиолах или альвеолах, вызывают различные реакции хозяина и проявления болезни. Таким образом, точное понимание того, где споры естественным образом локализуются в легких, особенно вскоре после заражения, расширяет возможности для исследования взаимодействий хозяина и патогена. В данной работе мы подробно описываем анализ in situ легких мышей, инфицированных Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3Δ arthroconidia. Традиционные методы гистологической консервации включают жидкостное надувание дыхательных путей с помощью фиксирующего раствора, который смещает естественное расположение аспирированных грибковых частиц, выталкивая споры из проксимальных бронхиол в терминальные воздушные пространства.

И наоборот, этот метод надувания воздуха с помощью перфузионной фиксации кровеносной сосудистой сети сохраняет физиологическое положение спор грибов в бронхиолах. Кроме того, мы описываем простой подход к криоконсервации, встраиванию и визуализации образцов легких. Мы также делимся высокопроизводительными вычислительными методами с помощью программы QuPath с открытым исходным кодом для анализа пространственного распределения спор грибов в легких. Представленный здесь метод прост и быстр, требует минимального оборудования для выполнения и может быть легко адаптирован для использования со многими моделями респираторных грибковых инфекций.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Человек может вдыхать до миллиардов спор в день из различных грибов окружающейсреды. Чтобы понять нашу барьерную защиту от этих вдыхаемых спор, мы должны оценить точную микроанатомическую среду, в которой эти споры попадают в дыхательные пути и паренхиму легких. Клеточный состав дыхательных путей (т.е. эпителиальных клеток) значительно трансформируется по ходу трахеи, бронхов, бронхиол и альвеол. Каждая из этих отдельных областей состоит из различных типов клеток с дискретными функциями, что позволяет использовать арсенал защитных механизмов для предотвращения патологической инфекции.

Точное местоположение отложения спор легочных грибков может варьироваться между просветами дыхательных путей колоннарных бронхиол, выстланных эпителием, альвеолярными протоками или альвеолами2. Большинство клинически значимых видов грибов производят споры диаметром от 1 до 10 мкм3. Отложение этих частиц спор в легких зависит от нескольких факторов, таких как аэродинамика, плотность, электрический заряд и форетические силы, которые могут влиять на механизм осаждения после вдыхания4. Как правило, крупные частицы (> 6 мкм) осаждаются в верхних дыхательных путях, частицы среднего размера (2-6 мкм) могут откладываться в более мелких дыхательных путях, а мелкие частицы (<2 мкм) достигают альвеолярной области5. Сообщалось, что споры аспергилл (2-3 мкм) достигают альвеолярных пространств, но клинические патологоанатомические отчеты также указывают на значительное бремя бронхиальной и бронхиолярной болезни6. В связи с растущей популярностью гибкойбронхоскопии также растет признание эндобронхиальных грибковых инфекций Aspergillus fumigatus, Coccidioides immitis, видов Candida, Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum и Zygomycetes. Недавние достижения в области микроскопической визуализации инфекций, вызванных аспергиллами, у мышей также показали, что более проксимальные воздушные пространства, такие как бронхи и бронхиолы, могут нести наибольшую нагрузку для патологической грибковой пролиферации8. Исследования реакции хозяина на легочные грибковые инфекции показали, что как бронхиолярные эпителиальные клетки, так и альвеолярные эпителиальные клетки играют важную роль в качестве иммунных стражей, поэтому выяснение точных мест отложения спор и взаимодействия эпителия будет иметь жизненно важное значение для будущей работы 2,9,10.

Изучение динамики патогенеза проксимальных дыхательных путей затруднено, поскольку стандартные методы фиксации легких и подготовки к разрезам могут вытеснить споры из этих проксимальных положений в эпителиально выстланных дыхательных путях и вытолкнуть их к дистальным терминальным альвеолярным областям. Как правило, 10% формалина или 4% параформальдегида используется для раздувания легких и быстрого воздействия на все легкое фиксатора. При подготовке легких к криосекции некоторые группы вводят в легкие соединение оптимальной температуры резания (ОКТ) для улучшения производительности криосекции11. Эти методы полезны в правильном контексте, но было обнаружено, что наша лаборатория и другие группы вытесняют споры и частицы из проксимальных мест, тем самым мешая интерпретации типов клеток, подвергшихся воздействию спор, ипоследующей реакции хозяина.

Для точного установления микроанатомической локализации вдыхаемых спор грибов нами разработан быстрый, малоресурсный метод сохранения локализации спор грибов в дыхательных путях мышей. Мы адаптировали метод фиксации сосудистой перфузии с надуванием воздуха у мышей от Thomas et al. (2021), в котором мы сократили количество оборудования, времени и технических навыков, необходимых для достижения удовлетворительного результата13. С помощью описанного здесь метода мы обнаружили, что артроконидии Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3Δ (размером 3-5 мкм) накапливаются проксимальнее, чем было показано ранее, а именно в дистальных бронхиолах и бронхо-альвеолярных соединениях, а не в терминальных альвеолах. Эта информация может сфокусировать биологические вопросы, касающиеся критических типов клеток, связанных с этими областями легких, и их влияния на раннюю реакцию на вдыхаемые грибковые споры.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все методы, описанные в этом протоколе, были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Rutgers Biomedical Health Sciences.

1. Маркировка спор внутриклеточной флуоресценцией

  1. Окрасьте 1 x 106 спор в карбоксифлуоресцеин сукцинимидиловый эфир (CFSE), Cell Tracker Orange или Cell Tracker Red (или внутриклеточный краситель по выбору) при 5 мкМ в течение 30 минут при 30 °C, затем промойте PBS и открутите споры при 12 000 x g. Повторите эту промывку один раз.
  2. Приготовьте споровый инокулюм в соответствующей концентрации так, чтобы 25 мкл содержал подходящую дозу спор для одной мыши.

2. Инокуляция мыши спорами путем аспирационной ингаляции с использованием изофлурановой анестезии

ВНИМАНИЕ: Изофлуран является летучим анестетиком и должен использоваться в канальном шкафу биобезопасности или вытяжном шкафу.

  1. Чтобы приготовить банку для воздействия изофлурана, положите сложенную салфетку в банку Nalgene объемом 1 л с завинчивающейся крышкой и поместите на салфетку круг из пластиковой сетки в качестве платформы для мышей. Добавьте в салфетку 2 мл изофлурана, закройте банку и подождите 1-2 минуты, пока газ уравновесится в емкости.

figure-protocol-1
Рисунок 1: Аппарат для изофлурана методом открытой капли посева спор. На дно банки объемом 1 л с завинчивающейся крышкой кладут сложенную салфетку, а затем вставляют круглую пластиковую сетку, которая служит платформой для мышей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

  1. Перед тем, как подвергнуть мышь анестезии, приготовьте пипетку с 25 мкл инокулюма. Поместите мышь в контейнер с изофлураном и наклоните контейнер, чтобы следить за потерей рефлекса выпрямления, когда мышь потеряла сознание и находится вверх ногами. Обычно это занимает около 10 секунд.
  2. Контролируйте частоту дыхания (ОР) до тех пор, пока она не замедлится до стабильных 50-80 вдохов в минуту (уд/мин), что составляет около 50% ОР в состоянии покоя. Обычно на это уходит еще 10 секунд. В это время выньте мышку из баночки с изофлураном.
    Примечание: Это высокая концентрация изофлурана, которая приведет к быстрой индукции анестезии, и за мышью необходимо очень внимательно следить. Смертельная передозировка изофлурана представляет собой риск, так как концентрация изофлурана может быть вариабельной, а кривая «доза-реакция» на изофлуран очень крутая. Если частота дыхания падает ниже 50 уд/мин и/или нерегулярна, извлеките мышь из изофлурана, дайте ей восстановиться в течение 3-5 минут и повторите попытку (максимум две повторные попытки).
  3. Подтвердите глубину анестезии отсутствием реакции на защемление пальца ноги. Затем расположите мышь в положении лежа на спине в одной руке и позвольте ей сделать 3-5 регулярных задыхающихся вдохов с возрастающей частотой (начиная с 50-60 ударов в минуту) и энергичностью. Как только это начнется, поместите кончик пипетки в заднюю часть ротоглотки мыши и выпустите инокулюм во время ингаляции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эти вздохи через рот встряхивают голову вниз из-за задействования вспомогательных мышц для дыхания. Когда пипетка вводится во время этих вздохов, рот должен открываться с каждым вздохом. Если рот не открывается, мышь недостаточно обезболечена и, скорее всего, не будет вдыхать содержимое ротоглотки. Пипетка должна надавливать на язык, проталкивая его ко дну и передней части рта, чтобы предотвратить проглатывание инокулюма. Когда пипетка находится во рту и мышь адекватно обезболивается, мышь будет открывать рот при каждом вздохе.
  4. Держа мышь рукой и большим пальцем, нащупайте хрипы на задней и передней частях грудной клетки мыши, чтобы подтвердить вдыхание инокулюма.

3. Эвтаназия мышей

  1. Введите мышке внутрибрюшинно коктейль из 200 мг/кг кетамина и 24 мг/кг ксилазина за 10 минут до момента жертвоприношения.
  2. Подождите 10 минут после инъекции, пока мышь не войдет в операционную плоскость анестезии, что подтверждается отсутствием реакции на защемление пальца ноги.

4. Перфузия легких с ПБС и формалином

  1. Опрыскайте мышь под наркозом 70% этанола. С помощью ножниц отрежьте кожу мыши и раздвиньте кожу, чтобы обнажить брюшину со всех сторон. Натяните кожу с верхней половины мыши над головой, вытягивая руки из кожи.
  2. Разрежьте перитонеальную оболочку у грудины и вдоль нижней части грудной клетки, обнажив брюшину. Сместите печень вниз, обнажив диафрагму. С помощью ножниц осторожно проколите диафрагму в сторону от паренхимы легких, чтобы избежать прокола отверстия в самих легких.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Случайное прокол легких сделает последующее надувание воздуха невозможным.
  3. После прокола диафрагмы воздух попадает в грудную клетку, разрушая легкие. Разрежьте грудную клетку с левой стороны, чтобы раскрыть сердце. Введите 5-10 мл PBS в правый желудочек с помощью иглы 30 G со скоростью 1 мл в 5 с (чтобы избежать повреждения сосудов), быстро отбеливая легкие.
    ВНИМАНИЕ: Формалин является опасным летучим веществом, с которым следует работать в канальном шкафу биобезопасности или вытяжном шкафу.
  4. По окончании извлеките иглу и с помощью новой иглы введите 5 мл 10% нейтрально буферизованного формалина (НБФ) в правый желудочек с той же скоростью.

5. Надувание воздуха в перфузии легкого

  1. Удалите переднюю половину грудной клетки. Чтобы обнажить трахею, разрежьте верхние ребра и ключицы справа и слева от шеи. Следите за тем, чтобы не разрезаться рядом с средней линией, где будет лежать трахея. С помощью щипцов обхватите оставшиеся верхние ребра и ключицы по средней линии шеи и тяните вверх, пока трахея не обнажится.
  2. Подготовьте шовную нить длиной 10 см, протяните ее под трахеей, а на нижнем конце оголенной трахеи предварительно завяжите свободный узел. Приготовьте шприц объемом 1 мл воздуха с катетером 18 G. С помощью иглы 18 G проделайте отверстие в трахее на верхнем конце обнаженной области.
  3. Поместите катетер в это отверстие, обеспечив относительно плотное прилегание и предотвращение выхода воздуха. Медленно вводите 1 мл воздуха в легкие в течение 10 с, следя за надуванием легких всех долей. Полное надувание приводит к тому, что легкие слегка оборачиваются вокруг сердца и заполняют объем, который они занимают в непроколотой диафрагме.
  4. Туго затяните узел вокруг трахеи и извлеките катетер. Возьмитесь за трахею и с помощью тупых ножниц удалите легкие у мыши, стараясь не проколоть легкое.

6. Иммерсионная фиксация и обезвоживание

  1. Поместите легкие на верхний край конической трубки объемом 50 мл, наполненной 20 мл 10% NBF. Держите нити шовной нити снаружи конуса, закрутите колпачок и переверните коническую так, чтобы легкие были подвешены вверх ногами в 20 мл NBF. Поместите его при температуре 4 °C на 24-48 часов.
  2. Промойте легкие в PBS, затем поместите в 30% раствор сахарозы-PBS (w/v) на 72-96 ч при 4 °C для обезвоживания легких и подготовки к криоконсервации. Извлеките легкие из сахарозы, поместите легкие в криомолд с оптимальной температурой резки (ОКТ) и заморозьте образец при температуре -80 °C.

7. Криосекция

  1. Уравновесьте образцы в криоблоках ОКТ до температуры криостата -20 °С в течение 1 ч перед срезом. Секция блоков при толщине 20-100 мкм.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Надувание воздуха может привести к повышенной хрупкости образца, а резка при увеличенной толщине может предотвратить разрыв тканей во время разреза.
  2. Соберите срезы на стеклянных предметных стеклах и дайте высохнуть от 30 минут до 1 часа, чтобы убедиться в прилегании тканей к предметному стеклу.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе слайды можно держать при температуре -80 °C.

8. Подготовка и блокировка предмета

  1. Поместите предметные стекла в ванну PBS (в посуду или банку для коплина) на 30 минут при комнатной температуре (RT), чтобы удалить ОКТ со стекол.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Более толстые секции (40-100 мкм) могут не прилипать к стеклянным предметным стеклам, а также более тонкие секции, поэтому лучше держать их плоскими и вертикальными в тарелке, а не класть на бок в банку Coplin.
  2. Высушите предметные стекла после того, как ОКТ растворится в ткани. С помощью салфетки высушите лишние капли по периметру предметного стекла вокруг образца ткани.
  3. С помощью гидрофобной ручки Папаниколау нарисуйте периметр вокруг образца и дайте ему высохнуть в течение 5 минут.
  4. Приготовьте блокирующий буфер из блокирующего раствора без животных с 0,3% Tween-20 и 1:100 Fc Block в 300 мл на предметное стекло.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для внутриклеточных мишеней можно использовать 1% Tween-20. Объем в 300 мкл обычно достаточен, но необходимый объем для покрытия ткани полностью зависит от размера периметра гидрофобного маркера. С этого момента ткань не должна пересыхать.
  5. Оставьте блокирующий раствор на предметных стеклах на 1 час при RT.

9. Иммуноокрашивание

  1. Промойте предметное стекло, отпишивая жидкость пипеткой и добавляя 300-500 μл PBS. Повторите стирку один раз.
  2. Приготовьте первичное конъюгированное антитело EpCAM (клон G8.8) к мышам (маркер эпителия дыхательных путей) AlexaFluor-647 в растворе блокатора животного происхождения с 0,33% Tween-20 (или 1% для внутриклеточных мишеней). Добавьте 300 μл этого раствора на каждое предметное стекло и окрашивайте на ночь при температуре 4 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Антитела должны быть проверены эмпирически на концентрацию окрашивания, время и температуру. Тонкие срезы (8-20 мкм) окрашивают в течение 30 мин при 37 °С, а более толстые срезы (20-100 мкм) - при 4 °С в течение ночи с использованием разведений 1:100 для большинства антител. При использовании неконъюгированных антител промойте 2 раза (как указано выше) и нанесите вторичное флуоресцентное антитело в течение эмпирически определенного времени и температуры. Как правило, окрашивание вторичными антителами проводят в режиме лучевой терапии в течение 1 ч при разведении 1:1000.
  3. Удалите раствор антитела из образца и промойте предметное стекло 300 мл PBS в течение 5 минут. Повторите эту стирку один раз. Высушите предметные стекла, удалив всю лишнюю жидкость с образца и окружающего стекла.
  4. Добавьте по одной капле мягкого монтажного носителя RT (например, стекла SlowFade) на каждый кусок салфетки. Следите за тем, чтобы не было пузырей, позволяя бутылке осесть вверх дном и медленно капая каждую каплю на салфетки. Установите защитный накладку соответствующего размера, чтобы он выходил за пределы образца и гидрофобного маркера.

10. Визуализация с помощью флуоресцентной микроскопии

  1. Используйте многоканальный флуоресцентный микроскоп для сканирования целых срезов легких несмещенным образом с помощью объектива с достаточным разрешением для разрешения отдельных спор и клеток-хозяев (например, Zeiss Axioscan 7 с 20-кратным масляным объективом с NA = 0,8 или аналогичным).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что мощность лазера и коэффициент усиления по напряжению ФЭУ установлены таким образом, чтобы максимизировать отношение сигнал/шум мишени на фоне, определенное с помощью регулятора флуоресценции минус один (FMO).
  2. Соберите достаточное количество фрагментов изображения, чтобы захватить всю долю легкого (например, ~200 фрагментов размером 400 μм x 400 μм). Используйте программное обеспечение для микроскопа (например, Zeiss ZEN 3.7 или аналогичный) для экспорта объединенного изображения листа для последующей обработки.

11. Пространственный анализ с помощью QuPath

  1. В QuPath, бесплатном программном обеспечении с открытым исходным кодом14, создайте файл проекта и добавьте в него флуоресцентные изображения.
  2. Классифицируйте пиксели EpCAM+ как эпителий, щелкнув в верхнем меню пункт «Классифицировать», затем классификацию пикселей > «Создать пороговый». Выберите разрешение, канал, сигму сглаживания и пороговое значение, которое лучше всего определяет целевую область. Сохраните классификатор под уникальным именем и выберите Создать объекты.
  3. В новом окне "Создание объектов " выберите "Новый тип объекта " в качестве аннотации. Для эпителия легких установите минимальный размер объекта и минимальный размер отверстия на 100 мм2. Здесь нет необходимости выбирать параметр «Разделить объекты ». После нажатия кнопки OK аннотации будут созданы, и их можно будет изменить на глаз с помощью инструмента «Кисть » в верхней левой области.
  4. Чтобы классифицировать споры, повторите шаги из пунктов 11.3-11.4, используя канал, в котором споры были захвачены, и выберите новый тип объекта Обнаружение , а не Аннотация. Установите минимальный размер объекта и минимальный размер отверстия на 0 мм2 и выберите Разделить объекты.
  5. Чтобы провести пространственный анализ спор, выберите в верхнем меню пункт Анализ > Пространственный анализ > Вычислить расстояние по знаку до аннотаций 2D. Расстояния до эпителия EpCAM+ будут рассчитаны для каждой обнаруженной споры. Экспортируйте их с помощью пункта верхнего меню «Измерить» > «Экспортировать измерения».

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот метод в конечном итоге позволяет получать иммунофлуоресцентные изображения легких мышей с использованием физиологического надувания воздуха, чтобы не беспокоить дыхательные пути. Важно отметить, что несколько контрольных точек на этом пути подтвердят, что компоненты протокола были выполнены успешно. Во время инокуляции важно подтвердить, что инокулюм был аспирирован, нащупав «хрипы» на задней грудной стенке мыши, которые указывают на попадание жидкости в дыхательные пути. Если ощущения хрипа нет, возможно, мышь проглотила инокулянт. Перфузия легких мышей с помощью PBS должна привести к белому пятнистию легких с последующим полным отбеливанием всего легкого (рисунок 2A). При неполном отбеливании последующая перфузия формалина не достигнет всех участков легочной паренхимы (рисунок 2В). При надувании легкого воздухом легкие должны медленно расширяться, пока не достигнут физиологических размеров. После наложения трахейного шва для закрепления воздуха внутри легких, легкие не должны уменьшаться в размерах. Если это так, то легкое, скорее всего, было проколото во время процедуры.

Здесь мы показываем репрезентативные изображения срезов с мечеными спорами Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3Δ (зелеными) и EpCAM+ столбчатым бронхиолярным эпителием (пурпурными) как в надутых воздухом, так и в надутых формалином жидкостных легких (рис. 3A, B соответственно). Эти споры в основном накапливаются в дистальных отделах бронхиол и в альвеолярных пространствах, непосредственно прилегающих к этим дистальным бронхиолам, вероятно, в альвеолярных протоках. Надутые воздухом фиксирующие легкие содержат споры, которые чаще появляются внутри бронхиол и группируются ближе к бронхиолам (Рисунок 3A), а не жидкие фиксаторы, где споры кажутся немного более рассеянными из бронхиолярного эпителия (Рисунок 3B). С помощью пространственного анализа QuPath мы измеряем расстояние отдельных спор до ближайшего бронхиолярного эпителия EpCAM+, чтобы указать уровень дисперсии спор от бронхиолы и в более дистальные альвеолярные пространства. Мы показываем, что жидкое надувание рассеивает споры дальше от бронхиол по сравнению с физиологическим надуванием воздуха (рис. 4A, B). Сосудистая перфузия с надуванием воздуха сохраняет естественное расположение этих спор в дистальных бронхиолах и предотвращает искусственное рассеивание этих спор в более дистальных альвеолярных пространствах путем интратрахеального фиксирующего инстилляции.

figure-results-1
Рисунок 2: Показатель успешности перфузии легких. (A) Успешно перфузионные легкие будут полностью белыми. (Б) Не полностью перфузированные легкие будут выглядеть розовыми или пестрыми. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 3: Репрезентативные изображения распределения спор в легких, надутых воздухом, перфузированных формалином, и легких, надутых формалином. Внутриклеточные флуоресцентные споры (зеленого цвета) распределяются в непосредственной близости от бронхиолярного эпителия EpCAM+ (пурпурного) в легких (А), надутых воздухом, чем в легких, надутых формалином (В). Изображения были получены со срезов глубиной 1,2 мм от задней поверхности левых долей мышей в каждой группе лечения на многоканальном флуоресцентном микроскопе при 20-кратном увеличении, а плитки были сшиты с помощью программного обеспечения для микроскопии. Масштабная линейка = 800 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-3
Рисунок 4: Сравнение расстояния между спорами (мм) и бронхиолярным эпителием между надутыми воздухом и надутыми формалином легкими, обработанными спорами. Легкие у 3 мышей в каждой группе лечения собирали, обрабатывали и визуализировали в течение 1,5 ч после инокуляции 1 x 106 Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3Δ arthroconidia. Четыре среза у каждой мыши были отобраны на расстоянии 0,8 мм, 1,2 мм, 1,6 мм и 2,0 мм от задней поверхности левой доли, окрашены и визуализированы на многоканальном флуоресцентном микроскопе. Все споры из каждой группы были обнаружены и пространственно проанализированы в QuPath для определения (A) расстояния до ближайшего столбчатого бронхиолярного эпителия EpCAM+, и (B) медиана и 95% доверительные интервалы отображаются в единицах микрометров. Споры надувания воздуха, n = 11,673. Споры жидкостного надувания, n = 9,837. t-критерий Манна-Уитни проводился в связи с отсутствием нормы, а p < 0,0001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы создали конвейер для ингаляции спор и анализа пространственного осаждения вдыхаемых спор. Этот конвейер предоставляет ценную информацию для определения соответствующих стромальных областей легких, пораженных вдыханием Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3Δ arthroconidia. Мы наблюдали, что споры Coccidioides и инертные частицы аналогичного размера (данные не показаны) накапливаются в дистальных бронхиолярных областях и бронхо-альвеолярных соединениях, а не полностью рассеиваются по всем просветам альвеолярных дыхательных путей. Эта модель требует относительно низкого уровня оборудования и технических навыков для производства криорезов для иммунофлуоресценции (или других последующих трубопроводов, таких как иммуногистохимия [ИГХ]), которые поддерживают физиологическую целостность содержимого дыхательных путей при сохранении естественной морфологии легких. Без надувания воздуха коллапс альвеол искажает естественную архитектуру легочной паренхимы, окружающей бронхиолы13,15. Потеря объема воздуха в легком во время гистологической обработки была отмечена как «серьезная проблема» в совместном официальном заявлении об исследовательской политике Американского торакального общества и Европейского респираторного общества по определению стандартов количественной оценки структуры легких. Кроме того, интратрахеальная инстилляция фиксатора может нарушить природу и расположение проксимальных молекулярных и клеточных компонентов дыхательных путей, таких как муцины, сурфактант и реснички дыхательных путей 17,18,19. Описанный здесь метод в достаточной степени сохраняет как объем воздуха в легких, так и молекулярные и клеточные компоненты вдоль дыхательных путей, которые взаимодействуют с вдыхаемыми спорами грибов.

Иммунофлуоресцентная микроскопия является мощным инструментом для изучения пространственной динамики компонентов легких, и она хорошо отозначается 20,21. Нет никаких ограничений в отношении мишеней, которые могут быть окрашены с помощью иммунофлюоресценции этих участков, за исключением того, что антитела с эпитопами, чувствительными к фиксации формалина, могут не связываться удовлетворительным образом со своими мишенями. При использовании нового антитела лучше всего подготовить контроль флуоресценции минус один (FMO), чтобы определить, генерирует ли антитело какой-либо сигнал над фоном. При использовании вторичного антитела используйте группу лечения без первичного антитела для контроля нецелевого связывания вторичного антитела. Первичные конъюгированные моноклональные антитела очень специфичны, поэтому окрашивание при более высоких температурах (37 °C) в течение меньшего времени (30 минут) является распространенным явлением и обычно специфически связывается с их мишенью. С другой стороны, неконъюгированные поликлональные антитела более чувствительны к обнаружению антигенов, но менее специфичны, поэтому более длительные инкубации (~16 ч) при более низких температурах (4 °C) оптимизируют соотношение сигнал/шум. Все антитела потребуют эмпирической оптимизации.

Модель пространственного анализа, используемая в этом исследовании для локализации спор, измеряет расстояние от отдельных спор до ближайшего бронхиолярного эпителия. Это требует соответствующей идентификации бронхиолярного эпителия с использованием его высокого сигнала EpCAM и морфологически отчетливого внешнего вида в виде трубчатых структур, выстилающих столбчатый эпителий. EpCAM также может экспрессироваться на более низких уровнях альвеолярным эпителием, поэтому важно установить порог сигнала EpCAM в QuPath, чтобы ограничить определенные аннотации морфологически подтвержденными бронхиолярными областями. Поскольку бронхиолы имеют анатомически минимальный размер, мы можем ограничить определение этих областей с помощью QuPath минимальной площадью 100мм2, как указано в шаге 11.3. Это исключит изолированные клетки с высокой экспрессией EpCAM или артефакты в альвеолярных пространствах, такие как эпителиальные клетки альвеолярного типа II, из аннотаций QuPath. Эти шаги позволяют определить исключительно бронхиолярный эпителий в виде аннотаций QuPath и определить близость спор к этому определенному бронхиолярному эпителию.

Описанная здесь модель инфекции использует изофлурановую анестезию для индуцирования перорального ответа на задыхающийся ответ у мышей на аспирацию спор гриба. Метод открытой капли изофлурана был разработан как быстрый, малоресурсный метод для индуцирования кратковременной анестезии у мышей 9,22,23. Этот метод требует некоторой практики для последовательного выполнения. Время под анестезией должно быть достаточно длительным, чтобы обезболить мышь в достаточной степени для аспирации содержимого глотки. Если мышь недостаточно обезболивается, она может проглотить инокулюм вместо того, чтобы аспирировать его. Признак достаточной анестезии достигается, когда мышь производит регулярный пероральный вздох с нарастающей силой со скоростью около 50-60 выдохов/мин. Голова лежащей мыши должна двигаться вперед с каждым вздохом. Недостаточная анестезия может быть определена по отсутствию дыхания или любому движению усов, языка или конечностей. Рекомендуется надавливать на язык кончиком пипетки во время введения инокулята, чтобы предотвратить глотание. Передозировка изофлурана может привести к смерти мыши, и ее необходимо предотвратить. Хорошим эмпирическим правилом для предотвращения этого является удаление изофлурана у мыши через столько же времени, которое потребовалось для того, чтобы мышь потеряла рефлекс коррекции. Например, если мышь теряет рефлекс выпрямления за 10 секунд, уберите мышь еще через 10 секунд. Поскольку газообразный изофлуран улетучивается в ходе многократного лечения мышей, этот временной интервал может увеличиваться. В наших руках мы можем лечить 6-8 мышей без добавления большего количества изофлурана.

Существуют некоторые ограничения в отношении компонентов этого протокола. В процедуре посева используются споры, взвешенные в 25 μл жидкой среды PBS, что менее физиологично, чем аэрозольный посев спор. Остается открытым вопрос о том, изменяет ли использование аспирированной жидкости локализацию спор/частиц по сравнению с другими методами инокуляции, такими как вдыхание спор, переносимых по воздуху. Тем не менее, аэрозольная ингаляция требует значительных вложений ресурсов и имеет другие ограничения (ограниченный размер посева, переменное воздействие, профессиональный риск), которые могут быть неоптимальными в зависимости от характера исследования и лабораторных условий. Еще одним ограничением этого протокола является то, что во время криоссекции может возникнуть хрупкость тканей, что может быть связано либо с присутствием воздуха по всей ткани, либо со снижением эффективности сосудистой фиксации по сравнению с интратрахеальной фиксацией. Эту хрупкость криоссекции можно преодолеть, разрезая более толстые срезы 60-100 мкм и используя конфокальную микроскопию для визуализации двумерных (2D) плоскостей внутри ткани.

Мы считаем, что простота и адаптивность этого метода позволят другим группам найти полезность в отношении выбранных ими ингаляционных патогенов и реакций хозяина, представляющих интерес.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Финансирование и поддержка были получены за счет гранта NIH K22 AI153678-01 и Школы последипломного образования Рутгерса. Мы благодарим Фавада Юсуфзая и Люка Фрицки из Rutgers Biomedical Health Sciences Cellular Imaging and Histology Core за их работу и опыт в получении иммунофлуоресцентных изображений.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
18 г, 1 игла (305185)Fisher305185
1 л  Завинчивающаяся банка (Налген)Fisher Scientific11-823-33
Air-Tite Bulk Unsterile Шприцы 10 мл Luer LockFisher14-817-175
AnaSed Injection (стерильный раствор ксилазина)Akorn59399-110-20
Блокатор и разбавитель животного происхождения, R.T.U.VectorSP-5035-100
BD Insyte Autoguard Крылатый экранированный внутривенный катетер с материалом катетера BD Vialon 18 G x 1.88 inBD381547
BD Pharmingen Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (мышь BD fc block™)BD553142
CellTracker Оранжевый краситель CMRA FisherScientificNC0873640
CFSELabviva75003
Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3Δ  BEI ResourcesNR-166
Corning 70 микронные ситечкиVWR10054-456
EpCAM AlexaFluor647 моноклональное антителоBiolegend118211
Exel International HYpodermic Needles 30 G x 1/2"LabvivaEN3012
Fisherbrand Стерильные шприцы для одноразового использования (1 мл, Leur Slip)Fisher14-955-462
Моногидрат глюкозыAzer Scientific ES17530-500G
Высоковакуумная смазкаVWR59344-055
Hoechst 33342 Раствор 20 мМ (5 мл)ThermoFischer62249
Изофлуран USPCovetrus29405
Кетамина гидрохлоридDechra1000001250
KIMWIPES Деликатные стеклоочистители (4,4 дюйма x 8,4 дюйма)VWR21905-026
Lexer Baby ScissorsFST14078-10
Микроадсон ЩипцыFST11018-12
Нейтральный буферизованный формалин (10%) (Azer Scientific)Fisher22-026-350
Nunc EasYФляги для культуры тканей, T75, фильтрующие колпачкиVWR15708-134
PBS VWR45000-446
Peel-A-Way формы для встраиванияSigmaE6032-1CS
QuPath 0.5.1 Программное обеспечениес открытым исходным кодомhttps://qupath.github.io/
Шелковая шовная нить размер 3/0FST18020-30
SlidesMicro Slides Superfrost Plus VWR48311-703
SlowFade Glass Soft-set Anti Fade Mountant (2 мл)ThermoFischerS36917
SucroseSigmaS0389-500G
Tissue-Tek O.C.T. Compound, Sakura FinetekVWR25608-930
Tween 20ThermoFischerJ20605.
Vector Laboratories ImmEDGE Гидрофобная барьерная ручка набор из 2Fisher ScientificNC9545623
VWR Micro Cover, прямоугольные (24 мм x 40 мм #1.5)VWR48393-230
Белая пластиковая проволочная сеткаMAPORCH789862904922
экстрактом дрожжейFisherBP9727-500
Zeiss AxioScan 7 Carl Zeiss Microscopy GmbHhttps://www.zeiss.com/microscopy/us/products/imaging-systems/axioscan-for-biology.htmlмногоканальный флуоресцентный микроскоп
ZEN 3.7 программное обеспечениеCarl Zeiss Microscopy GmbHhttps://www.zeiss.com/microscopy/us/products/software/zeiss-zen.htmlпрограммное обеспечение для микроскопии
AP очков

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. American Society for Microbiology. One Health: Fungal Pathogens of Humans, Animals, and Plants. Report on an American Academy of Microbiology Colloquium. , Washington, DC. (2019).
  2. Crossen, A. J., et al. Human airway epithelium responses to invasive fungal infections: A critical partner in innate immunity. J Fungi (Basel). 9 (1), 40(2022).
  3. Yamamoto, N., et al. Particle-size distributions and seasonal diversity of allergenic and pathogenic fungi in outdoor air. ISME J. 6 (10), 1801-1811 (2012).
  4. Thakur, A. K., Kaundle, B., Singh, I. Mucoadhesive Drug Delivery Systems in Respiratory Diseases.Targeting Chronic Inflammatory Lung Diseases Using Advanced Drug Delivery Systems. , Elsevier, Academic Press. (2020).
  5. Darquenne, C. Aerosol deposition in health and disease. J Aerosol Med Pulm Drug Deliv. 25 (3), 140-147 (2012).
  6. Kradin, R. L., Mark, E. J. The pathology of pulmonary disorders due to Aspergillus spp. Arch Pathol Lab Med. 132 (4), 606-614 (2008).
  7. Karnak, D., Avery, R. K., Gildea, T. R., Sahoo, D., Mehta, A. C. Endobronchial fungal disease: An under-recognized entity. Respiration. 74 (1), 88-104 (2006).
  8. Amich, J., et al. Three-dimensional light sheet fluorescence microscopy of lungs to dissect local host immune-Aspergillus fumigatus interactions. mBio. 11 (1), e02752-e02819 (2020).
  9. Wiesner, D. L., et al. Club cell TRPV4 serves as a damage sensor driving lung allergic inflammation. Cell Host Microbe. 27 (4), 614-628.e6 (2020).
  10. Evans, S. E., Hahn, P. Y., McCann, F., Kottom, T. J., Pavlovic', Z. V., Limper, A. H. Pneumocystis cell wall β-glucans stimulate alveolar epithelial cell chemokine generation through nuclear factor-κB-dependent mechanisms. Am J Respir Cell Mol Biol. 32 (6), 490-497 (2005).
  11. Bauer, C., Krueger, M., Lamm, W. J. E., Glenny, R. W., Beichel, R. R. lapdMouse: associating lung anatomy with local particle deposition in mice. J Appl Physiol. 128 (2), 309-323 (2020).
  12. Srirama, P. K., Wallis, C. D., Lee, D., Wexler, A. S. Imaging extra-thoracic airways and deposited particles in laboratory animals. J Aerosol Sci. 45, 40-49 (2012).
  13. Thomas, S. M., Bednarek, J., Janssen, W. J., Hume, P. S. Air-inflation of murine lungs with vascular perfusion-fixation. J Vis Exp. 168, e62215(2021).
  14. Bankhead, P., et al. QuPath: Open source software for digital pathology image analysis. Sci Rep. 7 (1), 16878(2017).
  15. Davenport, M. L., Sherrill, T. P., Blackwell, T. S., Edmonds, M. D. Perfusion and inflation of the mouse lung for tumor histology. J Vis Exp. 162, e60605(2020).
  16. Hsia, C. C. W., Hyde, D. M., Ochs, M., Weibel, E. R. An official research policy statement of the American Thoracic Society/European Respiratory Society: Standards for quantitative assessment of lung structure. Am J Respir Crit Care Med. 181 (4), 394-418 (2010).
  17. Gil, J., Weibel, E. R. Extracellular lining of bronchioles after perfusion-fixation of rat lungs for electron microscopy. Anat Rec. 169 (2), 185-199 (1971).
  18. Bachofen, H., Ammann, A., Wangensteen, D., Weibel, E. R. Perfusion fixation of lungs for structure-function analysis: credits and limitations. J Appl Physiol Respir Environ Exerc Physiol. 53 (2), 528-533 (1982).
  19. Evans, C. M., et al. The polymeric mucin Muc5ac is required for allergic airway hyperreactivity. Nat Commun. 6, 6281(2015).
  20. Galati, D. F., Asai, D. J. Immunofluorescence microscopy. Curr Protoc. 3 (8), e842(2023).
  21. Hickey, S. M., et al. Fluorescence microscopy-An outline of hardware, biological handling, and fluorophore considerations. Cells. 11 (1), 35(2021).
  22. Risling, T. E., Caulkett, N. A., Florence, D. Open-drop anesthesia for small laboratory animals. Can Vet J. 53 (3), 299-302 (2012).
  23. Bodnar, M. J., Ratuski, A. S., Weary, D. M. Mouse isoflurane anesthesia using the drop method. Lab Anim. 57 (6), 623-630 (2023).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Murine Lung ImagingFungal Spore LocalizationAirway Spatial DynamicsAir Inflation FixationVascular Perfusion FixationCryopreservation TechniqueFluorescent MicroscopyQuPath AnalysisEpCAM Antibody StainingRespiratory Fungal Infection

Related Articles