Трёхмерные методы культивирования и обработки органоидов для генерации миомы и матки

Summary

Этот протокол описывает ручную технику создания гидрогелей, содержащих коллаген, внедрённых в 3D-органоидные культуры стволовых клеток из ткани миометрии и миомы матки.

Abstract

Миомы матки — самые распространённые доброкачественные, моноклональные гинекологические опухоли в матке женщины. Чтобы преодолеть распространённые препятствия, связанные с методами изучения этих патологий, мы стремились разработать стратегию создания трёхмерных органоидных моделей стволовых клеток миометрия и матки с использованием гидрогелей с коллагеном в качестве встроенных каркасов. В частности, были использованы гидрогели с коллагеном в плитах с низким креплением V-образного дна с 96 скважинами. Этот метод позволил разработать 3D-органоиды двух типов стволовых клеток из нормального миометрия и миометрия, содержащего миому матки, путём их встраивания в гидрогели, содержащие коллаген, и формирования органоидов в подходящей среде для пролиферации стволовых клеток. Органоиды успешно дифференцировались, размножались и самоорганизовались в сложные структуры, создавая устойчивую систему. Важность этой модели заключается в понимании патофизиологии и этиопатогенеза, а также для тестирования новых препаратов для профилактики или лечения миомы матки.

Introduction

Миомы матки, или лейомиомы, являются наиболее распространёнными доброкачественными опухолями^{матки 1}. Они затрагивают значительную часть женщин в репродуктивные годы, и исследования показывают, что около 77% женщин испытывают их в какой-то момент. Хотя у многих женщин миомы без симптомов, значительные 25% испытывают такие симптомы, как аномальное кровотечение из матки, тазовые боли или^{бесплодие 2}. Развитие и рост миом зависят от различных факторов, включая половые гормоны, факторы роста, генетические изменения и другие биологические^{механизмы. 3}.

Для изучения патогенеза и проверки эффективности лекарств разработаны in vitro и животные модели. Клетки в двумерных культурах вынуждены расти на плоской поверхности, искажая их форму и изменяя поведение по сравнению с тем, как они ведут себя в среде трёхмерной ткани. Основным недостатком 2D-культивирования по сравнению с 3D-культивированием является то, что оно плохо отражает естественную клеточную среду внутри ткани, не способная точно имитировать сложные взаимодействия между клетками и матрицей, происходящие в живом организме, что может привести к потенциально неточным результатам при изучении поведения и реакции клеток на^{стимулы 4}. Кроме того, УФ и миометриальные клетки быстро теряют реакцию на гормоны в^{2D-культуре 5}. В целом, различные модели животных предоставили релевантную информацию по патофизиологии^{UF 6}. По сравнению с животными моделями, 3D-органоиды обладают рядом преимуществ: они упрощают эксперименты, совместимы с изображением в реальном времени и позволяют изучать специфические для человека аспекты развития и заболеваний, которые недостаточно представлены в животных^{моделях 7}. С другой стороны, эксперименты с более сложными животными, такими как приматы, очень трудно оправдать этически, помимо высоких расходов⁸. 3D-модель органоидов, как правило, превосходит 2D-клеточные культуры, более близко имитируя архитектуру тканей in vivo , при этом более контролируемой, эффективной и экономичной по сравнению с животными моделями. Поэтому крайне важно разработать более эффективные альтернативные модели, которые точно воспроизводят естественный рост клеток и сложность заболевших тканей.

Наша цель — организовать процедуру для проведения 3D-культуры органоидов стволовых клеток миометрия и миомы матки с использованием гидрогелей с коллагеном, содержащим коллаген, с помощью ручной процедуры, подчеркнув основные преимущества и ограничения.

Protocol

Протокол был утверждён Этническим комитетом Чикагского университета с номером одобрения IRB#20-1414. По данным банка тканей Чикагского университета, информированное согласие получалось от всех участников, у которых была собрана ткань.

1. 3D культура органоидов

1. Культивировать и поддерживать изолированные и очищенные миометрии и UF стволовые клетки (SC), как описано^{выше 9}.
2. Получите SC из жидкого азота и дайте им оттаять. Схема процесса культурирования показана на рисунке 1.
3. Добавьте 5 мл белка фактора прикрепления, чтобы подготовить заранее покрытые колбы. Инкубировать не менее 4 часов при 37 °C. Затем отбросьте избыток белка фактора прикрепления.
4. Выращивайте SC в предварительно покрытых колбах размером 75^см² с использованием 10 мл среды, включающей как модифицированную среду Eagle's Medium (DMEM) от Dulbecco, так и F12, дополненную 12% сывороткой для плода крупного рогатого скота (FBS). Инкубировать колбу в инкубаторе с гипоксией при температуре 37 °C с концентрацией кислорода 2% до достижения слияния 90%, как показано на рисунке 2A.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Гипоксия может играть значительную роль в росте стволовых клеток, поскольку способствует пролиферации и выживанию стволовых клеток.
5. При достижении слияния клетки отделяют с помощью раствора 25% трипсина-0,1% ЭДТА в HBSS без кальция или магния.
   1. Для этого удалите клеточную культурную среду. Промой клетки с помощью 1x PBS. Добавьте 1 мл трипсина в одну клетку площадью 25 см² и инкубуйте 2-3 минуты.
   2. Когда клетки начнут отсоединяться, добавьте среду с сывороткой, чтобы остановить реакцию трипсина. Аспирировать раствор клетки в трубку на 15 мл и центрифугировать 5 минут при 500 х г при комнатной температуре.
   3. Осторожно выбросьте супернатант, оставив шарик нетронутым.
6. Затем клеточные гранулы ресуспендируют в 1 мл среды для пролиферации стволовых клеток без сыворотки. Разрушайте скопления с помощью мягкой пипетки.
7. Проведите количественную оценку клеток с помощью гемоцитометра.
   1. Смешайте 100 мкл суспензии ячейки с 10 мкл раствора Trypan Blue с 0,4%.
   2. Кратковременно вихрь смеси и пипетка 10 мкл суспензии Trypan Blue-cell в камеру гемоцитометра между выемкой камеры и стеклянным покрытием ( рисунок 2B).
   3. Подсчитайте ячейки в блоках 1-4, используйте следующие уравнения для вычисления количества ячеек:
      Клетки/мл = (общее количество ячейок/общее количество ячеек) x коэффициент разбавления x 10 000
      Общее количество ячеек в образце = клетки/мл x общий объём образца
8. Смешайте примерно 10 000 клеток с 2 мкл гидрогелей с коллагеном и 98 мкл среды пролиферации стволовых клеток без сыворотки, получая итоговый объём 100 мкл на^{колодец 5}для пластины с V-нижней 96 лунками.
9. Пипетка — 100 мкл ячеточной смеси в каждую яму, в плите с низким прикреплением V-образного дна с 96 лунками. Центрифугу при комнатной температуре на 5 минут при 100 х г.
10. Поставьте пластину в инкубатор при температуре 37 °C с 5%_CO2 на 30 минут.
11. Добавьте в каждую скважину дополнительно 100 мкл среды для размножения стволовых клеток без сыворотки без коллагенсодержащих гидрогелей для обеспечения питательных веществ, необходимых для роста органов.
12. Компенсируйте испарение среды, добавляя 10-20 мкл среды для пролиферации стволовых клеток без сыворотки в каждую скважину в случае чрезмерного испарения, которое случается редко.
13. Культивировать клетки в течение 7 дней для полного роста органоидов. Рисунок 2C-H. Меняйте пролиферирующую среду безсывороточных стволовых клеток 2 раза в неделю (аккуратно аспирируя старую среду и затем добавляя свежую), чтобы можно было продлить культивирование органоидов, полученных из СК, до 21 дня.

2. Замороженное сечение

1. Соберите клетки из пластины с 96 лунками в микроцентрифугную трубку объёмом 1,5 мл.
2. Для криосекции промывайте органоиды 2 раза с фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS; 1 раз). Добавьте 500 мкл PBS к органоидам, затем центрифугуйте и отбрасывайте супернатант.
3. Зафиксируйте органоиды 500 мкл 4% параформальдегида (PFA) на 60 минут при 4 °C и снова промыйте с помощью 1x PBS.
4. Органоиды снова суспензируются в 100 мкл 2% метиленового синего цвета для окрашивания в течение 20 минут. Мойте с помощью 1x PBS и криопротекторы на ночь с помощью суспензии в 500 мкл сахарозы 30%.
5. На следующий день удалите раствор сахарозы центрифугированием. Органоиды поместят в состав оптимальной температуры резки (OCT) и заморозьте при −80 °C.
6. Разрезайте органоиды, встроенные в ОКТ с помощью криостата, оптимальная глубина сечения — 10 мкм, и сразу разместите срезы на стеклах, по одной секции на слайд.
7. Сохраняйте стекли при 4 °C до проведения иммунофлуоресцентного окрашивания следующим методом.
8. Помой затвор три раза с 100 мкл из 1x PBS. Затем добавьте 100 мкл тритона 0,1% в PBS (1 раз) на 15 минут при комнатной температуре.
9. Блокировать органоиды 5% BSA в 1x PBS на 60 минут и инкубировать на ночь первичными антителами к Sox-2 с разбавлением (1:500) и актином α-гладкой мускулатурой (α-SMA) с конечной концентрацией 1 мкг/мл.
10. Промывайте органоиды 100 мкл 1x PBS 3 раза, а затем инкубируют 1 час в темноте с вторичными антителами к флуоресцентным красителям с меткой Alexa Fluor (1:1000).
11. Помойте 100 мкл 1x PBS 2x, затем установите в Antifade Mounting Medium с дополнением DAPI (1 нг/мл).
12. Получайте изображения с помощью флуоресцентного микроскопа с увеличением в 20 раз. См. рисунок 3A и проанализируйте изображения с помощью программного обеспечения для биовизуализации.

3. Иммунофлуоресцентное окрашивание целостных органоидов

1. Удалите органоиды из носителя (шаг 1.11) в микроцентрифугную трубку и промывайте два раза с 500 мкл 1x PBS.
2. Зафиксируйте органоиды 500 мкл 4% PFA на 60 минут при комнатной температуре. Затем сбросьте PFA и стирайте 500 мкл PBS 3x.
3. Пермеабилизуйте фиксированные органоиды с 0,5 мл блокирующего буфера на ночь при 4 °C.
4. На следующий день удалите блокирующий буфер, добавьте первичные антитела (300-500 мкл) коллагена III (COL3A1) с разбавлением (1:500) и AHR с разбавлением (1:1000), и инкубируете образцы при 4 °C на ночь.
5. Промыйте органоиды 3 раза с 500 мкл 1x PBS, а затем инкубировать вторичными антителами (594 козьи антикроличий IgG и 488 козьих IgG) на ночь при 4 °C в темноте.
6. Промыть органоиды три раза 500 мкл 1x PBS, затем инкубировать с 5 мкг/мл 4′,6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) в 1x PBS (300-500 мкл на образец) при комнатной температуре в течение 20 минут.
7. Промыйте органоиды три раза с помощью 500 мкл 1x PBS и сделайте изображение на конфокальном микроскопе (рисунок 3B).

4. Органоидная диссоциация

1. Восстановить 100 мг папаина в растворе, стерилизированном фильтром, до стандартной концентрации 250 U/mL, инкубировать раствор при 37 °C в течение 30 минут для активации фермента
   ПРИМЕЧАНИЕ: Её можно хранить при 2–8 °C до 2 недель.
2. Приготовьте раствор для диссоциации (непосредственно перед использованием) с папаином 30 U/mL и 125 U/mL DNase I в сбалансированном солевом растворе Хэнкса (HBSS).
3. Перенесите органоиды (шаг 1.11) на пластины с 24 лунками и добавьте 500 мкл раствора диссоциации.
4. Инкубировать образцы при 37 °C в течение 30–60 минут на орбитальном шейкере, установленном на 90 об/мин.
5. Тритурируйте периодически 5x-6x с использованием пипетки объемом 1 мл при комнатной температуре, чтобы получить суспензия, состоящая преимущественно из отдельных ячеек.
6. Добавьте суспензию клетки в 15-мл центрифугную трубку с раствором ингибитора протеазы (1 мл 10 мг/мл) и центрифугу при 300 х г в течение 5 минут для гранулированных клеток, после чего сбросьте супернатант.
7. Повторно суспензировать ячейки в соответствующем буфере, и полученная суспензия из одной ячейки показана на рисунке 2I.

Results

Уже в первый день после посева SC начали самоагрегироваться, формируя органоиды, как показано. Оптимальная плотность посева составила 10 000 SC, которые при культивировании в определённой системе культуры стабильно образовывали органоиды. В этой системе использовались гидрогели, содержащие коллаген, в качестве каркаса ЭКМ для встроенных стволовых клеток и среды пролиферации стволовых клеток в течение 7 дней в ультранизкой пластине с 96 лунками

Discussion

Органоиды — это трёхмерные структуры, напоминающие миниатюрные органы и состоящие из самоорганизованных клеток, полученных из стволовых клеток или образцов^{тканей 11}. Тканевые органоиды стволовых клеток пациентов имеют потенциал революционизировать биомедицинские исследования и клинические применения благодаря своей выдающейся способности точно воспроизводить физиологию и болезни^{UF 12}. В данном исследовании пытается преодолеть этот разрыв, в...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-фотонная конфокалия  Микроскоп	Leica, США
Агароза I	Корпорация VWR, США	97062-248
Akura 96 Сфероидные микропластины	InSphero	CS-09-004-03	V-образные пластины с низким креплением
Alexa Fluor 488 козла против мышей IgG	Life Technologies, Калифорния, США	(A11029)	(1:1000)
Alexa Fluor 594 против коз IgG	Life Technologies, Калифорния, США	(A11037)	(1:1000)
Anti-Ahr [RPT]	GeneTex, Тайвань	(GTX227700a)	(1:1000)
Анти-альфа-гладкомышечный антител к актину	Абкам, Массачусетс, США	(AB7817)	1 и микро; g/mL
Антиколлаген III антитела	Абкам, Массачусетс, США	(AB7778)	(1:500)
Антитела к анти-SOX1	Абкам, Массачусетс, США	AB242125	(1:500)
Коэффициент привязанности	Gibco, США	S-006-100
Блокирующий буфер	Дако	X0909	5%  сыворотка лошадей + 0,5%  Triton X-100  в 1X  PBS
Криостат	Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс	Microm HM 550
DAPI (4′,6-диамидино-2-фенилиндол)	Thermo Scientific, Германия	62248	1 мг/мл
DNase I	Thermo-Scientific, Литва	EN0521
Dullbecco' модифицированный Eagle' s средний DMEM и  F12	Gibco, США	21041-025
Сыворотка плода быка	Omega Scientific ,  Уолтем, Массачусетс	NC0471611
Matrigel (гидрогели, содержащие коллаген)	Корнинг, Корнинг, Нью-Йорк	356237
MesenCult-ACF Plus Medium (безсывороточные стволовые клетки, пролиферирующие среда   )	Stemcell Technologies, Ванкувер, Канада	5446
OCT (Оптимальная температура резки)	Сакура, США	4583
микроскоп Olympus BX41 и nbsp;	Olympus America, Центр-Вэлли, Пенсильвания
Раствор ингибитора овомукоидной протеазы	Worthington Biochemical Corporation, США	LK003182
Papain	Worthington Biochemical Corporation, США	LK003176	раствор активации (1,1 мМ ЭДТА, 0,067 мМ меркаптоэтанола, 5,5 мМ L-цистеина HCl)
PBS (Фосфатно-буферный физиологический раствор)	Gibco, США	70011	pH 7,4
PFA (параформальдегид) 4%	Invitrogen, США	FB002
Купат	Бэнкхед, П. и др.  QuPath: Открытое программное обеспечение для анализа цифровых патологических изображений.  Научные отчёты  (2017).	https://doi.org/10.1038/s41598-017-17204-5	Программное обеспечение для анализа биовизуализации
Таймлапс-микроскоп
Колбы для культуры тканей	Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс	FB012937
Trypsin	Gibco, США	A12859-01	0,25% трипсина и 0,1% ЭДТА в HBSS без кальция или магния
VECTASHIELD Antifade Mount Medium с DAPI	Vector Laboratories, Калифорния, США	#  UX-93952-24	1  ng/mL