Трёхмерные методы культивирования и обработки органоидов для генерации миомы и матки

Summary

Этот протокол описывает ручную технику создания гидрогелей, содержащих коллаген, внедрённых в 3D-органоидные культуры стволовых клеток из ткани миометрии и миомы матки.

Abstract

Миомы матки — самые распространённые доброкачественные, моноклональные гинекологические опухоли в матке женщины. Чтобы преодолеть распространённые препятствия, связанные с методами изучения этих патологий, мы стремились разработать стратегию создания трёхмерных органоидных моделей стволовых клеток миометрия и матки с использованием гидрогелей с коллагеном в качестве встроенных каркасов. В частности, были использованы гидрогели с коллагеном в плитах с низким креплением V-образного дна с 96 скважинами. Этот метод позволил разработать 3D-органоиды двух типов стволовых клеток из нормального миометрия и миометрия, содержащего миому матки, путём их встраивания в гидрогели, содержащие коллаген, и формирования органоидов в подходящей среде для пролиферации стволовых клеток. Органоиды успешно дифференцировались, размножались и самоорганизовались в сложные структуры, создавая устойчивую систему. Важность этой модели заключается в понимании патофизиологии и этиопатогенеза, а также для тестирования новых препаратов для профилактики или лечения миомы матки.

Introduction

Миомы матки, или лейомиомы, являются наиболее распространёнными доброкачественными опухолями^{матки 1}. Они затрагивают значительную часть женщин в репродуктивные годы, и исследования показывают, что около 77% женщин испытывают их в какой-то момент. Хотя у многих женщин миомы без симптомов, значительные 25% испытывают такие симптомы, как аномальное кровотечение из матки, тазовые боли или^{бесплодие 2}. Развитие и рост миом зависят от различных факторов, включая половые гормоны, факторы роста, генетические изменения и другие биологические^{механизмы. 3}.

Protocol

Протокол был утверждён Этническим комитетом Чикагского университета с номером одобрения IRB#20-1414. По данным банка тканей Чикагского университета, информированное согласие получалось от всех участников, у которых была собрана ткань.

1. 3D культура органоидов

1. Культивировать и поддерживать изолированные и очищенные миометрии и UF стволовые клетки (SC), как описано^{выше 9}.
2. Получите SC из жидкого азота и дайте им оттаять. Схема процесса культурирования показана на рисунке 1.
3. Добавьте 5 мл белка фактора прикрепления, чтобы подгото....

Results

Уже в первый день после посева SC начали самоагрегироваться, формируя органоиды, как показано. Оптимальная плотность посева составила 10 000 SC, которые при культивировании в определённой системе культуры стабильно образовывали органоиды. В этой системе использовались гидрогели, содержащие коллаген, в качестве каркаса ЭКМ для встроенных стволовых клеток и среды пролиферации стволовых клеток в течение 7 дней в ультранизкой пластине с 96 лунками

Discussion

Органоиды — это трёхмерные структуры, напоминающие миниатюрные органы и состоящие из самоорганизованных клеток, полученных из стволовых клеток или образцов^{тканей 11}. Тканевые органоиды стволовых клеток пациентов имеют потенциал революционизировать биомедицинские исследования и клинические применения благодаря своей выдающейся способности точно воспроизводить физиологию и болезни^{UF 12}. В данном исследовании пытается преодолеть этот разрыв, в.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-фотонная конфокалия  Микроскоп	Leica, США
Агароза I	Корпорация VWR, США	97062-248
Akura 96 Сфероидные микропластины	InSphero	CS-09-004-03	V-образные пластины с низким креплением
Alexa Fluor 488 козла против мышей IgG	Life Technologies, Калифорния, США	(A11029)	(1:1000)
Alexa Fluor 594 против коз IgG	Life Technologies, Калифорния, США	(A11037)	(1:1000)
Anti-Ahr [RPT]	GeneTex, Тайвань	(GTX227700a)	(1:1000)
Анти-альфа-гладкомышечный антител к актину	Абкам, Массачусетс, США	(AB7817)	1 и микро; g/mL
Антиколлаген III антитела	Абкам, Массачусетс, США	(AB7778)	(1:500)
Антитела к анти-SOX1	Абкам, Массачусетс, США	AB242125	(1:500)
Коэффициент привязанности	Gibco, США	S-006-100
Блокирующий буфер	Дако	X0909	5%  сыворотка лошадей + 0,5%  Triton X-100  в 1X  PBS
Криостат	Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс	Microm HM 550
DAPI (4′,6-диамидино-2-фенилиндол)	Thermo Scientific, Германия	62248	1 мг/мл
DNase I	Thermo-Scientific, Литва	EN0521
Dullbecco' модифицированный Eagle' s средний DMEM и  F12	Gibco, США	21041-025
Сыворотка плода быка	Omega Scientific ,  Уолтем, Массачусетс	NC0471611
Matrigel (гидрогели, содержащие коллаген)	Корнинг, Корнинг, Нью-Йорк	356237
MesenCult-ACF Plus Medium (безсывороточные стволовые клетки, пролиферирующие среда   )	Stemcell Technologies, Ванкувер, Канада	5446
OCT (Оптимальная температура резки)	Сакура, США	4583
микроскоп Olympus BX41 и nbsp;	Olympus America, Центр-Вэлли, Пенсильвания
Раствор ингибитора овомукоидной протеазы	Worthington Biochemical Corporation, США	LK003182
Papain	Worthington Biochemical Corporation, США	LK003176	раствор активации (1,1 мМ ЭДТА, 0,067 мМ меркаптоэтанола, 5,5 мМ L-цистеина HCl)
PBS (Фосфатно-буферный физиологический раствор)	Gibco, США	70011	pH 7,4
PFA (параформальдегид) 4%	Invitrogen, США	FB002
Купат	Бэнкхед, П. и др.  QuPath: Открытое программное обеспечение для анализа цифровых патологических изображений.  Научные отчёты  (2017).	https://doi.org/10.1038/s41598-017-17204-5	Программное обеспечение для анализа биовизуализации
Таймлапс-микроскоп
Колбы для культуры тканей	Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс	FB012937
Trypsin	Gibco, США	A12859-01	0,25% трипсина и 0,1% ЭДТА в HBSS без кальция или магния
VECTASHIELD Antifade Mount Medium с DAPI	Vector Laboratories, Калифорния, США	#  UX-93952-24	1  ng/mL