Методическая статья

Высокопроизводительные автоматизированные мультиплексные иммунофлуоресцентные анализы для трансляционных исследований

DOI:

10.3791/67584

⸱

10 июня 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Ultivue, Inc.

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом отчете описан автоматизированный протокол мультиплексного иммунофлуоресцентного анализа (мИФ) на автоматическом красителе предметного стекла. Он демонстрирует высокую воспроизводимость пространственной протеомики на стандартных высокопроизводительных тканевых автокрасителях и флуоресцентных тепловизорах цельного предметного стекла, что идеально подходит для пользовательских анализов mIF на большом количестве тканевых стекол в трансляционных исследованиях.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мультиплексная иммунофлюоресценция (мИФ) — это усовершенствованный метод, который позволяет проводить детальный анализ образцов тканей с пространственным разрешением путем визуализации нескольких белковых биомаркеров в одном срезе. Тем не менее, большинство технологий mIF сталкиваются со значительными компромиссами между чувствительностью и пропускной способностью при мультиплексировании, что создает критическое ограничение для надежного обнаружения биомаркеров с низким содержанием в нескольких срезах ткани. Новый подход к mIF использует уникальные штрих-коды ДНК, связанные с антителами, которые амплифицируются с помощью параллельного механизма амплификации одной молекулы. Этот метод обеспечивает качество окрашивания, весьма сопоставимое с иммуногистохимией (ИГХ) клинического уровня, обеспечивая при этом высокие возможности мультиплексирования и высокую пропускную способность визуализации всего предметного стекла. Этот анализ включает в себя амплификацию коктейля антител со штрих-кодом ДНК на ткани, за которыми следуют последовательные раунды этапов обнаружения для визуализации четырех флуоресцентно меченных олигонуклеотидов за цикл. Таким образом, этот процесс позволяет обнаруживать восемь или более биомаркеров в каждом образце ткани. Ключевыми этапами этого метода являются автоматизированная подготовка тканей, применение первичных антител, конъюгированных со штрих-кодами ДНК, амплификация сигнала и итерационные циклы обнаружения, визуализации и удаления сигнала. За получением изображений следует регистрация изображений и анализ отдельных клеток с помощью платформы для обработки и анализа пространственных изображений с использованием искусственного интеллекта. Для этого исследования протокол был применен к фиксированным формалином, залитым парафином (FFPE) многотканевым микрочипам (TMA), включая миндалины, меланому, толстую кишку и ядра лимфатических узлов в трех экземплярах. Передовые технологии mIF позволяют получить больше информации об ответе опухоли, микроокружении опухоли и иммунном ландшафте. Преодолевая неизбежные компромиссы между чувствительностью, возможностями мультиплексирования и пропускной способностью визуализации, исследователи теперь могут стремиться понять гетерогенность сложных молекулярных сигнатур и биомаркеров терапевтических реакций.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Высокомультиплексная иммунофлуоресценция (мИФ) — это усовершенствованный метод, который произвел революцию в области анализа тканей, позволив одновременно визуализировать несколько белковых биомаркеров в пределах одного участка ткани 1,2. Эта возможность обеспечивает беспрецедентный уровень детализации и пространственного разрешения, что часто имеет решающее значение для понимания взаимодействий между типами клеток со сложной морфологией в микроокружении тканей в различныхпространственных масштабах. Этот метод особенно ценен в исследованиях в области онкологии, где он может быть использован для колокализации биомаркеров опухолей, белковых мишеней для лекарств, местного иммунного статуса и статуса контрольных точек, взаимодействий между различными типами клеток и даже паттернов субклеточной колокализации, связанных с метаболизмом лекарств в ткани 4,5,6.

Несмотря на свой потенциал, большинство технологий mIF по-прежнему сталкиваются со значительными проблемами, особенно в обеспечении баланса чувствительности и пропускной способности с возможностями мультиплексирования. Это ограничение особенно критично для выявления клинических биомаркеров, которые могут демонстрировать очень низкую экспрессию, таких как HER2 и PD-L1 7,8,9. Чтобы понять, почему это так, важно понимать другие модальности mIF. Эти традиционные методы проложили путь к более сложным платформам mIF, но они имеют свои собственные преимущества и ограничения.

При прямой иммунофлуоресценции (DIF) используются антитела, непосредственно конъюгированные с флуорофорами или с олигонуклеотидом, способным рекрутировать флуорофоры10. Этот метод прост в мультиплексировании, но страдает от низкой чувствительности и трудностей с разрешением сигнала от тканевого фона или артефактов окрашивания.

При непрямой иммунофлюоресценции (IIF) используется вторичное антитело, которое связывается с первичным антителом. Это обеспечивает повышенный сигнал по сравнению с DIF на основе первичной обмотки. В сочетании с улучшенной конструкцией проточных ячеек, последовательный IIF может обнаруживать до 40 биомаркеров в одном анализе 2,11. Тем не менее, они по-прежнему страдают от относительной недостаточной чувствительности по сравнению со стратегиями усиления сигнала на основе ферментов, такими как те, которые используются в методах иммуногистохимии (ИГХ).

Иммунофлуоресценция на основе ферментного катализа чаще всего наблюдается в методах ИГХ с использованием пероксидазы хрена (HRP) для хромогенного (DAB) или флуоресцентного осаждения красителей (например, амплификация сигнала тирамида (TSA)). Поскольку эти анализы основаны на одном и том же каталитическом ферменте, их чувствительность обнаружения одинакова, что делает многоспектральные анализы mIF на основе TSA пригодными для клинического применения 2,12. Преимуществом усиления сигнала на основе ДНК является высокая степень мультиплексирования при сохранении превосходного усиления сигнала и модульности. В отличие от них, методы на основе HRP менее модульны и сложны в оптимизации, что требует дополнительных циклов разработки и тестирования панелей.

Иммунофлуоресценция антител со штрих-кодом ДНК
В продемонстрированном здесь анализе mIF используется ДНК-полимераза для одновременной амплификации антител со штрих-кодом ДНК, за которыми следуют циклы окрашивания и задержания репортерного зонда с использованием четырех флуоресцентных олигонуклеотидов на раунд визуализации (рис. 1).

figure-introduction-1
Рисунок 1: Графическая иллюстрация протокола мультиплексного иммунофлуоресцентного анализа. Конъюгированные со штрих-кодом антитела добавляются за один этап, и штрих-коды амплифицируются одновременно. В каждом цикле добавляются группы из четырех флуоресцентных зондов, что позволяет визуализировать сразу четыре маркера. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Такое однораундовое добавление антител и одноступенчатая амплификация значительно упрощают протокол анализа. Процесс облегчается автоматизированными высокопроизводительными системами окрашивания и сканирования, которые обеспечивают воспроизводимые результаты от предметного стекла к слайду и от партии к партии на большом количестве образцов, используемых вклинических исследованиях.

Одним из основных преимуществ этой технологии является ее способность поддерживать высокую чувствительность, обеспечивая при этом обширное мультиплексирование. Рабочий процесс также гарантирует, что производительность визуализации остается высокой, тем самым устраняя одно из основных ограничений технологий mIF с высокой мультиплексностью (например, > 8 биомаркеров) для клинических исследований. Это особенно важно в клинических исследованиях, где тонкие вариации мишеней для лекарств с низким содержанием (например, низкий HER2) у пациентов могут дать решающее представление о терапевтическом ответе.

В дополнение к этим ключевым характеристикам, этот анализ также обеспечивает конфигурируемость панели, высокую пропускную способность визуализации всего предметного стекла и оптическое разрешение, необходимое для исследования субклеточных процессов и компартментов, а также клеточных выступов, связанных с макрофагами и дендритными клетками. Возможность исследования сложных клеточных фенотипов в нескольких пространственных масштабах является критическим преимуществом оптической визуализации по сравнению с методами, основанными на масс-цитометрии (IMC)2.

В данной работе представлен протокол для 8-плексного анализа мИФ с использованием автоокрашивателя и сканера цельного предметного стекла. Этот анализ включает в себя панель из восьми первичных антител: CD3, CD4, CD8, CD68, FOXP3, PD-1, PD-L1 и пан-цитокератин14. Эта панель маркеров позволит иммунопрофилировать опухолевую ткань и идентифицировать клетки, обнаруженные в среде опухоли или стромы. В этом протоколе используется автоматический краситель предметного стекла для первоначального окрашивания и замены зонда, а окрашивание и визуализация могут быть завершены в течение 2 дней. Также показаны методы валидации анализа mIF и проведения анализа полученных изображений.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все эксперименты должны проводиться в соответствии с руководящими принципами Комитета по этике исследований на человеке. Все срезы тканей, использованные в этом протоколе, были получены от внешнего поставщика тканей.

1. Подготовка образца ткани

  1. Выберите тканевый блок FFPE для окрашивания с помощью анализа mIF. При использовании тканевых стекол FFPE убедитесь, что образцы имеют толщину от 3 до 5 мкм, установлены на положительно заряженных стеклянных предметных стеклах и не имеют складок или других разрывов, которые могут негативно повлиять на конечный результат.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для достижения наилучших результатов избегайте окрашивания образцов тканей, которые были срезаны более чем за 2 месяца до этого. Кроме того, избегайте блоков, которые хранились более 10 лет или кажутся визуально сухими.
  2. При работе с тканевыми блоками FFPE с помощью микротома можно вырезать необходимое количество тканевых стекол толщиной 4 мкм, установив предметные стекла на положительно заряженное предметное стекло. Чтобы добиться наиболее стабильных результатов, устанавливайте все слайды в одной и той же ориентации. Убедитесь, что на ткани нет складок и разрывов.
  3. Если образцы не подлежат окрашиванию сразу, храните их в предметной коробке под азотом до 2 месяцев.

2. Регистрация вспомогательных реагентов и первичных антител для первичной установки

  1. В программном обеспечении для автоматического окрашивания перейдите на вкладку «Настройка реагента» в верхней части экрана. Нажмите кнопку Добавить , чтобы добавить новые реагенты.
  2. Для окрашивания и обменного анализа будут использоваться девять контейнеров с реагентами, в соответствии с информацией, приведенной в таблице 1. Чтобы использовать их, например, для первого реагента под названием Wash Buffer с сокращенным названием ISPWsh1, выполните следующие действия. Выберите тип как Вспомогательный и убедитесь, что *BWash и DI указаны в разделе Совместимые пакеты. Перед сохранением установите флажок «Предпочтительные ».
  3. Повторите этот процесс для остальных вспомогательных реагентов, используя названия и сокращенные названия, приведенные в таблице 1.
    1. Реагент Amplification Solution (ULTAmp1) не совместим с Bond Wash. Для этого в окне настройки реагента выберите *BWash и нажмите кнопку << , чтобы переместить этот реагент из списка совместимых реагентов в раздел доступных реагентов. Если не удалить Bond Wash в качестве совместимого реагента для реагента на растворе амплификации, это может привести к значительному снижению эффективности окрашивания анализа.
  4. После того как все контейнеры с реагентами будут зарегистрированы, создайте набор для обнаружения исследований перед началом первоначального запуска. Для набора для обнаружения потребуется один контейнер для титрования объемом 30 мл.
  5. Добавьте контейнер для титрования объемом 30 мл в набор для обнаружения. Чтобы предотвратить их разделение, прикрепите контейнер для титрования к трубке скотчем.
  6. Отсканируйте штрих-код на левой стороне комплекта для обнаружения. В открывшемся всплывающем окне введите имя комплекта обнаружения (например, InSituPlex Kit). Установите срок действия 10 лет с момента регистрации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Установленный здесь срок годности не совпадает с датой, указанной на реагенте, а является датой истечения срока годности реагента в контейнере для титрования. Установка даты истечения срока годности в далеком будущем гарантирует, что срок годности комплекта не истечет без необходимости.
  7. В качестве первой позиции реагента в наборе выберите «Буфер промывки » в качестве реагента в раскрывающемся меню.
  8. Нажмите на поле «Штрихкод» для этой позиции реагента и отсканируйте штрихкод контейнера для титрования объемом 30 мл, чтобы зарегистрировать этот контейнер как буфер для промывки и связать контейнер с реагентом с зонкой обнаружения.
  9. После того как контейнер для титрования будет подключен к набору, нажмите кнопку « Добавить », чтобы сохранить и закрыть всплывающее окно.
  10. Наполните контейнер для титрования 30 мл 1x Bond Wash и храните в холодильнике при температуре 4 °C между заходами окрашивания.

Таблица 1: Вспомогательные реагенты для установки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

3. Первичная настройка протокола

  1. После успешной регистрации всех контейнеров с реагентами перейдите на вкладку «Настройка протокола» в верхней части экрана программного обеспечения автоокрашивателя.
  2. Подтвердите, какая версия программного обеспечения работает в данный момент, нажав на логотип в правом верхнем углу экрана. В появившемся всплывающем окне под заголовком «Информация о программном обеспечении» будет отображаться версия установленного в данный момент программного обеспечения.
  3. Если программное обеспечение имеет версию 7.0 или более позднюю, будет предустановлен шаблон протокола окрашивания. В нижней части экрана убедитесь, что для параметра «Предпочтительный статус» установлено значение «Все». Назовите протокол шаблона *ISP Staining Assay. Для более ранних версий программного обеспечения протокол можно найти в таблице 2.
  4. Щелкните правой кнопкой мыши на *ISP Staining Assay и скопируйте протокол. В появившемся всплывающем окне переименуем протокол Staining Assay 1 с сокращенным названием (ISP_IHC1)
  5. В разделе «Предпочтительная система обнаружения» выберите ту, которая была создана во время первоначальной настройки реагента на шаге 2.6.

Таблица 2: Протокол протокола мультиплексного иммунофлуоресцентного окрашивания. *MARKER соответствует раствору антитела, а Wash Buffer соответствует раствору BOND Wash. Все остальные вспомогательные реактивы имеют соответствующие названия компонентов набора. Этот протокол совместим с программным обеспечением версии 7.0 и выше, BXD 39 и выше. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

4. Настройка реагентов

  1. Разморозьте все реагенты набора, за исключением конъюгатов антител, фермента амплификации, инициатора обмена и нейтрализатора обмена при комнатной температуре. Храните остальные компоненты набора при температуре -20 °C до использования.
  2. Если это еще не сделано, зарегистрируйте новый контейнер для титрования для каждого из реагентов, определенных в шаге 2.3. Поместите в каждый из них новую вставку.
  3. Используйте систему обнаружения исследований, зарегистрированную на шаге 2.6, и убедитесь, что соответствующий буферный контейнер для промывки заполнен на 30 мл 1x раствором для промывки Bond. Поместите контейнеры для титрования для каждого реагента в систему.
  4. Приготовьте разбавитель Ab в соответствующей емкости. Требуемый объем составляет 350 + (150 мкл x количество слайдов) и состоит из разбавителя антител в том виде, в котором он предусмотрен. Сделайте буфер вихревым для перемешивания после размораживания.
  5. Приготовьте раствор для окрашивания антител в 1 контейнер для окрашивания раствора на антитела. Добавьте все антитела в соотношении 1:100 в предоставленный разбавитель антител. Необходимый объем – 350 + (150 μL x количество слайдов). Не перемешивайте запасы антител или весь раствор для окрашивания антител, перемешивайте только пипетированием.
  6. Приготовьте смесь для предварительного усиления в контейнере для смеси для предварительного усиления. Требуемый объем составляет 350 + (150 мкл x количество слайдов) и состоит из смеси предварительного усиления, как это предусмотрено. Вортексируйте этот раствор после размораживания.
  7. Приготовьте раствор для усиления в контейнере с раствором для усиления. Требуемый объем составляет 350 + (150 мкл x количество слайдов) и состоит из фермента амплификации, разведенного в соотношении 1:10 в буфере для амплификации. Не делайте вихревыми движениями фермент амплификации или готовый раствор амплификации, перемешивайте только пипетированием.
  8. Приготовьте ядерное противопятно в контейнере для ядерного противоудара. Требуемый объем составляет 350 + (300 мкл x количество слайдов) и состоит из предоставленного раствора ядерного противокрасителя, разведенного в соотношении 1:100 в ультрачистой воде. Перемешайте путем вортексинга.
  9. Подготовьте смесь флуоресцентных зондов, соответствующую первому раунду визуализации в контейнере с флуоресцентным зондом. Требуемый объем составляет 350 + (450 мкл х количество стекол), состоящий из флуоресцентных зондов 1 раствор, разбавленных в буфере зонда в соотношении 1:20. Вихревые компоненты после размораживания так же как и окончательная готовая готовая смесь.
  10. После того как все реагенты подготовлены и помещены в соответствующие контейнеры, поместите полную трубку с реагентами в программное обеспечение, чтобы можно было измерить объем реагента.

5. Запустите установку

  1. После того как все реагенты будут подготовлены, перейдите на вкладку «Настройка слайда» в верхней части программного обеспечения и нажмите кнопку « Новое исследование ». При необходимости добавьте идентификатор исследования, название исследования и комментарии к нему. В качестве примера обратитесь к рисунку 2 .
  2. В разделе «Объем дозирования» выберите 150 μL и *Dewax 4 step в качестве протокола приготовления. Если *Удаление парафины 4 шага не отображаются в выпадающем меню, найдите этот протокол в меню «Настройка протокола» и установите флажок «Предпочтительно». Нажмите кнопку «ОК».
  3. После того, как исследование будет создано, нажмите кнопку « Добавить слайд» в правой части экрана настройки слайда. В разделе «Комментарии к слайду» присвойте слайду уникальное имя.
  4. Для дополнительных полей на этом экране установите для параметра Тип ткани значение Тестовая ткань и установите для параметра Объем дозирования значение 150 μL с режимом окрашивания Одиночный в левом выпадающем списке и Рутинный в правом раскрывающемся списке. В разделе «Процесс» выберите ИГХ, маркером которого будет «Раствор для окрашивания антител».
  5. В разделе протокола в окне Добавить слайд выберите Анализ окрашивания 1 для окрашивания, * Удаление воска из 4 этапов в качестве подготовки и *HIER 20 мин с ER2 в качестве HIER. Протокол Enzyme останется *----. Как только это будет завершено, нажмите «Добавить слайд». В качестве примера обратитесь к рисунку 2 .
  6. Повторите этот процесс по мере необходимости для количества слайдов, которые будут запущены в исследовании, убедившись, что поле «Комментарии к слайдам» обновляется для каждого добавленного слайда, чтобы впоследствии их можно было однозначно идентифицировать. После того как все слайды добавлены, закройте окно «Добавить слайд» и распечатайте все этикетки, прикрепив их к соответствующим участкам ткани.
  7. Загрузите каждый слайд в лоток и поместите плитку крышки поверх каждой секции, прежде чем загружать лоток в программное обеспечение. После добавления реагентов и предметных стекол выберите соответствующий автоокрашиватель в правой части программного обеспечения. Как только этот параметр будет выбран, будут видны все три скользящих лотка и информация обо всех реагентах в программном обеспечении, включая реагенты в больших объемах и реагенты, добавленные во время подготовки реагентов.
  8. Убедитесь, что контейнеры с реагентами заполнены, а контейнеры для отходов имеют достаточный объем для завершения прогона, затем нажмите кнопку «Воспроизвести », чтобы начать прогон.
  9. Каждая пробежка занимает примерно 5 часов 15 минут. Запишите время остановки и убедитесь, что стекла будут немедленно удалены из автопятнителя после выполнения протокола.

figure-protocol-1
Рисунок 2: Подсказки для программного обеспечения. (A) Новая подсказка для исследования в программном обеспечении Autostainer, показывающая правильные настройки для протокола окрашивания мультиплексной иммунофлуоресценции (mIF). (B) Добавьте в программное обеспечение всплывающую подсказку, показывающую правильные настройки для протокола окрашивания mIF. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

6. Визуализация

  1. После того, как протокол окрашивания будет завершен, удалите испачканные предметные стекла и покровное стекло в монтажной среде. Дайте монтажному материалу застыть в темноте до тех пор, пока покровное стекло не будет надежно закреплено на месте (обычно 1 час или более, точка паузы).
  2. Изображение производится на предметных стеклах на флуоресцентном микроскопе или сканере предметного стекла с соответствующими фильтрами для проведения анализа. Красители, используемые в этом анализе, обычно совместимы с фильтрами для DAPI, FITC, TRITC, Cy5 и Cy7.
  3. Изображения будут выглядеть примерно так, как показано на рисунке 3A. Визуально убедитесь, что все участки ткани правильно сфокусированы и что сигналы появляются с соответствующим уровнем интенсивности (не переэкспонированы/недоэкспонированы). При необходимости повторное изображение слайдов с другими настройками экспозиции.
  4. После визуализации, если необходим дополнительный раунд визуализации, замочите предметные стекла в 1x PBS до тех пор, пока покровные стекла не отпадут сами по себе. (пауза)

7. Первичная настройка протокола обмена

  1. Если программное обеспечение имеет версию 7.0 или более позднюю, будет предустановлен шаблон протокола автоокрашивания. В нижней части экрана убедитесь, что для параметра «Предпочтительный статус» установлено значение «Все». Протокол шаблона будет называться *ISP Signal Exchg. Для более ранних версий программного обеспечения протокол можно найти в таблице 3.
  2. Щелкните правой кнопкой мыши на *ISP Signal Exchg и скопируйте протокол. В появившемся всплывающем окне переименуем протокол Exchange Protocol 1 с сокращенным названием ISPEXCH1. Прежде чем продолжить, убедитесь, что установлен флажок «Предпочтительно», и назначьте то же имя комплекта, которое указано в шаге 2.6.

Таблица 3: Протокол мультиплексного обмена иммунофлуоресцентными сигналами. Wash Buffer соответствует раствору BOND Wash. Все остальные вспомогательные реактивы имеют соответствующие названия компонентов набора. Этот протокол совместим с программным обеспечением версии 7.0 и выше, BXD 39 и выше. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

8. Настройка и запуск протокола Exchange

  1. Разморозьте обменный буфер при комнатной температуре. Держите обменный нейтрализатор и инициатор замены при температуре -20 °C до использования. Для выполнения протокола обмена необходимы два контейнера для титрования реагентов и набор для детектирования.
  2. Приготовьте обменный раствор в соответствующей емкости. Требуемый объем равен 350 + (450 μL x количество слайдов) и состоит из инициатора обмена, разбавленного в буфере обмена в соотношении 1:500. Не делайте вихревыми движениями обменный фермент или готовый обменный раствор, перемешивайте только пипетированием.
  3. Подготовьте вторую смесь флуоресцентных щупов в емкости с флуоресцентными щупами 2. Требуемый объем составляет 350 + (450 мкл x количество слайдов) и состоит из раствора флуоресцентных зондов 2, разбавленных в соотношении 1:20, и обменного нейтрализатора, разбавленного в соотношении 1:40 в буфере зонда 2. Смесь флуоресцентных зондов и буфер зондов могут быть вихревыми, но обменный нейтрализатор и конечный комбинированный раствор следует смешивать только пипетками.
  4. После того, как все реагенты будут приготовлены, поместите полную трубку на автокраситель и дайте машине протестировать реагенты погружением.
  5. Добавьте все слайды, следуя шагу 5. Во время сложения слайдов измените маркер на *Отрицательный. Для опций Preparation, HIER и Enzyme выберите опцию *----, так как для протокола обмена не требуется депаракс или извлечение антигена. Как только это будет завершено, нажмите «Добавить слайд».
  6. Повторите этот процесс по мере необходимости для количества слайдов, которые будут запущены в исследовании, убедившись, что поле «Комментарии к слайдам» обновляется для каждого добавленного слайда, чтобы впоследствии их можно было однозначно идентифицировать.
  7. После того как все слайды добавлены, закройте окно «Добавить слайд» и распечатайте все этикетки, прикрепив их к соответствующим участкам ткани.
  8. Загрузите каждый слайд в лоток и поместите плитку крышки поверх каждой секции, прежде чем загружать лоток в программное обеспечение.
  9. После того, как все реагенты и предметные стекла добавлены, выберите соответствующий автоокрашиватель в программном обеспечении; Он будет с правой стороны. Как только этот параметр будет выбран, будут видны все три скользящих лотка и информация обо всех реагентах в программном обеспечении, включая реагенты в больших объемах и реагенты, добавленные во время подготовки реагентов.
  10. Убедитесь, что контейнеры с реагентами заполнены, а контейнеры для отходов имеют достаточный объем для завершения прогона.
  11. После этого нажмите кнопку «Играть », чтобы начать прогон. Выполнение протокола занимает около 90 минут. Запишите время остановки и убедитесь, что слайды будут сняты сразу после завершения прогона.

9. Визуализация

  1. Повторите визуализацию для нового раунда пробников, как в шаге 5. Изображения будут выглядеть так, как показано на рисунке 3B.

10. Укладка (для визуализации >4-плексного белка)

  1. Теперь для одного слайда будет существовать несколько изображений. Объедините изображения в программном обеспечении для совместной регистрации изображений, чтобы создать сложенное изображение из 8 плексов.
  2. Зарегистрируйте изображения каждого раунда следующим образом.
    1. Каждое круглое изображение имеет следующие имена: _ где — уникальное имя слайда (штрих-код), а — строка, которая при сортировке в алфавитном порядке помещает изображение раунда 1 на первое место, а изображение раунда 2 — на второе. Например, для = 1234ABC файлы могут называться 1234ABC_Round1 и 1234ABC_Round2, при этом все файлы имеют соответствующее расширение сканера (например, .czi). Поместите все круглые изображения в одну папку, которая называется, например, «Исходные изображения».
    2. В программном обеспечении для совместной регистрации нажмите кнопку «Установить » в разделе каталога исходных изображений пользовательского интерфейса и, когда потребуется, выберите папку, созданную выше.
    3. Установите тип файла в разделе Исходные изображения на расширение исходных изображений (например, .czi, .qptiff и т.д.). Теперь программное обеспечение будет отображать два круглых изображения вместе в таблице, показывающей, что слайд 1234ABC имеет 2 круглых изображения.
    4. При необходимости установите расположение исходных изображений в каталоге, отличном от папки исходных изображений, с помощью кнопки «Установить» в разделе каталога с наложенными изображениями пользовательского интерфейса и, когда появится запрос, выберите нужную папку вывода . В противном случае по умолчанию будет использоваться папка с исходными изображениями.
    5. По умолчанию создается только представление стека в файле .afi. Отметьте опцию сохранения OME.tif файла всего стека в разделе параметров обработки интерфейса.
    6. Чтобы проверить точность совместной регистрации по всей выборке, отметьте опцию Validation в разделе output интерфейса.
    7. Нажмите кнопку СТАРТ , чтобы начать совместную регистрацию изображений.

11. Анализ изображений

  1. После того, как слайды будут изображены, визуализируйте и анализируйте слайды с помощью любого метода анализа, такого как пакет обработки изображений STARVUE от Ultivue или QuPath15.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В соответствии с приведенным выше протоколом, ткань FFPE будет окрашена несколькими мишенями, и будут получены высококачественные изображения всех маркеров в группах по четыре (рис. 3A, B). Программное обеспечение для совместной регистрации изображений позволит объединять и регистрировать изображения с одного и того же слайда, как показано на рисунке 3C. Аналогичные результаты показаны на рисунке 4 для предметного стекла ткани колоректального рака (КРР).

Успех протокола должен определяться оценкой ожидаемого характера окрашивания. В показанном примере с КРР каждая из окрашенных мишеней экспрессируется в ожидаемом субклеточном компартменте, например, ядерный FoxP3, мембранозный CD3, цитоплазматический CD68 (рисунок 4B-D). Каждая из функциональных мишеней экспрессируется на соответствующем типе клеток, как показано на примере колокализации PD1 и CD3 или PDL-1 и CD68, которые демонстрируют истощенные Т-клетки и иммуносупрессивные макрофаги, соответственно. Оценка хорошего соотношения сигнал/фон, позволяющей успешно отличить истинный положительный сигнал от потенциального фонового шума, обычно качественно выполняется патологоанатомами или экспертами по анализу изображений, которые подтверждают качество окрашивания, что позволяет успешно анализировать изображение. Для дальнейшего подтверждения качества и эффективности окрашивания можно добавить сравнение с золотым стандартом ИГХ (хромогенный DAB) на серийных срезах (см. пример на рисунке 5), а также положительный контрольный образец ткани, такой как человеческие миндалины, который для большинства иммунных мишеней может быть полезен для подтверждения успеха окрашивания. Обратите внимание, что раковые опухоли могут демонстрировать более низкую экспрессию мишеней, чем человеческие миндалины16.

После того, как результаты будут качественно подтверждены, можно проводить количественный анализ. В данной работе это состоит в первую очередь из расчета плотности клеток различных фенотипов (число клеток/мм2), экспрессирующих определенную мишень или мишени, а также расчета средних уровней интенсивности функциональных мишеней, которые могут демонстрировать широкий динамический диапазон экспрессии. При оценке точности анализов mIF, серийные срезы, окрашенные одними и теми же маркерами, должны показывать сопоставимые сигналы между предметными стеклами, что можно качественно увидеть на рисунке 6. Примеры количественных результатов по плотности одиночных маркеров в различных типах тканей показаны на рисунке 7. Анализ изображений на этих изображениях позволяет идентифицировать положительные клетки и рассчитать соответствующую плотность положительных клеток для каждого маркера, а также среднюю интенсивность сигнала на положительную клетку. Это позволяет рассчитать коэффициент вариабельности (CV) для каждого маркера для оценки точности мультиплексного анализа (Таблица 4).

figure-results-1
Рисунок 3: Изображения ядра тканевого микрочипа (ТМА), полученные в результате последовательных раундов окрашивания по 8-плексному протоколу иммунофлуоресценции. (A) Изображение, полученное в результате первого раунда визуализации, с маркерами CD8, PD1, PD-L1 и CD68. После протокола обмена (B) показывает второй раунд визуализации на том же слайде для второго раунда маркеров CD3, CD4, FoxP3 и CK/SOX10, и (C) показывает совместно зарегистрированное изображение, объединяющее изображения (A) и (B). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 4: Репрезентативное окрашивание тканей колоректального рака (КРР) с помощью 8-плексного иммунофлуоресцентного окрашивания. На рисунке показаны клеточные фенотипы, которые могут быть идентифицированы путем совместной локализации нескольких мишеней в одной и той же клетке. (наверх) Цельное слайдовое изображение ткани КРР. (внизу) Детальные изображения областей тканей, выделяющих (A) T-reg клетки (CD3+/CD4+/FOXP3+), (B) PD-1- и PD-L1-экспрессирующие клетки в опухолях и стромах, (C) истощенные цитотоксические Т-клетки (CD3+/CD8+/PD-1), (D) иммунно-уклоняющиеся опухолевые клетки (PD-L1+/CK+) и иммуносупрессивные макрофаги (CD68+/PDL1+). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-3
Рисунок 5: Качественное сравнение иммуногистохимии (ИГХ) с иммунофлуоресцентным (ИФ) окрашиванием. Серийные срезы, окрашенные одномаркерным иммуногистохимическим окрашиванием (DAB, верхний ряд), одномаркерной иммунофлуоресценцией (моноплекс ISP) и одноканальным просмотром мультиплексной иммунофлуоресценции (ISP multiplex), демонстрируют качественное соответствие между различными методами окрашивания. Масштабные линейки = 100 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-4
Рисунок 6: Окрашивание серийного среза. (А) Диаграмма, показывающая схему расположения многотканевого ТМА. (B) Репрезентативные 8-плексные изображения ядер тканей каждого типа тканей в TMA. (C) Репрезентативные изображения CD8 в сердцевине миндалин на шести последовательных срезах ТМА, окрашенных за один прогон. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-5
Рисунок 7: Количественное определение плотности одного маркера для каждого типа ткани, включенной в ТМА. Плотности на ткань — это средние плотности по трем репрезентативным ядрам каждого типа тканей на предметном стекле ТМА. Ось y представляет собой плотность отдельных маркеров в различных типах тканей по оси x в единицах положительных клеток/мм2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-6
Рисунок 8: Анализ области интереса (ROI) относительного флуоресцентного сигнала при сравнении усиленной мПЧ ISP, описанной в данном протоколе, с косвенной ПЧ. (A) Репрезентативный слайд с окраской CK (слева) или PD-L1 (справа) с указанием пяти ROI. (B) Репрезентативные изображения ROI для CK (вверху) и PD-L1 (внизу). Средняя интенсивность сигнала, полученная с помощью усиленной mIF (фиолетовый) и непрямой IF (синий) для (C) CK и (D) PD-L1 по пяти ROI, каждый размером 100 мкм x 100 мкм и содержащим около 200 ячеек. Значения по оси Y показывают произвольные единицы флуоресценции, а полосы погрешностей показывают стандартные отклонения (n=3). (E) Относительная интенсивность сигнала, достигнутая с помощью усиленной ИСП mIF (фиолетовый) и косвенной ПЧ (синий), была рассчитана путем вычисления отношения среднего усиленного сигнала mIF к среднему косвенному сигналу ПЧ по всем ROI. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Таблица 4: Рассчитанный коэффициент дисперсии (CV). Положительная плотность клеток и средняя интенсивность сигнала для изображений миндалин показаны на рисунке 6. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом отчете описан протокол высокопроизводительного и высокочувствительного мультиплексного иммунофлуоресцентного окрашивания с использованием автоокрашивателя. При проведении данного протокола этапы подготовки реагентов имеют решающее значение и заслуживают внимания. Необходимо обеспечить надлежащую и правильную дозировку реагентов, чтобы свести к минимуму вариативность окрашивания между различными предметными стеклами в одном и том же прогоне или между разными прогонами с использованием одних и тех же компонентов.

К распространенным проблемам при выполнении этого протокола относятся неправильное смешивание реагентов перед загрузкой и потенциальная потеря тканей из-за неправильной процедуры снятия покровного скольжения. Хотя этот протокол окрашивания применим к любому типу тканей FFPE, включая типы рака, некоторые типы тканей могут требовать более осторожного обращения (например, ткани с высоким содержанием жира). Чтобы избежать потери тканей, дайте покровным стеклам впитаться достаточно долго, чтобы покровное стекло отсоединилось само по себе. Не смещайте покровное стекло с усилием и не снимайте стекло.

Ограничением является то, что в то время как многие из наиболее часто используемых мишеней в иммуноонкологии валидированы и готовы к использованию, некоторые мишени могут потребовать разработки анализа перед включением в мультиплексную панель. Несмотря на то, что этот процесс относительно быстрый, может потребоваться еще несколько недель, прежде чем вы сможете использовать пользовательскую мультиплексную панель.

Существует несколько отличий между этим анализом и другими технологиями мультиплексной иммунофлуоресценции. По сравнению с технологиями, основанными на прямой и непрямой иммунофлуоресценции, продемонстрированный здесь анализ имеет значительно более высокий уровень амплификации, что позволяет значительно улучшить соотношение сигнал/шум, особенно в каналах, которые имеют тенденцию проявлять тканевую аутофлуоресценцию, таких как канал FITC. Это приводит к тому, что сигнал получается в ~30 раз сильнее, чем прямая иммунофлуоресценция, и в ~10 раз сильнее, чем у непрямой иммунофлюоресценции, что количественно определено с помощью анализа интенсивности всего предметного стекла и ручного анализа на основе ROI (Рисунок 8). Этот метод позволяет гораздо более чувствительно обнаруживать целевые белки при значительно более коротком времени экспозиции и устраняет необходимость в манипуляциях с изображением, включая вычитание фона, которое сопряжено с риском удаления сигналов низкой интенсивности.

По сравнению с анализами mIF, основанными на амплификации, катализируемой ферментами, продемонстрированный здесь анализ имеет значительно улучшенную способность к проведению мультиплексирования, в дополнение к более простому рабочему процессу и в целом более короткому времени выполнения анализа (Рисунок 1). В этом анализе антитела добавляются вместе за один этап и амплифицируются одновременно, что значительно упрощает протокол анализа. Кроме того, некоторые технологии на основе ферментов, такие как амплификация тирамидного сигнала (TSA), могут демонстрировать интерференцию между различными антителами, что называется зонтичным эффектом 12,17,18. Используемая здесь технология амплификации позволяет избежать этой проблемы, позволяя обнаруживать множественные колокализованные и ко-экспрессируемые маркеры на одной и той же клетке, как это видно на рисунке 4.

Примерно 90% раковых опухолей человека происходят из эпителиальных клеток19. Это связано с тем, что они часто образуют первую линию защиты от внешней среды и быстрее размножаются, что приводит к более быстрому накоплению потенциально онкогенных мутаций. Здесь воспаление играет решающую роль в онкогенезе, прогрессировании и диссеминации. За последнее десятилетие многие методы лечения, нацеленные на ингибиторы иммунных контрольных точек и иммунные клетки, превратились в мощный арсенал против многих типов опухолей 5,20,21. Тем не менее, значительная часть пациентов до сих пор не реагирует. Вероятно, микроокружение опухоли (TME) и местный иммунный ландшафт играют решающую роль. Профилируя молекулярные сигнатуры ТМЭ, связанные с дифференциальным ответом на лекарственные препараты у многих пациентов, можно было бы лучше определить терапевтические биомаркеры. В этом отчете показано, что технология mIF может быть использована для параллельного профилирования нескольких белковых биомаркеров, включая маркеры с низкой экспрессией, на сотнях целых образцов или опухолевых микрочипов.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы К. Х., А. Вейт, Л. Д., Д. В., Г. С., Ю. С., Д. Х. Л. и А. Васатуро являются сотрудниками компании Ultivue, которая производит мультиплексные иммунофлуоресцентные наборы, используемые в данной работе.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана компанией Ultivue.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Anti-CD3UltivueClone BC33 (BioCare). Входит в состав
ULT50801 Anti-CD4UltivueClone SP35 (Abcam). Входит в состав ULT50801
анти-CD68UltivueClone KP1 (BioCare). Входит в состав
ULT50801 анти-CD8UltivueClone C8/144B (BioCare). Входит в состав ULT50801
Anti-Cytokeratin + Anti-SOX10UltivueAE1/AE3 (Bethyl Labs) и BC34 (BioCare). Входит в состав ULT50801, поставляется в виде смеси
Anti-FOXP3UltivueClone 236A/E7 (Thermo). Входит в состав
ULT50801 Anti-PD1UltivueClone CAL20 (Abcam). Входит в состав ULT50801
Anti-PDL1UltivueClone 73-10 (Abcam). Часть ULT50801
Axioscan.Z1 МикроскопZeissназывается флуоресцентным микроскопом в тексте
Раствор для удаления эпитопа из бондаLeicaAR9222
Раствор для извлечения эпитопа бонда 2LeicaAR9640
, 30 млLeicaOP309700
набор для исследования бондаLeicaDS9455
Вставки для титрования клеиLeicaOPT9049
набор для титрования на бондLeicaOPT9719
универсальные покровные покрытияLeicaS21.4611
раствор для промывки бонда 10x концентратLeicaAR9590
BondRX автоморилкаLeicaназывается "автоморилка" в текстовом
сообщении Программное обеспечениеBondRXLeicaверсии 6.0 или более поздней
версии Покровные стекла, толщина #1.5Corning2980-244
Этанол, 200 proofVWR89370-084
Блоки тканей FFPEBioIVTразличаются
OmniVUE 8-plex анализ (CD3, CD4, CD8, CD68, FOXP3, PD-1, PD-L1, пан-Цитокератин/SOX10)UltivueULT50801содержит все остальные компоненты Ultivue
Фосфатно-солевой буфер (PBS)Boston BioProductsC-9911F(pH 7,4 с 2,7 мМ KCl и 137 мМ NaCl)
ProLong Gold Antifade MountantThermoP10144назван в тексте "монтажной средой"
UltiAnalyzer.AIUltivue
UltiStacker.AIUltivue
Ultivue Amplification BufferUltivueчасть ULT50801
Ultivue Антитела DiluentUltivueчасть
ULT50801 Ultivue Exchange BufferUltivueчасть ULT50801
Ultivue Exchange InitiatorUltivueчасть ULT50801
Ultivue Exchange NeutralizerUltivueчасть ULT50801
Ultivue Fluorescent Probes 1Ultivueчасть ULT50801
Ultivue Fluorescent Probes 2Ultivueчасть ULT50801
Ultivue Pre-Amplification MixUltivueчасть ULT50801
Ultivue Probe BufferUltivueчасть
сверхчистой водыULT50801 Sigma-AldrichW4502
клонов Открытые контейнеры

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. McGinnis, L. M., Ibarra-Lopez, V., Rost, S., Ziai, J. Clinical and research applications of multiplexed immunohistochemistry and in situ hybridization. J Pathol. 254 (4), 405-417 (2021).
  2. Tan, W. C. C., et al. Overview of multiplex immunohistochemistry/immunofluorescence techniques in the era of cancer immunotherapy. Cancer Comm. 40 (4), 135-153 (2020).
  3. Huss, R., Schmid, C., Manesse, M., Thagaard, J., Maerkl, B. Immunological tumor heterogeneity and diagnostic profiling for advanced and immune therapies. Adv Cell Gene Ther. 4 (3), e113(2021).
  4. Singhal, S. K., et al. Kaiso (ZBTB33) subcellular partitioning functionally links LC3A/B, the tumor microenvironment, and breast cancer survival. Comm Biol. 4 (1), 1-13 (2021).
  5. Patil, N. S., et al. Intratumoral plasma cells predict outcomes to PD-L1 blockade in non-small cell lung cancer. Cancer Cell. 40 (3), 289-300.e4 (2022).
  6. Hong, D. S., et al. Autologous T cell therapy for MAGE-A4+ solid cancers in HLA-A*02+ patients: a phase 1 trial. Nat Med. 29 (1), 104-114 (2023).
  7. Robbins, C. J., et al. Multi-institutional Assessment of Pathologist Scoring HER2 Immunohistochemistry. Mod Pathol. 36 (1), 100032(2023).
  8. Ko, H., et al. Is HER2-Low a New Clinical Entity or Merely a Biomarker for an Antibody Drug Conjugate. Oncol Ther. 12 (1), 13-17 (2024).
  9. Fundytus, A., Booth, C. M., Tannock, I. F. How low can you go? PD-L1 expression as a biomarker in trials of cancer immunotherapy. Ann Oncol. 32 (7), 833-836 (2021).
  10. Im, K., Mareninov, S., Diaz, M. F. P., Yong, W. H. An Introduction to Performing Immunofluorescence Staining. Method Mol Biol. 1897, 299-311 (2019).
  11. Sheng, W., et al. Multiplex Immunofluorescence: A Powerful Tool in Cancer Immunotherapy. Int Mol Sci. 24 (4), 3086(2023).
  12. Taube, J. M., et al. The Society for Immunotherapy of Cancer statement on best practices for multiplex immunohistochemistry (IHC) and immunofluorescence (IF) staining and validation. J ImmunoTher Cancer. 8 (1), e000155(2020).
  13. Myers, J. A review of automated slide stainers for immunohistochemistry and in situ hybridization. Medl Lab Obser. 40 (1), 41-44 (2008).
  14. Schwarze, J. K., et al. Intratumoral administration of CD1c (BDCA-1)+ and CD141 (BDCA-3)+ myeloid dendritic cells in combination with talimogene laherparepvec in immune checkpoint blockade refractory advanced melanoma patients: a phase I clinical trial. J ImmunoTher Cancer. 10 (9), e005141(2022).
  15. Bankhead, P., et al. QuPath: Open source software for digital pathology image analysis. Sci Rep. 7 (1), 16878(2017).
  16. Koppel, C., et al. Optimization and validation of PD-L1 immunohistochemistry staining protocols using the antibody clone 28-8 on different staining platforms. Mod Pathol. 31 (11), 1630-1644 (2018).
  17. Parra, E. R., et al. Procedural Requirements and Recommendations for Multiplex Immunofluorescence Tyramide Signal Amplification Assays to Support Translational Oncology Studies. Cancers. 12 (2), 255(2020).
  18. Surace, M., et al. Automated Multiplex Immunofluorescence Panel for Immuno-oncology Studies on Formalin-fixed Carcinoma Tissue Specimens. J Vis Exp. (143), e58390(2019).
  19. Hinck, L., Näthke, I. Changes in cell and tissue organization in cancer of the breast and colon. Curr Opin Cell Biol. 0, 87-95 (2014).
  20. Alturki, N. A. Review of the Immune Checkpoint Inhibitors in the Context of Cancer Treatment. J Clin Med. 12 (13), 4301(2023).
  21. Sun, Q., et al. Immune checkpoint therapy for solid tumours: clinical dilemmas and future trends. Signal Transduct Targeted Ther. 8 (1), 1-26 (2023).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи