Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Мышиная модель эпикутанно-индуцированной иммуномодуляции

836 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/67578

⸱

24 июня 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medical Physiology, Chair of Biomedical Sciences, Institute of Physiotherapy, Faculty of Health Sciences, Jagiellonian University Medical College, 2Department of Clinical Immunology, Wroclaw Medical University, 3Chair of Biomedical Sciences, Faculty of Health Sciences, Jagiellonian University Medical College

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Исследование демонстрирует роль кожи в модуляции иммунных реакций у мышей посредством эпикутанной (ЭК) иммунизации. Иммунизация ЭК белковым антигеном может подавлять иммунные реакции при контактной гиперчувствительности или обращать вспять кожное подавление в сочетании с патоген-ассоциированными молекулярными паттернами. Иммунизация ЭК является перспективным эффективным безыгольным подходом к иммунотерапии.

Аннотация

Кожа, как самый большой орган в организме человека, взаимодействующий с внешней средой, играет важнейшую физиологическую роль, в том числе (1) защищает организм от ксенобиотиков и микроорганизмов, (2) способствует терморегуляции, (3) поддерживает водный и электролитный баланс, (4) синтезирует витамин D и (5) участвует в иммунитете. В этой статье подчеркивается ключевое участие кожи в иммунологических механизмах, демонстрируя ее способность к иммуномодуляции путем подавления или потенцирования иммунного ответа. Предыдущие результаты показали, что у мышей эпикутанная иммунизация (ЭК) антигеном, либо отдельно, либо в сочетании с патоген-ассоциированными молекулярными паттернами (PAMP), может подавлять или потенцировать иммунные реакции соответственно. В частности, было замечено, что иммунизация ЭК антигеном может подавлять иммунные реакции при различных мышиных моделях аутоиммунных заболеваний или аллергического контактного дерматита. Результаты показывают, что иммунизация ЭК антигеном в сочетании с PAMP может служить эффективной стратегией для повышения иммунитета против патогенов или облегчения аллергии на Т-хелперы типа 2 типа (Th2). В этом протоколе описан метод индуцирования подавления кожи путем эпикутанного введения антигена в мышиной модели аллергического контактного дерматита человека (АХД) – контактной гиперчувствительности (CHS), опосредованной клетками Th1. Тем не менее, его также можно применять к различным моделям мышиных заболеваний. В статье представлена ЭК-индуцированная иммуномодуляция как привлекательная мышиная модель для безыгольной иммунотерапии при различных заболеваниях.

Введение

В данной статье представлен метод индуцирования толерантности (далее в тексте «подавление») в мышиной модели контактной гиперчувствительности (CHS) и обратного изменения этой толерантности (далее в тексте «контраблапция») путем эпикутанного (ЭК) применения антигена отдельно или в комбинации с лигандами для рецепторов распознавания патогенов (PRR) соответственно1. В описанном протоколе (а) гаптенизированные иммуноглобулины мыши (TNP-Ig) используются в качестве антигена для подавления контактной гиперчувствительности или (б) антиген с патоген-ассоциированными молекулярными паттернами (PAMP), лигандами для Toll-подобных рецепторов (TLR) и нуклеотид-связывающими олигомеризационными доменоподобными белок-подобными рецепторами (NOD)-подобными рецепторами (NLR) для устранения кожного подавления 2,3,4. Полученные данные свидетельствуют о том, что ЭК-индуцированная иммуномодуляция опосредована антиген-неспецифическими клетками Т-супрессора (Тс) и антиген-специфическими клетками Т-контрасупрессора (Тс). Эти клетки могут быть исследованы на мышиной модели адоптивного переноса клеток для определения механизма тестируемых реакций. Текущий протокол описывает две модели переноса клеток: «адцептивный перенос внутрь» и «адцептивный перенос наружу». Адоптивный перенос ИН полезен для тестирования иммуномодуляции в афферентной и эфферентной фазах CHS. С другой стороны, «адоптивный перенос OUT» отражает эффект иммуномодуляции только в эфферентной фазе CHS.

В статье описан метод кож-индуцированной супрессии путем эпикутанного введения антигена в мышиной модели аллергического контактного дерматита (АХД) человека - контактной гиперчувствительности (СЧС), опосредованной лимфоцитами Т-хелперов 1-го типа (Th1)5. Тем не менее, этот подход также был проверен на его эффективность в регуляции (подавлении, толерантности) экспериментальных моделях Т-цитотоксических лимфоцитов типа 1 (Tc1)-опосредованного CHS 6,7, аутоиммунных заболеваний, таких как коллаген-индуцированный артрит (CIA)8,9, экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (EAE)10,11 и язвенный колит12. Кроме того, в протоколе описан метод кож-индуцированной контрасупрессии (обратного подавления) путем применения антигена ЕС вместе с лигандами PRR на мышиной модели CHS 13,14,15,16. Представленные результаты свидетельствуют о том, что ЭК-индуцированное подавление антиген-неспецифических антител может быть обращено вспять путем очистки лигандов TLR2, TLR3, TLR4, TLR9 и NOD2. Метод кожно-индуцированной контрасупрессии также был использован на животной модели атопического дерматита (БА), показав, что лечение ЭК антигеном в присутствии синтетических одноцепочечных молекул ДНК, содержащих неметилированные олигодезоксинуклеотиды (CpG) - лиганд для TLR9 может подавлять Th2-опосредованные ответы антиген-специфичным образом (сдвигает иммунный ответ в сторону фенотипа Th1/Th17)17. Описанный метод также был протестирован при пневмококковой пневмонии, продемонстрировав, что иммунизация ЭК пневмококковым полисахаридом, конъюгированным с бычьим сывороточным альбумином (PC-BSA), вместе с CpG потенциально может повысить иммунитет к Streptococcus pneumoniae18.

Ключевым аспектом иммуномодуляции, вызванной ЭК, является выбор модели и природы антигена. Статья включает таблицу с подробным описанием используемых антигенов, продолжительности воздействия антигена и специфичности Т-клеток тестируемых моделей (см. таблицу 1). Описанный метод иммуномодуляции направлен на заболевания с вовлечением антиген-специфических Т-лимфоцитов. Эффективность этого метода оценивали путем использования в процессе совместимого ЕС-применяемого антигена. Совместимость антигена имеет решающее значение для обеспечения его эффективного взаимодействия с Т-лимфоцитами, участвующими в процессе заболевания. Нанесение белкового или пептидного пластыря на неповрежденную кожу способствует проникновению антигена через эпидермис19,20. Это повышенное проникновение антигена объясняется повышенным потоотделением под повязкой. Изменения проницаемости эпидермиса происходят в течение 4-10 ч после наложения пластыря, в то время как иммуномодуляция, индуцированная ЕС, может оставаться эффективной до двух недель 5,14.

Несмотря на то, что лечение ЭК широко используется, существование многих вариаций этого метода может вызвать вопросы. Современные представления свидетельствуют о том, что степень повреждения эпидермиса до введения антигена может влиять на характер результирующего иммунногоответа. Поверхностное повреждение эпидермиса вызывает высвобождение противовоспалительных цитокинов клетками Лангерганса, способствуя инициированию ответа Th222. Напротив, более обширное повреждение эпидермиса способствует высвобождению провоспалительных цитокинов и облегчает доставку антигена к дермальным дендритнымклеткам. В представленном протоколе подчеркивается (а) выявление проблем при применении этого метода у мелких и активных животных, особенно у мышей; (b) учет таких факторов, как состояние кожи после бритья бритвой, надлежащий контакт веществ с кожей, время воздействия и гигиенические условия кожи во время лечения ЭК, которые могут определить эффективность лечения. Перед применением антигена крайне важно рассмотреть метод депиляции кожи, будь то физический или химический, так как различные препараты кожи могут по-разному влиять на состояние кожи. Признано, что все эти процедуры могут активировать иммунные клетки кожи, что потенциально может привести к кожным инфекциям или повлиять на прогрессирование заболевания. Потенциальные побочные эффекты на состояние кожи после депиляции должны быть основным фактором при выборе метода депиляции. Исследователи описали метод подавления иммунитета, опосредованного Т-клетками, индуцированного путем нанесения антигена на выбритую бритвой кожу тыльной стороны, продемонстрировав его влияние на различные модели иммунных реакций мышей. Применение антигена в качестве ЭК, наряду с PAMP, индуцирует антиген-специфические Т-контрасупрессорные клетки. Кроме того, представленный способ применения ЭК, особенно при повторном воздействии антигенов или PAMP, не вызывает вызывающих беспокойства побочных эффектов.

Описанный протокол подчеркивает важность различных факторов для достижения надежных и воспроизводимых результатов с помощью этого метода, особенно у мелких животных, таких как мыши. Неинвазивный характер этого подхода обычно приводит к более низкому риску побочных реакций (таких как боль, инфекция или рубцевание) по сравнению с внутрикожными или инъекционными методами иммунизации. Эпикутанная иммунизация удобна в использовании и легко проводится в доклинических условиях, что повышает доступность и соблюдение режима лечения по сравнению с более инвазивными методами.

Таблица 1: ЭК-индуцированная модуляция иммунного ответа в различных моделях заболеваний мышей. Сокращения: ACD = аллергический контактный дерматит; AD = атопический дерматит; Ag = антиген; CIA = коллаген-индуцированный артрит; CHS = контактная гиперчувствительность; CFA = полный адъювант Фрейнда; COLL II = коллаген II типа; DNFB = 2,4-динитрофторбензол; DNP-BSA = динитрофенил, конъюгированный с бычьим сывороточным альбумином; EAE = экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит; EC = эпикутанный; ЛПС = липополисахарид; OVA = овальбумин; PAMP = патоген-ассоциированный молекулярный паттерн; PC-BSA = пневмококковый полисахарид, конъюгированный с бычьим сывороточным альбумином; Th1 = Т-хелпер типа 1 лимфоцит; Tc1 = Т-цитотоксический лимфоцит 1-го типа; TNCB = 2,4,6-тринитрохлорбензол; TNP-Ig = 2,4,6-тринитрофенил-конъюгированные иммуноглобулины мыши; Ts = клетки-супрессоры типа T; Tcs = Т-контрасупрессорные клетки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все эксперименты, представленные в этой статье, были одобрены и проведены в соответствии с рекомендациями1-го и2-го Местных этических комитетов по испытаниям на животных в Кракове, Польша. Процедуры соответствовали местным рекомендациям, в частности, в отношении введения кетамина/ксилазина или изофлурана в качестве анестетиков, бритья кожи мыши с помощью бритвенных лезвий, нанесения веществ/гаптенов на выбритую кожу и обе стороны уха, а также сбора периферических иммунных органов. В исследовании использовались самцы и самки мышей CBA/J (H-2k) в возрасте 6-12 недель с массой тела от 20 до 25 г. Подробная информация об используемых реагентах и оборудовании приведена в Таблице материалов.

1. Подготовка животных

  1. Домашние мыши вместе; Важно не допустить негативного влияния изоляции на их настроение. Для статистической значимости используйте 10-12 животных в группе.

2. Подготовка операционной зоны

  1. Очищайте операционный стол 70% раствором этанола до и после всех процедур. Если использование мышей требует стерильных условий, проводите все операции в шкафу биобезопасности.

3. Индукция супрессорных клеток (Ts) для Th1-опосредованной CHS реакции

ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура показана на рисунке 1А.

  1. В день "0" проводят обезболивание мышей 30% изофлураном в пропиленгликоле. Держите мышь в левой руке, обнажая тыльную сторону ее тела. Правой рукой вспеньте серое мыло с обильным количеством воды и нанесите его на кожу.
    1. Стерильным лезвием бритвы аккуратно выбрейте участок кожи площадью 2 см². Избегайте травмирования кожи. Любые повреждения кожи дисквалифицируют мышей от дальнейших процедур.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Серое мыло является натуральным и гипоаллергенным продуктом, изготовленным из нежной растительной основы. Эффективно регенерирует и увлажняет сухую и чувствительную кожу. Это мыло не содержит искусственных красителей, синтетических ароматизаторов или ингредиентов животного происхождения. Ингредиенты включают пальмат натрия, ядра пальмы натрия, воду (воду), глицерин, экстракт цветков/листьев/стеблей Taraxacum Officinale (одуванчик), пальмовую кислоту, пальмоядровую кислоту, хлорид натрия, пропиленгликоль, тетранатрий ЭДТА, этидроновую кислоту. Серое мыло предназначено для чувствительной и нежной кожи, склонной к раздражениям и псориазу. Он эффективно очищает проблемную кожу, предотвращая чрезмерную сухость и чувство стянутости. Это мыло также успокаивает раздражения, увлажняет и способствует более быстрой регенерации кожи. Важно отметить, что он не нарушает защитный барьер кожи.
  2. Поместите мышей в клетку. После бритья подождите не менее шести часов, прежде чем наносить антиген, чтобы позволить коже высохнуть и быть очищенной животным.
  3. В день «+1» готовят раствор антигена 2,4,6-тринитрофенил-конъюгированного иммуноглобулина мыши (TNP-Ig) в дозе 1 мг/мл в стерильном фосфатно-солевом буфере Дульбекко (DPBS). Приготовьте объем антигена 1200 мкл для десяти мышей. Смешайте растворы непосредственно перед применением во флаконе объемом 2 мл. Защитите TNP-Ig от света, накрыв флакон алюминиевой фольгой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Включите контрольную группу CHS мышей, получавших только носитель (DPBS), для оценки неспецифических воспалительных реакций, вызванных бритьем и нанесением растворителя на выбритое место. Для индукции Ts следует использовать другой тип антигена, чтобы проверить его антигенную специфичность. Мышиные иммуноглобулины (Ig) получали из сывороток мышей и конъюгировали с TNP гаптеном (Дополнительный файл 1). В течение24,25 года использовали один препарат с уровнем замещения 40 TNP на молекулу Ig (TNP40-Ig).
  4. В тот же день обезболите мышей 30% изофлураном в пропиленгликоле. Нанесите антиген на ранее выбритое место, поместив марлевый пластырь толщиной 1см2 , смоченный в 100 мкл антигена (подготовлен на шаге 3.3). Накройте его тонкой пластиковой заплаткой (2 см²) и закрепите тканевой лентой. В контрольной группе CHS применяйте только DPBS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для пластиковой нашивки можно использовать прозрачные конверты для документов размером 30 мкм. Тканевая клейкая лента должна быть легко снимаемой, гибкой, соответствовать формам тела, пропускать воздух и водяной пар.
  5. В день «+5» обезболите мышей 30% изофлураном в пропиленгликоле. Аккуратно разрежьте пластырь безопасными ножницами с закругленными углами, затем аккуратно снимите скотч. Дайте мышам свободно двигаться и естественным образом очищайте кожу в течение как минимум 4 часов. При необходимости сбрейте отросшие волосы в месте нанесения антигена, хотя обычно это не требуется.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Режьте лейкопластырь только в области введения антигена (марлевая и пластическая область), где она плотно прилегает только по краям бинта. Подождите не менее 4 часов перед нанесением антигена, чтобы дать коже высохнуть и быть очищенной животным.
  6. В день «+5» повторите шаг 3.3 и шаг 3.4.
  7. В день «+8» повторите шаг 3.5. Это знаменует собой завершение недельного воздействия антигена на кожу. По истечении этого периода используйте мышей для тестирования подавления реакции CHS -in vivo активных моделей (шаг 6) или усыпляйте их, чтобы они служили донорами Ts-клеток в «адоптивном переносе IN» (шаг 8) или в «адоптивном переносе OUT» (шаг 9).

4. Индукция контрасупрессорных Т-клеток (Tcs) для Th1-опосредованной реакции CHS

ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура показана на рисунке 1B.

  1. В день «0» выполнить шаги 3.1-3.2.
  2. В день «+1» приготовьте смесь из 100 мкг антигена TNP-Ig и 100 мкг ЛПС (пример PAMP) в 100 мкл DPBS. Приготовьте раствор непосредственно перед применением во флаконе объемом 2 мл и защитите его от света, обернув флакон алюминиевой фольгой, если антиген светочувствительный.
    Примечание: Для оценки контрасупрессии (отмены кожного подавления) необходимо включить контрольную группу для подавления (контрольную группу Ts), где мышей лечат только антигеном TNP-Ig. Кроме того, следует включить мышей, получавших только DPBS (контроль CHS) и только LPS (контроль PAMP), чтобы определить степень неспецифической модуляции иммунных реакций. ЛПС является примером иммуностимулирующей частицы26. Конкретные характеристики любого иммунного стимулятора зависят от используемой модели мыши, типов иммунных клеток, участвующих в изучаемом иммунном ответе, и фармакокинетики исследуемых веществ.
  3. В тот же день обезболите мышей 30% изофлураном в пропиленгликоле. На предыдущую выбритую кожу наложите марлевый пластырь размером 1 см2 см, пропитанный раствором, содержащим 100 мкл смеси (приготовленной на шаге 4.2). Закрепите марлю тонкой пластиковой заплаткой (2 см²) и закрепите ее на месте с помощью тканевого лейкопластыря. В контрольных группах применяйте DPBS (контроль CHS) или LPS (контроль PAMP), или только TNP-Ig (контрольная группа Ts).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для пластиковой нашивки можно использовать прозрачные конверты для документов размером 30 мкм. Тканевая клейкая лента должна быть легко снимаемой, гибкой, соответствовать формам тела, пропускать воздух и водяной пар.
  4. В день «+5» выполните шаг 3.5.
  5. В день «+5» повторите шаги 4.2-4.3.
  6. В день «+8» повторите шаг 3.5. Неделя воздействия на кожу антигена, смешанного с ЛПС, завершена. По истечении этого периода мышей тестируют в активных моделях реакции CHS - in vivo (шаг 6) или усыпляют для использования в качестве доноров клеток Tcs в "адоптивном переносе OUT" (шаг 10).

5. Индукция Т-эффекторных клеток (Teff) для Th1-опосредованной реакции CHS (фаза сенсибилизации CHS)

  1. В день «0» побрейте грудь и брюшную полость мышей (площадью от 2 × 2 см) с помощью серого мыла с последующим лезвием бритвы. Дайте коже отдохнуть в течение 6 часов перед нанесением гаптена, чтобы убедиться в отсутствии раздражения.
  2. В тот же день, непосредственно перед применением, приготовьте раствор гаптена (5%) в стеклянном флаконе и накройте его алюминиевой фольгой для защиты от света: 2,4,6-тринитрохлорбензол (ТНКБ) в ацетон-этаноловой смеси (соотношение 1:3).
  3. В тот же день проведите сенсибилизацию мышей, нанеся 150 мкл гаптена на ранее выбритое место. Применяют отдельно транспортное средство (смесь ацетона и этанола) в группе отрицательного контроля для оценки неспецифической воспалительной реакции. Прежде чем вернуть животное в клетку, подождите 30 с, чтобы кожа высохла.
    ВНИМАНИЕ: Используйте перчатки; ТНКБ вызывает тяжелые аллергические реакции у большинства людей.

6. Активная модель: тестирование Ts- или Tcs-клеток в Th1-опосредованном CHS

ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура показана на рисунке 2.

  1. Индуцируйте клетку Ts или Tcs, следуя шагам 3 и 4. Эта процедура продлится с дня "0" до дня "+8".
  2. В день «+8» начните индуцировать клетки Teff, следуя шагу 5.
  3. Через четыре дня оцените ответ CHS, выполнив фазу выявления (провокационную фазу). Короче говоря, наносите TNCB на обе стороны ушей. Затем количественно оцените толщину ушей, измерив их микрометром. Подробное описание этого теста и других возможных конечных точек приведено в другом месте (Zemelka-Wiacek M. et al.27).

7. Выделение клеток Teff, Ts или Tcs от мышей-доноров

  1. Стерилизуйте операционный стол 70% раствором этанола как до, так и после каждой процедуры. Проводите все процедуры в шкафу биобезопасности для поддержания стерильности и используйте стерилизованные инструменты. Для выделения клеток Ts, Tcs и Teff в день «+8» используют EC-иммунизированных мышей, описанных в шагах 3, 4 и 5 соответственно.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Придерживайтесь соотношения доноров и получателей 1:1.
  2. Обезболивайте доноров внутрибрюшинным (в/в) введением смеси кетамина (90-120 мг/кг) и ксилазина (5-10 мг/кг). Убедитесь, что мышь полностью обезболена не менее 5 минут.
  3. Продезинфицируйте всю область живота мыши, находящейся под наркозом, 70% этанолом, затем надрежьте брюшной слой (3-4 см), чтобы обнажить брюшную полость. Вспомогательные и паховые лимфатические узлы (АЛН) и селезенку (СПЛ) стерильными щипцами изолируют в пробирки, заполненные стерильным ДПБС, который дополняют 1% фетальной бычьей сывороткой (ФБС). Объедините ALN от всех доноров в одном флаконе и SPL в другом и держите флаконы на льду. Каждая подмышечная впадина содержит два подмышечных лимфатических узла, в то время как один паховый лимфатический узел расположен в области бедра, прилегающей к трем кровеносным сосудам. SPL располагаются на левой стороне тела, за кишечником и желудком.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Работайте со стерильными инструментами под шкафом биобезопасности для поддержания стерильных условий. После этой процедуры мыши должны быть усыплены в соответствии с утвержденными в учреждении протоколами.
    1. Разомните ткань между матовыми концами двух предметных стекол микроскопа. Процедите клеточную суспензию через клеточный фильтр с размером пор 70 мкм.
  4. Промойте клетки 30 мл DPBS с добавлением 1% FBS. Центрифугируйте при 300 x g в течение 10 минут при 4 °C. Удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в 1-5 мл DPBS.
  5. Посчитайте жизнеспособность клетки с помощью гемоцитометра и Trypan Blue. Смешайте 10 μL клеточной суспензии с 90-990 μL Trypan Blue, регулируя объем в зависимости от количества клеток. Включите этот коэффициент разбавления в расчет жизнеспособности.
  6. Приготовьте смесь ALN и SPL (соотношение 1:1). Придерживайтесь количества клеток: используйте от 1 до 5 x 107 T или Tcs клеток на одного реципиента в 1 мл DPBS с добавлением 1% FBS и 7 x 107 Teff клеток на реципиента в 1 мл DPBS. Сохраняйте соотношение донор-реципиент для всех клеточных популяций 1:1, а также соотношение донор-DPBS 1:1. Храните флаконы с ячейками на льду.
    Примечание: Проведение дальнейших экспериментов in vitro требует пропорционального увеличения числа доноров клеток.
    Кроме того, изолированные клетки Teff, Ts и Tcs могут быть подвергнуты дополнительной очистке или анализу с использованием проточной цитометрии, такой как фенотипирование или оценка секреции цитокинов. Также возможно инициирование клеточных культур для изучения способности клеток к пролиферации или количественной оценки уровней цитокинов в надосадочной жидкости культур. Проведение дальнейших экспериментов требует пропорционального увеличения числа доноров клеток.

8. Адоптивный перенос IN: тестирование Ts в Th1-опосредованном CHS

ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура показана на рисунке 3. Работайте стерильно и используйте 70% раствор этанола как до, так и после каждой процедуры. Убедитесь, что все операции с клетками проводятся в шкафу биобезопасности для поддержания стерильности и используйте стерилизованные инструменты.

  1. Индуцируйте и изолируйте Т-клетки (доноров), следуя шагам 3 и 7. Промойте клетки 30 мл DPBS. Центрифугируйте при 300 x g в течение 10 минут при 4 °C. Удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в 200 мкл DPBS на каждого реципиента (соотношение донор-реципиент 1:1).
  2. Реципиенты (наивные сингенные мыши): обезболивают реципиентов внутрибрюшинным (в/в) введением смеси кетамина (90-120 мг/кг) и ксилазина (5-10 мг/кг). Убедитесь, что мышь полностью обезболена не менее 5 минут.
  3. Внутривенное введение (в/в) приготовленной смеси 1-5 x 107 Тл-клеток (шаг 8.2) в 200 мкл реципиенту, находящемуся под наркозом.
  4. В тот же день индуцируют Th1-опосредованную реакцию CHS. Вкратце, индуцировать Teff-клетку (фаза сенсибилизации), описанная в шагах 5.1-5.3). Через четыре дня оцените ответ CHS, выполнив фазу выявления (провокацию), описанную в шаге 6.3.

9. Адоптивный перенос OUT: тестирование Ts в Th1-опосредованном CHS

  1. Индуцируйте и изолируйте Ts и Teff клетки (доноры), выполнив шаги 3, 5 и 7. Храните изолированные T и Teff в двух отдельных флаконах. Разделите клетки Teff на два флакона: один для «Тестовой группы Ts» и один для «Контрольной группы CHS».
    ПРИМЕЧАНИЕ: Работайте стерильно и используйте 70% раствор этанола как до, так и после каждой процедуры. Убедитесь, что все операции с клетками проводятся в шкафу биобезопасности для поддержания стерильности и используйте стерилизованные инструменты. Включите контрольную группу реципиентов, которым будут вводиться только клетки Teff («контроль CHS»). Для этой группы следует использовать дополнительных доноров, чтобы придерживаться соотношения доноров и реципиентов 1:1. Для повышения качества результатов следует добавить реципиенты, получающие контрольные клетки, перенесенные от доноров, обработанных раствором растворителя ЕС. Решение о добавлении какой-либо дополнительной группы реципиентов и доноров должно быть тщательно спланировано, потому что такой подход требует большого количества мышей, что не соответствует принципу 3R (Reduce, Refine, Replace).
  2. Добавьте Ts-клетки к ячейкам Teff для "Ts-тестовой группы". Добавьте достаточное количество DPBS к ячейкам Teff во флаконе «CHS control».
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сохраняйте количество ячеек 1-5 x 107 Ts и 7 x 10ячеек 7 Teff на одного получателя.
  3. Аккуратно перемешайте все флаконы. Держите флаконы на водяной бане (37 °C) в течение 30 минут, осторожно перемешивая каждые 5 минут.
  4. Промойте каждый флакон клеток 30 мл DPBS с добавлением 1% FBS. Центрифугируйте при 300 x g в течение 10 минут при 4 °C. Сцедите надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулы клеток в 200 мкл DPBS/реципиент.
  5. Пропустите каждую клеточную суспензию через пористый сетчатый фильтр размером 70 мкм. При необходимости отрегулируйте объем 200 μL DPBS/реципиент.
  6. Реципиенты (наивные сингенные мыши): обезболивают реципиентов внутрибрюшинным (в/в) введением смеси кетамина (90-120 мг/кг) и ксилазина (5-10 мг/кг). Убедитесь, что мышь полностью обезболена не менее 5 минут.
  7. Ввести внутривенное (в/в) введение подготовленных клеток.
  8. В тот же день индуцируйте фазу выявления CHS (провокационная провокация), описанную в шаге 6.3. Включить «негативный контроль», где проводить только CHS challenge.

10. Адоптивный перенос OUT: тестирование Tcs в Th1-опосредованном CHS

  1. Индуцируйте и изолируйте клетки Ts, Tcs и Teff (доноры), следуя шагам 3-5 и шагу 7.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Работайте стерильно и используйте 70% раствор этанола как до, так и после каждой процедуры. Убедитесь, что все операции с клетками проводятся в шкафу биобезопасности для поддержания стерильности и используйте стерилизованные инструменты. Включите две контрольные группы реципиентов: «контрольную CHS», в которой будут вводиться только клетки Teff, и контрольную группу Tes, в которой клетки Teff будут инкубироваться исключительно с T-клетками. Для этих групп используйте дополнительных доноров, чтобы придерживаться соотношения доноров и реципиентов 1:1.
  2. Изолированные клетки Ts и Tcs хранят в отдельных флаконах. Разделите ячейки Teff на три флакона: один для «тестовой группы Tcs», один для «контроля Ts» и один для «контроля CHS».
  3. Первая инкубация: Для (а) "Тестовой группы Tcs" добавьте клетки Tcs к клеткам Teff. Для (b) "Контроль Ts" и (c) "Контроль CHS" добавьте достаточное количество DPBS к ячейкам Teff (см. Таблицу 2).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сохраняйте количество ячеек 1-5 x 107 Tcs и 7 x 10ячеек 7 Teff на одного получателя.
  4. Аккуратно перемешайте все флаконы. Держать на водяной бане (37 °C) 30 минут, осторожно перемешивая каждые 5 минут.
  5. Промойте каждый флакон клеток 30 мл DPBS с добавлением 1% FBS. Центрифугируйте при 300 x g в течение 10 минут при 4 °C. Сцедите надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулы клеток в 1 мл DPBS с добавлением 1% FBS на каждого реципиента. Поддерживайте соотношение клеточной смеси и DPBS 1:1.
  6. Вторая инкубация: Для (а) «Тестовой группы Tcs» добавьте Ts-клетки в смесь предварительно инкубированных Teff и Tcs-клеток. Для (b) "Контроль Ts" добавьте Ts-клетки в смесь предварительно инкубированных клеток Teff с DPBS. Для (c) "CHS control" добавьте достаточное количество DPBS в предварительно инкубированные клетки Teff.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сохраняйте количество 1-5 x 107 Ts клеток на одного получателя. Проводите инкубацию во всех экспериментальных группах (a, b и c) для обеспечения равномерности потери клеток во время процедур промывки и центрифугирования.
  7. Аккуратно перемешайте все флаконы. Держать на водяной бане (37 °C) 30 минут, осторожно перемешивая каждые 5 минут.
  8. Промойте каждый флакон клеток 30 мл DPBS. Центрифугируйте при 300 x g в течение 10 минут при 4 °C. Сцедите надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулы клеток в 200 мкл DPBS/реципиент.
  9. Пропустите каждую клеточную суспензию через пористый сетчатый фильтр размером 70 мкм. При необходимости отрегулируйте объем 200 μL DPBS/реципиент.
  10. Реципиенты (наивные сингенные мыши): обезболивают реципиентов внутрибрюшинным (в/в) введением смеси кетамина (90-120 мг/кг) и ксилазина (5-10 мг/кг). Убедитесь, что мышь полностью обезболена не менее 5 минут.
  11. Ввести внутривенное (в/в) введение подготовленных клеток.
  12. В тот же день индуцируйте фазу выявления CHS (провокационная провокация), описанную в шаге 6.3. Включить «негативный контроль», где проводить только CHS challenge.

Таблица 2: График инкубации клеток во время Tcs "transfer OUT". Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

В этом исследовании изучается, могут ли антигены, вводимые через кожу отдельно или в сочетании с PAMP, индуцировать клетки Ts или Tcs соответственно, которые модулируют реакцию CHS. Иммунизация мышей с CBA/J через ЭК 100 мкг TNP-Ig или TNP-Ig плюс 100 мкг ЛПС индуцирует клетки Ts или Tcs соответственно. Затем мышам ввели сенсибилизацию 5% TNCB и через 4 дня ввели тот же гаптен. Реакцию оценивали путем измерения отека уха до и после провокации. Каждый эксперимент имеет о...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Исследования проводились на многих различных животных моделях и с использованием многих штаммов мышей, таких как BALB/c, C57BL/6, HLADR4-Tg, DBA 1 и B10.PL и SJL, демонстрируют, что иммунизация ЭК назначенным антигеном может служить универсальным и потенциально безграничным средством создания толерантности и контроля нежелательных иммунных реакций. В настоящем протоколе описаны две модели переноса клеток: (1) «адцептивный перенос IN», который полезен для оценки иммуномодуляции во время к...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Данное исследование было поддержано грантами Польского комитета научно-исследовательских грантов 3 PO5B 091 25, 2PO5A 204 29 и Национального научного центра N N401 3554 33 до M.S. Графики были построены с помощью программного обеспечения GraphPad Prism 10.2.3, а рисунки 1-3 были созданы в BioRender. Земелька-Вячек, М. (2025): (1) https://BioRender.com/3ux2px ; (2) https://BioRender.com/s0y8zs7 ; (3) https://BioRender.com/0qziglw. Авторы благодарят Дороту Возняк за заботу о колониях мышей.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
2,4,6-тринитрохлорбензол (TNCB)Tokyo Chemical Industry CO., Ltd, ЯпонияC0307
2,4,6-тринитрофенилконъюгированный иммуноглобулин мышей (TNP-Ig)Заведующий кафедрой биомедицинских наук, факультет медицинских наук Ягеллонского университета, Краков, Польша
ацетон (реагент ACS, ≥ 99.5%)Merck KGaA, Дармштадт, Германия179124
Алюминиевая фольгаMerck KGaA, Дармштадт, ГерманияZ185140   
аналитический баланс  Sartorius Weighing Technology GmbH, Гёттинген, ГерманияPRACTUM224-1, 29105177
Бычий сывороточный альбумин (BSA)Merck KGaA, Дармштадт, ГерманияA9418
CBA/J (H-2k) Селекционное подразделение кафедры биомедицинских наук, факультет медицинских наук Ягеллонского университета, Краков, Польша
Клеточное сито, поровый размер 70 и MU; mBIOLOGIX, Китай15-1070
Ёмкость одноразовых пипеток: 5 мл, 10 мл, 25 млMerck KGaA, Дармштадт, ГерманияZ740301, Z740302, Z740303
Dulbecco и Prime; Солёный раствор, буферированный фосфатом (DPBS)ThermoFisher Scientific,  Уолтем, Массачусетс, США14190144
Трубки Eppendorf Safe-Lock 1,5 млЭппенфорф, Германия30120086
Трубки с безопасным замком Eppendorf, 2,0 млЭппенфорф, Германия30120094
Этанол 100% (абсолютный спирт)Merck KGaA, Дармштадт, Германия1.07017
этанол 96%Merck KGaA, Дармштадт, Германия1.59010
Сыворотка для плода крупного рогатого скота (FBS)ThermoFisher Scientific,  Уолтем, Массачусетс, СШАA3160802
Стеклянные микроскопические стекла (пескоструйная одиночная матовая обработка)ThermoScientific, Портсмут, Нью-Гэмпшир, США421-004T
Граф-Пад ПризмаGraphPad Software Inc.ст. 10.2.3
серое мыло (мыло Bialy jelen)Pollena Ostrzeszó w, продюсер Chemii Gospodarczej Sp. Z.o.o., Sp. K., Польша163057
ГемоцитометрVWR, Авантор, США612-5719
Инкубатор Heracell 150iThermo Electron  LED Gmbh, Германия41071068
изофлуран (Эрран)Бакстер, Дирфилд, Иллинойс, США8AGG9623
кетамин 100 мг/мл, раствор для инъекцииBiowet Pulawy Sp. z o.o., Пулавы, Польшакот.# недоступно
Лабораторная центрифуга (Фреска Герея 21)Thermo Scientific, Германия75002425
лабораторная центрифуга (Heraeus Megafuge 1.0R)  Thermo Scientific, ГерманияB00013899
Липополисахарид (LPS)Merck KGaA, Дармштадт, ГерманияL-8274
Маска (FFP2)VWR, Раднор, Пенсильвания, США111-0917
МикрометрМитутойо, Токио, Япония193-111
Микроскоп с объективамиLeica Microsystems CMS GmbH, ГерманияDM1000, 294011-082007
пропиленгликоль и bbsp;Чемпур, Пиекари figure-materials-1 Польша114489005
Лезвие бритвыVWR, Раднор, Пенсильвания, СШАPERS94-0462
прозрачные конверты для документов 30 и микро; mШЕМАТ5906961126542
Трипан-синийMerck KGaA, Дармштадт, ГерманияT8154
трубки 15 мл стерильнойMerck KGaA, Дармштадт, ГерманияCLS430055 (Корниниг)
трубки 50 мл, стерильныеMerck KGaA, Дармштадт, ГерманияCLS430290 (Corning)
флаконы, крышка с винтом, прозрачное стекло (только флаконы) 22 млMerck KGaA, Дармштадт, Германия27173
Viscoplast Polovis, шёлковый клей, 5x0,0125м3M Poland, Надэржин, Польша7100231620
водяная баня AJL Electronic, ПольшаLW102
раствор ксилазина (ксилапан 20 мг/мл) для инъекцийVetoquinol Biowet Sp. z o.o., Gorzow Wielkopolski, Польшакот.# недоступно

Ссылки

  1. Szczepanik, M., Majewska-Szczepanik, M. Transdermal immunotherapy: Past, present and future. Pharmacol Rep. 68 (4), 773-781 (2016).
  2. Majewska-Szczepanik, M., et al. Epicutaneous immunization with hapten-conjugated protein antigen alleviates contact sensitivity mediated by three different types of effector cells. Pharmacol Rep. 64 (4), 919-926 (2012).
  3. Majewska, M., et al. Role of TLR ligands in epicutaneously induced contrasuppression. Pharmacol Rep. 61 (3), 539-549 (2009).
  4. Ptak, W., et al. Toll-like receptor ligands reverse suppression of contact hypersensitivity reactions induced by epicutaneous immunization with protein antigen. Int Arch Allergy Immunol. 139 (3), 188-200 (2006).
  5. Szczepanik, M., et al. Epicutaneous immunization induces alphabeta T-cell receptor CD4 CD8 double-positive non-specific suppressor T cells that inhibit contact sensitivity via transforming growth factor-beta. Immunology. 115 (1), 42-54 (2005).
  6. Majewska-Szczepanik, M., Zemelka-Wiącek, M., Ptak, W., Wen, L., Szczepanik, M. Epicutaneous immunization with DNP-BSA induces CD4+ CD25+ Treg cells that inhibit Tc1-mediated CS. Immunol Cell Biol. 90 (8), 784-795 (2012).
  7. Zemelka-Wiącek, M., Majewska-Szczepanik, M., Ptak, W., Szczepanik, M. Epicutaneous immunization with protein antigen induces antigen-non-specific suppression of CD8 T cell mediated contact sensitivity. Pharmacol Rep. 64 (6), 1485-1496 (2012).
  8. Marcińska, K., Majewska-Szczepanik, M., Maresz, K. Z., Szczepanik, M. Epicutaneous Immunization with Collagen Induces TCRαβ Suppressor T Cells That Inhibit Collagen-Induced Arthritis. Int Arch Allergy Immunol. 166 (2), 121-134 (2015).
  9. Marcińska, K., et al. Epicutaneous (EC) immunization with type II collagen (COLL II) induces CD4(+) CD8(+) T suppressor cells that protect from collagen-induced arthritis (CIA). Pharmacol Rep. 68 (2), 483-489 (2016).
  10. Majewska, M., et al. Epicutaneous immunization with myelin basic protein protects from the experimental autoimmune encephalomyelitis. Pharmacol Rep. 59 (1), 74-149 (2007).
  11. Tutaj, M., Szczepanik, M. Epicutaneous (EC) immunization with myelin basic protein (MBP) induces TCRalphabeta+ CD4+ CD8+ double positive suppressor cells that protect from experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). J Autoimmun. 28 (4), 208-215 (2007).
  12. Majewska-Szczepanik, M., et al. Epicutaneous immunization with protein antigen TNP-Ig alleviates TNBS-induced colitis in mice. Pharmacol Rep. 64 (6), 1497-1504 (2012).
  13. Majewska, M., et al. TCRalphabeta + CD8+ and TCRgammadelta+ lymphocytes inhibit the capability of peritoneal macrophages to induce contact hypersensitivity. Folia Biol (Krakow). 57 (1-2), 23-27 (2009).
  14. Ptak, W., et al. Epicutaneous immunization with protein antigen in the presence of TLR4 ligand induces TCR alpha beta+CD4+ T contrasuppressor cells that reverse skin-induced suppression of Th1-mediated contact sensitivity. J Immunol. 182 (2), 837-850 (2009).
  15. Majewska-Szczepanik, M., Strzepa, A., Marcińska, K., Wen, L., Szczepanik, M. Epicutaneous immunization with TNP-Ig and Zymosan induces TCRαβ+ CD4+ contrasuppressor cells that reverse skin-induced suppression via IL-17A. Int Arch Allergy Immunol. 164 (2), 122-136 (2014).
  16. Majewska-Szczepanik, M., Dorożyńska, I., Strzępa, A., Szczepanik, M. Epicutaneous immunization with protein antigen TNP-Ig and NOD2 ligand muramyl dipeptide (MDP) reverses skin-induced suppression of contact hypersensitivity. Pharm Rep. 66 (1), 137-142 (2014).
  17. Majewska-Szczepanik, M., Askenase, P. W., Lobo, F. M., Marcińska, K., Wen, L., Szczepanik, M. Epicutaneous immunization with ovalbumin and CpG induces TH1/TH17 cytokines, which regulate IgE and IgG2a production. J Allergy Clin Immunol. 138 (1), 262-273 (2016).
  18. Majewska-Szczepanik, M., Yamamoto, N., Askenase, P. W., Szczepanik, M. Epicutaneous immunization with phosphorylcholine conjugated to bovine serum albumin (PC-BSA) and TLR9 ligand CpG alleviates pneumococcal pneumonia in mice. Pharmacol Rep. 66 (4), 570-575 (2014).
  19. Tan, G., et al. Hydration effects on skin microstructure as probed by high-resolution cryo-scanning electron microscopy and mechanistic implications to enhanced transcutaneous delivery of biomacromolecules. J Pharm Sci. 99 (2), 730-740 (2010).
  20. Mondoulet, L., et al. Epicutaneous immunotherapy on intact skin using a new delivery system in a murine model of allergy. Clin Exp Allergy. 40 (4), 659-667 (2010).
  21. Strid, J., Hourihane, J., Kimber, I., Callard, R., Strobel, S. Disruption of the stratum corneum allows potent epicutaneous immunization with protein antigens resulting in a dominant systemic Th2 response. Eur J Immunol. 34 (8), 2100-2109 (2004).
  22. Callard, R. E., Harper, J. I. The skin barrier, atopic dermatitis and allergy: a role for Langerhans cells. TRENDS Immunol. 28 (7), 294-298 (2007).
  23. Eidsmo, L., Martini, E. Human Langerhans Cells with Pro-inflammatory Features Relocate within Psoriasis Lesions. Front Immunol. 22 (9), 300(2018).
  24. McKinney, M. M., Parkinson, A. A simple, non-chromatographic procedure to purify immunoglobulins from serum and ascites fluid. J Immunol Methods. 96 (2), 271-278 (1987).
  25. Methods in Immunology and Immunochemistry by: Curtis A Williams Merrill W. Chase vol. 2 Physical and chemical methods. , Academic Press. Now York. 359(1968).
  26. Wang, G., Wang, Y., Ma, F. Exploiting bacterial-origin immunostimulants for improved vaccination and immunotherapy: current insights and future directions. Cell Biosci. 14 (1), 24(2024).
  27. Zemelka-Wiacek, M., Majewska-Szczepanik, M., Gajdanowicz, P., Szczepanik, M. Contact Hypersensitivity as a murine model of allergic contact dermatitis. J Vis Exp. 26 (187), e64329(2022).
  28. Thomas, W. R., Watkins, M. C., Asherson, G. L. Differences in the ability of T cells to suppress the induction and expression of contact sensitivity. Immunology. 42 (1), 53-59 (1981).
  29. Walczak, A., Siger, M., Ciach, A., Szczepanik, M., Selmaj, K. Transdermal application of myelin peptides in multiple sclerosis treatment. JAMA Neurol. 70 (9), 1105-1109 (2013).
  30. Juryńczyk, M., et al. Immune regulation of multiple sclerosis by transdermally applied myelin peptides. Ann Neurol. 68 (5), 593-601 (2010).
  31. Beaujean, M., et al. The immunological effects of intradermal particle-based vaccine delivery using a novel microinjection needle studied in a human skin explant model. Vaccine. 41 (13), 2270-2279 (2023).
  32. Prins, M. L. M., Prins, C., de Vries, J. J. C., Visser, L. G., Roukens, A. H. E. Establishing immunogenicity and safety of needle-free intradermal delivery by nanoporous ceramic skin patch of mRNA SARS-CoV-2 vaccine as a revaccination strategy in healthy volunteers. Virus Res. 334, 199175(2023).
  33. Brough, H. A., et al. Epicutaneous sensitization in the development of food allergy: What is the evidence and how can this be prevented. Allergy. 75 (9), 2185-2205 (2020).
  34. Paris, J. L., Vora, L. K., Torres, M. J., Mayorga, C., Donnelly, R. F. Microneedle array patches for allergen-specific immunotherapy. Drug Discov Today. 28 (5), 103556(2023).
  35. Bartnikas, L. M., et al. Epicutaneous sensitization results in IgE-dependent intestinal mast cell expansion and food-induced anaphylaxis. J Allergy Clin Immunol. 131 (2), 451-460 (2013).
  36. Leyva-Castillo, J. M., et al. Mechanical skin injury promotes food anaphylaxis by driving intestinal mast cell expansion. Immunity. 50 (5), 1262-1275 (2019).
  37. Amberg, N., Holcman, M., Stulnig, G., Glitzner, E., Sibilia, M. Effects of depilation methods on imiquimod-induced skin inflammation in mice. J Invest Dermatol. 137 (2), 528-531 (2017).
  38. He, X., Jia, L., Zhang, X. The effect of different preoperative depilation ways on the healing of wounded skin in mice. MDPI Animals. 12 (5), 581(2022).
  39. Liu, I. -L., Wang, L. -F. Epicutaneous sensitization with protein antigen. Dermatol Sinica. 30, 154-159 (2012).
  40. Zemelka-Wiącek, M., Majewska-Szczepanik, M., Pyrczak, W., Szczepanik, M. Complementary methods for contact hypersensitivity (CHS) evaluation in mice. J Immunol Methods. 387 (1-2), 270-275 (2013).
  41. Majewska-Szczepanik, M., et al. Obesity aggravates contact hypersensitivity reaction in mice. Contact Dermatitis. 87 (1), 28-39 (2022).
  42. SanMiguel, A. J., Meisel, J. S., Horwinski, J., Zheng, Q., Grice, E. A. Topical antimicrobial treatments can elicit shifts to resident skin bacterial communities and reduce colonization by Staphylococcus aureus competitors. Antimicrob Agents Chemother. 61 (9), e00774-e00817 (2017).
  43. Strzępa, A., Majewska-Szczepanik, M., Lobo, F. M., Wen, L., Szczepanik, M. Broad spectrum antibiotic enrofloxacin modulates contact sensitivity through gut microbiota in a murine model. JACI. 140 (1), 121-133.e3 (2017).
  44. Meisel, J. S., et al. Commensal microbiota modulate gene expression in the skin. Microbiome. 6 (1), 20(2018).
  45. Arildsen, A. W., Zachariassen, L. F., Krych, L., Hansen, A. K., Hansen, C. H. F. Delayed gut colonization shapes future allergic responses in a murine model of atopic dermatitis. Front Immunol. 12, 650621(2021).
  46. Griffin, M. F., desJardins-Park, H. E., Mascharak, S., Borrelli, M. R., Longaker, M. T. Understanding the impact of fibroblast heterogeneity on skin fibrosis. Disease Models & Mechanisms. 13 (6), dmm044164(2020).
  47. Majewska-Szczepanik, M., Strzępa, A., Marcińska, K., Szczepanik, M. Epicutaneous immunization with TNP-Ig antigen induces CD11c+IL-10+ dendritic cells that promote suppression of Th1-mediated contact hypersensitivity in humanized HLA-DR4 transgenic mice. Int Immunopharmacol. 119, 110281(2023).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Эпикутанная иммунизацияпротокол иммуномодуляцииконтактная гиперчувствительностьТ-супрессорные клеткиТ-эффекторные клеткиадоптивный переносиммунитет кожиаллергический контактный дерматитпатоген-ассоциированные молекулярные паттерны
Мышиная модель эпикутанно-индуцированной иммуномодуляции
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.