Фенотипирование мезенхимальных стволовых клеток костного мозга мышей на основе очистки, экспансии и проточной цитометрии

Summary

В настоящем протоколе описан экономически эффективный метод очистки, расширения и определения характеристик высокогомогенных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга (BMSC) мышей. Такой подход способствует приобретению больших количеств BMSC с высоким потенциалом пролиферации и дифференцировки, поддерживая модели мышей и продвигая доклинические исследования.

Abstract

Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) представляют собой популяцию стволовых клеток, которые могут самообновляться и дифференцироваться в несколько клеточных линий. Среди них МСК, обнаруженные в костном мозге, известные как мезенхимальные стволовые клетки костного мозга (BMSC), играют решающую роль в остеогенезе, поддержке кроветворения, хоуминге/миграции и иммуносупрессии. BMSC широко используются в исследованиях в области клеточной биологии и тканевой инженерии благодаря их потенциалу для клеточных терапевтических стратегий, а также их легкой доступности, генетической стабильности и низкой иммуногенности. Гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) и БМСК сосуществуют в костном мозге, но имеют различные клетки-предшественники. При извлечении клеток из костного мозга обычно получают несколько типов клеток, что может привести к гетерогенности в клеточной популяции, потенциально вызывая смещение и не соответствуя высоким экспериментальным стандартам. Поэтому крайне важно разработать эффективные методы для улучшения гомогенности и выхода BMSC in vitro. В данном исследовании представлен подробный протокол фенотипирования на основе очистки, расширения и проточной цитометрии BMSC, полученных от мышей BALB/c. Гомогенность и фенотип стволовых клеток БМСК третьего пассажа были охарактеризованы с помощью проточной цитометрии, что продемонстрировало положительную способность к CD29, CD44 и Sca-1, отрицательную — к CD45 и CD31 и подтвердила их остеогенную и адипогенную способность к дифференцировке. Этот экономически эффективный протокол обеспечивает простой и эффективный метод получения достаточного количества однородных BMSC с высоким потенциалом пролиферации и дифференцировки, что имеет важное значение для продвижения исследований на мышиных моделях и обширных доклинических исследований.

Introduction

Мезенхимальные стволовые клетки костного мозга (БМСК) известны своими мультипотентными характеристиками и широко используются в лечении различных заболеваний благодаря своим самообновляющимся, дифференцировочным и иммуномодулирующим свойствам ^1,2. BMSC легко доступны, способны к обширной экспансии, проявляют иммуносупрессивные свойства и не вызывают немедленных иммунных реакций3, что делает их привлекательными для применения в тканевой инженерии и эффективными носителями для клеточной терапии.

В костном мозге основными резидентами являются две основные популяции стволовых клеток и их потомки, гемопоэтические стволовые клетки и BMSC^4. Традиционно BMSC получают путем таргетной аспирации костного мозга и идентифицируют как клетки, адгезивные к пластике in vitro. Однако этот метод недостаточен для дифференциации BMSC от других субпопуляций костного мозга, включая эндотелиальные клетки, перициты, лейкоциты и гемопоэтические стволовые клетки⁵. Поэтому необходим простой и эффективный протокол изоляции БМСК.

В текущей работе подробно описывается разделение и очистка BMSC путем их физического прилегания к пластиковым клеточным культуральным планшетам. Эксперименты по проточной цитометрии проводились на третьих пассажах BMSC с использованием поверхностных маркеров CD29, CD44 и Sca-1, как^{описано Комитетом по} мезенхимальным стромальным клеткам (MSC) Международного общества клеточной и генной терапии (ISCT). Согласно критериям ISCT, мышиные МСК характеризуются положительностью к CD29, CD44 и антигену стволовых клеток 1 (Sca-1), и отрицательностью к маркеру гемопоэтических клеток CD45 и маркеру эндотелиальных клеток CD31. Кроме того, БМСК должны быть мультипотентными, демонстрируя трехлинейную дифференцировку на остеобласты, хондроциты и адипоциты. В этом эксперименте остеогенез индуцировали в экстрагированных BMSC, окрашивание ЩФ проводили на 7-й день и анализировали ализарин на красный S на 21-й день для оценки дифференцировки. Также была индуцирована адипогенная дифференцировка выделенных и очищенных BMSC с окрашиванием Oil Red O на 21-й день для оценки адипогенеза.

Protocol

Обращение с животными было одобрено в соответствии с рекомендациями по этике лабораторных животных (номер этического одобрения: PZSHUTCM2211070009) Шанхайского университета традиционной китайской медицины. В этом исследовании использовались восьминедельные самки мышей BALB/c (SPF, 20 ± 1 г массы тела). В этом протоколе описываются очистка, пассирование, фенотипирование на основе проточной цитометрии, а также остеогенная и адипогенная дифференцировка BMSC, полученных от мышей. Используемые реагенты и оборудование перечислены в Таблице материалов.

1. Обращение с животными

1. Домашние мыши в специфических условиях, свободных от патогенов (SPF) в индивидуально вентилируемых клетках, по пять мышей в клетке. Обеспечьте кормом с SPF и стерильной водой. Поддерживайте 12-часовой цикл света/темноты.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод был протестирован и признан осуществимым как на линиях мышей BALB/c, так и на C57BL/6. В данной статье в основном используется BALB/c в качестве примера.

2. Забор бедренных и большеберцовых костей с задних конечностей мышей

1. Усыпить животных путем удушения_СО2 с последующим вывихом шейки матки⁷ в соответствии с этическими нормами.
2. Замочите мышей в 75% этаноле на 5 минут (Рисунок 1A).
   Примечание: Стволовые клетки были собраны в течение 30 минут² после эвтаназии, и весь процесс, включая промывку костного мозга, фильтрацию и посев в культуральные планшеты, был завершен в течение 2 часов для обеспечения оптимальной жизнеспособности клеток.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте взрослых мышей (≥8 недель) для оптимального выхода BMSC; Идеально подходят 8–12-недельные мыши⁸.
3. Сделайте надрез примерно на 1 см на задней конечности ахиллова сухожилия стерильными ножницами для рассечения (рисунок 1Б).
4. Сделайте круговой разрез вокруг задней конечности ахиллова сухожилия стерильными ножницами, чтобы обнажить дистальный отдел большеберцовой кости (рисунок 1C).
5. Снимите кожу от разреза по направлению к бедру, чтобы удалить кожу с обеих задних конечностей (Рисунок 1D).
6. Разрежьте вдоль подвздошной кости, чтобы отделить головку бедренной кости от тазобедренной кости (рисунок 2А).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте повреждения двусторонних суставов бедренной кости во время рассечения, чтобы предотвратить потерю костного мозга.
7. Поместите собранные бедренные и большеберцовые кости в чашку диаметром 60 мм, в которой находится стерильный предварительно холодный PBS, содержащий 2% пенициллина/стрептомицина (рис. 2B).
8. Отрежьте как можно больше сухожилий и мышц от большеберцовой и малоберцовой костей с помощью стерильного скальпеля, чтобы облегчить последующее промывание (Рисунок 2C).
9. Верните обработанные кости в PBS, содержащий 2% пенициллина/стрептомицина, и перенесите их в стерильный капюшон для последующих этапов изоляции.

3. Очистка и культивирование мышиных BMSC

1. Приготовьте полную среду MEM Alpha Modification (αMEM) для культуры BMSC, добавив αMEM 10% фетальной бычьей сыворотки и 1% пенициллин/стрептомицин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Выбирайте среду αMEM, так как она содержит 1000 мг/л глюкозы, что является относительно низкой концентрацией. Это помогает предотвратить ингибирование пролиферации клеток, которое может происходить в среде с высоким содержанием глюкозы⁹
2. Возьмите шприц объемом 50 мл и прикрепите к нему иглу, которая идет в комплекте со шприцем.
3. Наберите 20 мл среды αMEM в шприц объемом 50 мл, затем замените иглу на ту, которая идет в комплекте со шприцем объемом 1 мл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте иглу для шприца объемом 1 мл, чтобы приспособиться к размеру кости и свести к минимуму повреждение клеток. Шприц объемом 50 мл позволяет эффективно промывать костный мозг с меньшим риском загрязнения клеток при повторных введениях.
4. С помощью ножниц отрежьте оба конца отделенной бедренной кости или большеберцовой кости в стерильном капюшоне.
5. Вставьте иглу в кость по краю среза и промойте костный мозг в чашку для культуры диаметром 100 мм, содержащую полную среду αMEM (рис. 2D).
6. Неоднократно промывайте костные полости до тех пор, пока костные части не станут бледными, чтобы убедиться, что большая часть костного мозга была извлечена (рисунок 2E).
7. Осторожно проводите пипеткой вверх и вниз 40 раз с помощью наконечника пипетки, чтобы максимально диспергировать агрегированные клетки.
8. Отфильтруйте клеточную суспензию через клеточный фильтр 40 мкм в центрифужную пробирку объемом 50 мл, чтобы удалить мусор, фрагменты тканей и недиспергированные комки.
9. Переложите отфильтрованную клеточную суспензию в чашку для клеточных культур диаметром 100 мм и добавьте полную среду αMEM до конечного объема 15 мл на чашку.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Культивируйте все клетки костного мозга, собранные из бедренных и большеберцовых костей каждой мыши в одной 100-миллиметровой чашке для культивирования, чтобы облегчить рост клеток. Основываясь на предыдущих экспериментах, примерно 1 × 10⁷ BMC можно выделить от 8-недельной мыши (из двух бедренных костей и двух большеберцовых костей). Эти клетки высевают в 100 мм культуральную чашку с плотностью 1,8 ×^{10 5} клеток/^см2 для первичной культуры.
10. Держите чашку обеими руками и аккуратно покрутите ее 15 раз движением в виде восьмерки, чтобы обеспечить равномерное распределение клеток по чашке.
11. Поместите чашку для культивирования при температуре 37 °C в инкубатор с 5%_CO2 и выращивайте в течение 5 дней (рис. 3A).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте перемещения чашки для культивирования в этот период, чтобы обеспечить равномерный рост клеток.

4. Замена среды αMEM на культуру BMSC

1. Понаблюдайте за клетками под микроскопом, чтобы определить, достигли ли они 80% конфлюенции. Если нет, приступайте к замене среды на^5-й день.
2. Наберите 3 мл PBS стерильной пастеровской пипеткой и распределите его с высоты 1 см над чашкой для культивирования в разных положениях.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте распыления жидкости с одной стороны чашки, так как это может привести к удалению прилипших клеток из-за чрезмерной силы удара и помешать эффективному удалению нежелательных клеток.
3. После добавления 3 мл PBS аккуратно встряхните чашку для культивирования, чтобы тщательно промыть клетки, и удалите PBS из чашки с помощью пипетки. Повторите процесс промывки еще раз, чтобы убедиться, что ячейки тщательно вымыты.
4. Наберите 15 мл полной среды αMEM с помощью стерильной пастеровской пипетки и распределите ее с высоты 1 см над чашкой для культивирования в разных положениях.
5. Верните чашку для культивирования в инкубатор и наблюдайте за тем, пока клетки не достигнут 80% конфлюенции перед субкультивированием (рисунок 3B).

5. Прохождение BMSC

1. Дважды промойте 80% сливающихся клеток PBS (Рисунок 3C).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Промывка клеток PBS перед перевариванием помогает удалить остаточную среду и клеточный секрет и снижает адгезию МСК к питательной чашке.
2. Расщепляют клетки с 1 мл 0,25% трипсина-ЭДТА путем инкубации при 37 °C в инкубаторе с 5% содержанием_СО2 в течение 2–3 минут.
3. Нейтрализуйте трипсин, добавив 4 мл полной среды αMEM в клеточную суспензию.
4. Отсадите клеточную суспензию из чашки для культивирования с помощью наконечника пипетки объемом 1 мл и осторожно промойте дно чашки, чтобы отделить все адгезивные клетки.
5. Перенесите суспензию клеток в центрифужную пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте при давлении 300 × г в течение 5 минут при комнатной температуре.
6. С помощью пипетки удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в 2 мл полной среды αMEM.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для субкультивирования плотность посева примерно 4 × 10⁴ клеток/^см2 была признана оптимальной для продолжения роста и пролиферации.
7. Разделите клетки в соотношении 1:1–1:2 на новые 100 мм чашки для клеточных культур (это составляет^1-й проход, P1) (рисунок 3D).
8. Разделяйте клетки примерно каждые три дня в соотношении 1:1,5, когда они достигают 80% слияния, чтобы создать второй проход (P2) (рисунок 3E) и третий проход (P3) (рисунок 3F) BMSC.

6. Подготовка P3 BMSC к фенотипической идентификации и остеогенной дифференцировке

1. Выбросьте среду для культивирования клеток.
2. Промойте P3 BMSC 3 мл PBS дважды.
3. Расщепляйте P3 BMSC с 1 мл 0,25% трипсина-ЭДТА путем инкубации при 37 °C в инкубаторе с 5%_CO2 в течение 2–3 минут, когда они достигнут 80% конфлюенции.
4. Нейтрализуйте трипсин, добавив 4 мл полной среды αMEM в клеточную суспензию.
5. Перенесите клеточную суспензию в центрифужную пробирку объемом 15 мл, центрифугируйте при 300 × г в течение 5 минут при комнатной температуре и выбросьте надосадочную жидкость.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовленные здесь гранулы P3 BMSC будут использоваться для фенотипической идентификации с помощью проточной цитометрии и для оценки остеогенной или адипогенной дифференцировки.

7. Фенотипическая идентификация БМСК с помощью проточного цитометра

1. Суспендируйте клеточные гранулы Р3 БМСК с 1,5 мл раствора PBS, содержащего 2% FBS, и отрегулируйте концентрацию до 5 × 10⁶ клеток/мл.
2. Аликвоту 100 мкл клеточной суспензии в каждую из 11 пробирок для получения 5 × 10⁵ клеток на пробирку. Подготовьте следующие группы: бланк этикетки, контроль изотипа CD29, контроль изотипа CD29, контроль изотипа CD44, контроль изотипа CD44, контроль изотипа Sca-1, контроль изотипа Sca-1, контроль изотипа CD31, контроль изотипа CD31, контроль изотипа CD45, CD45.
   Примечание: В настоящем исследовании использовались следующие флуорохромы: CD29-FITC, CD29 изотип FITC, CD44-APC, CD44 изотип APC, Sca-1-PECy7, Sca-1 изотип PECy7, CD45-PerCPcy5.5, CD45 изотип PerCPcy5.5, CD31-PE и CD31 изотип PE (как показано в таблице материалов). Эти флуорохромы могут быть модифицированы в зависимости от конфигураций различных проточных цитометров.
3. Для каждой группы добавить следующие реагенты: 2 мкл PBS в группу бланка этикетки, 2 мкл изотипа CD29 в контрольную группу изотипа CD29 (разведение 1:50), 2 мкл CD29 в группу CD29 (разведение 1:50), 0,5 мкл изотипа CD44 в контрольную группу изотипа CD44 (разведение 1:200), 0,5 мкл CD44 в группу CD44 (разведение 1:200), 0,5 мкл изотипа Sca-1 в контрольную группу изотипа Sca-1 (разведение 1:200), 0,5 мкл изотипа Sca-1 в группу Sca-1 (разведение 1:200), 2 мкл изотипа CD31 в контрольную группу изотипа CD31 (разведение 1:50), 2 мкл CD31 в группу CD31 (разведение 1:50), 2 мкл изотипа CD45 в контрольную группу изотипа CD45 (разведение 1:50), и 2 мкл CD45 в группу CD45 (разведение 1:50).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Антитела использовали в соответствии с оптимизированными рекомендациями производителя по проточной цитометрии. Предварительные эксперименты подтвердили оптимальное окрашивание и специфичность для клеток-мишеней. Обратитесь к рекомендациям производителя по дозировке и при необходимости проведите предварительные тесты титра.
4. Аккуратно перемешайте, центрифугируйте с помощью пальмовой центрифуги и инкубируйте в течение 30 минут при температуре 4 °C в темноте.
5. Добавьте 900 μL PBS в каждую пробирку, перемешайте путем инвертирования и центрифугируйте при 300 × г в течение 5 минут при 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость, чтобы удалить избыток антител.
6. Повторно суспендируйте клеточную гранулу в каждой пробирке с 300 мкл PBS и проанализируйте с помощью проточного цитометра.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки не нужно фиксировать 2,5% нейтральным формальдегидом, если анализ проточной цитометрии может быть завершен в течение 1–2 часов. Если анализ не может быть проведен в течение 1–2 ч, зафиксировать клетки 2,5% нейтральным буферизованным формалином (полученным путем смешивания 10% нейтрального буферизованного формалина с PBS в соотношении 1:3) и хранить при 4 °C в темноте в течение ночи для последующего анализа проточным цитометром.
7. Отрегулируйте напряжение проточного цитометра с помощью группы пустых меток, чтобы убедиться, что автофлуоресценция клеток находится в пределах примерно 1/4–1/3 от оси координат. Последовательно загружайте клетки из групп изотипа CD29, CD29, изотипа CD44, CD44, изотипа Sca-1, изотипа Sca-1, изотипа CD31, изотипа CD31, CD45 и CD45. Настройте вентиль P1 (как определено на графике FSC/SSC) для захвата 10 000 ячеек, работающих со средней скоростью.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что проточный цитометр оснащен соответствующими каналами, такими как те, которые обычно используются в экспериментах: FITC, PE, PerCp-Cy5.5, PE-Cy7 и APC, или другими каналами, которые соответствуют флуоресцеинам, связанным антителами.

8. Остеогенная дифференциация БМСК

1. Ресуспендируйте гранулы P3 BMSC в полной среде αMEM, регулируя концентрацию до 1 × 10⁵ клеток/мл.
2. Засейте P3 BMSC в 24-луночный планшет для культивирования клеток, добавив в каждую лунку 1 мл полной среды αMEM, содержащей 1 × 10⁵ клеток.
3. Культивируйте P3 BMSC при 37 °C в инкубаторе с 5%_CO2 в течение 3–5 дней, пока они не достигнут конфлюенции более 90%. Заменяйте полную среду αMEM на свежую каждые 2 дня.
4. Разделите различные лунки поровну на две группы: отрицательную контрольную группу (без индукции остеогенной дифференцировки) и группу остеогенной дифференцировки
5. Приготовьте среду для индукции остеогенной дифференцировки, добавив в полную среду αMEM 10 ммоль/л β-глицерофосфата, 50 мг/л L-аскорбиновой кислоты и ^10-8 моль/л дексаметазона.
6. Выбросьте питательную среду для клеточных клеток и промойте P3 BMSC 1 мл PBS.
7. Добавьте среду для индукции остеогенной дифференцировки в лунки группы остеогенной дифференцировки для индукции остеогенной дифференцировки (1 мл/лунка).
8. Добавьте полную среду αMEM в лунки контрольной группы (1 мл/лунка).
9. Культивируйте P3 BMSC при 37 °C в инкубаторе с 5% содержанием_CO2 в течение 7 или 21 дня, заменяя среду для индукции остеогенной дифференцировки или полную среду αMEM на ту же свежую среду каждые 3 дня.
   Примечание: Клетки с 7-дневной индукцией используются для окрашивания щелочной фосфатазой (ЩФ). Клетки с 21-дневной индукцией используют для анализа ализаринового красного S.

9. Идентификация дифференцированных остеогенных клеток с окрашиванием ЩФ

1. Промойте ячейки в каждой лунке 24-луночного планшета 1 мл PBS один раз.
2. Зафиксируйте клетки, добавив 0,5 мл 10% буферизованного раствора формалина и инкубируя в течение 20 минут.
3. Еще раз промойте ячейки в каждой лунке 1 мл PBS один раз.
4. Добавьте 0,5 мл реагента для окрашивания щелочной фосфатазы 1-Step NBT/BCIP в каждую лунку и инкубируйте при 37 °C в течение 30 минут, обернув алюминиевой фольгой для защиты от света.
5. Слейте раствор, промойте ячейки в каждой лунке 1 мл дистиллированной воды один раз и дайте пластине высохнуть.
6. Наблюдайте и получайте изображения окрашенных колоний с помощью камеры для идентификации ALP-положительных клеток с черно-фиолетовым осадком.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Реагент для окрашивания щелочной фосфатазы (ЩФ) 1-Step NBT/BCIP образует сильный, нерастворимый черно-фиолетовый осадок при реакции с ЩФ, который можно легко визуализировать.

10. Идентификация дифференцированных остеогенных клеток с помощью ализаринового красного S анализа

1. Промойте ячейки в каждой лунке 24-луночного планшета 1 мл PBS один раз.
2. Зафиксируйте клетки, добавив 0,5 мл 10% буферизованного раствора формалина и инкубируя в течение 20 минут.
3. Промойте ячейки в каждой лунке 24-луночного планшета 1 мл PBS один раз.
4. Добавьте 0,5 мл 0,1% ализарина красного S в 0,1 моль/л Tris-HCl (pH 8,3) в каждую лунку и инкубируйте при 37 °C в течение 30–60 минут.
5. Слейте раствор, промойте ячейки в каждой лунке 1 мл дистиллированной воды один раз и дайте пластине высохнуть.
6. Наблюдайте и получайте изображения окрашенных колоний с помощью камеры для идентификации ализарин-красных S-положительных клеток.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ ализарина красного S для дифференцировки МСК в зрелые минерализованные костные клетки приводит к образованию ализаринового красного S-кальциевого комплекса, который дает ярко-красное окрашивание, которое можно наблюдать визуально.

11. Приготовление адипогенных индукционных дифференцировочных сред А для БМСК

ПРИМЕЧАНИЕ: Для дифференцировки адипоцитов BMSC часто используется набор для дипогенной дифференцировки мезенхимальных стволовых клеток костного мозга мыши (см. Таблицу материалов) в соответствии с рекомендациями.

1. Поместите фетальную бычью сыворотку (компонент набора, называемый сывороткой) в холодильник при температуре 4 °C не менее чем на 6 часов до полного размораживания.
2. Поместите добавку A-I (компонент набора) в холодильник при температуре 4°C не менее чем за 30 минут до приготовления; Поместите Добавку А-II (компонент Набора) при комнатной температуре до полного оттаивания.
3. Переверните или осторожно постучите по тюбику с реагентом, чтобы перемешать содержимое.
4. Центрифугируйте пробирку с реагентом Supplement A-II при давлении 300 × г в течение 30 с при комнатной температуре, чтобы убедиться, что реагент собирается на дне и облегчает извлечение.
5. Тщательно очистите внешнюю упаковку от всех компонентов 75% медицинским спиртом и откройте их в шкафу биобезопасности.
6. Добавьте в среду сыворотку, добавку A-I и добавку A-II.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы обеспечить правильное растворение, предварительно нагрейте базальную среду (компонент набора) до 37 °C, иначе добавка A-II может выпасть в осадок из-за воздействия холода.
7. Используйте небольшое количество базальной среды для промывки каждой бутылки и тюбика, обязательно перенося все компоненты в базальную среду.
8. Закройте крышку на бутылке Basal Medium и осторожно встряхните, чтобы тщательно перемешать.
9. Запечатайте бутылку парафиновой пленкой, заверните в алюминиевую фольгу и наклейте на нее этикетку с названием, датой приготовления и другими деталями.

12. Получение среды адипогенной индукционной дифференцировки В для БМСК

1. Поместите фетальную бычью сыворотку в холодильник при температуре 4 °C не менее чем на 6 часов до полного размораживания.
2. Поместите добавку B (компонент набора) в холодильник при температуре 4 °C до полного размораживания в течение как минимум 30 минут перед приготовлением.
3. Переверните или осторожно постучите по тюбику с реагентом, чтобы перемешать содержимое.
4. Центрифугируйте пробирку с добавкой B, чтобы сконцентрировать реагент на дне для облегчения сбора.
5. Тщательно очистите внешнюю упаковку от всех компонентов 75% медицинским спиртом и откройте их в шкафу биобезопасности.
6. Добавьте сыворотку и добавку B в базальную среду.
7. Используйте небольшую порцию базальной среды для мытья каждой бутылки и тюбика, следя за тем, чтобы все компоненты полностью перешли в среду.
8. Закройте крышку на бутылке Basal Medium и осторожно встряхните, чтобы тщательно перемешать.
9. Запечатайте бутылку парапленкой, оберните ее алюминиевой фольгой и наклейте на нее этикетку с названием, датой приготовления и другими деталями.

13. Дифференцировка адипоцитов БМСК

1. Добавьте 1 мл 0,1% желатина в шестилуночную пластину, встряхивая ее, чтобы равномерно покрыть дно каждой лунки.
2. Поместите шестилуночный планшет, покрытый 0,1% желатином, в стерильный колпак или инкубатор с_CO2 не менее чем на 30 минут.
3. Отсадите желатин, и пластина готова к засеванию клеток, или дождитесь высыхания лунок перед посевом через 30 минут.
4. Засейте P3 BMSCs с плотностью 4 × 10⁴ ячейки/^см2 в каждую лунку шестилуночного планшета, добавив 2 мл полной среды в каждую лунку.
5. Инкубируйте клетки при температуре 37 °C в инкубаторе с содержанием CO₂ 5% CO₂ и насыщенной влажностью.
6. Тщательно аспирируйте среду и добавьте 2 мл индукционной среды адипогенной дифференцировки А в каждую лунку, когда клетки достигнут 100% слияния.
7. Аспирируйте среду А из лунок через 3 дня индукции и добавьте 2 мл адипогенной дифференцировочной среды В.
8. Аспирируйте среду В через 1 день и переключитесь обратно на среду А для дальнейшей индукции.
9. Чередуйте среду А и В и наблюдайте за клетками ежедневно. Если во время индукции средой А происходит сокращение или гибель клеток, немедленно переключитесь на среду В.
10. Повторяйте процесс индукции и поддержания до появления достаточного количества липидных капель соответствующего размера, а затем приготовьтесь к окрашиванию.

14. Окрашивание маслом Red O (ORO)

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте все процедуры максимально аккуратно, чтобы избежать отслоения липидных капель.

1. После завершения адипогенной индукционной дифференцировки аспирируйте среду адипогенной индукции из 6-луночного планшета и аккуратно промойте 1×PBS 2–3 раза.
2. Добавьте 2 мл 10% нейтрального буферизованного формалина на лунку и зафиксируйте в течение 20 минут при комнатной температуре.
3. Приготовьте рабочий раствор Oil Red O, смешав бульон Oil Red O с дистиллированной водой в соотношении 3:2. После смешивания центрифугировать при 250 × г в течение 4 мин и использовать надосадочную жидкость.
4. Отсадите фиксатор и аккуратно промойте PBS 2–3 раза, обеспечивая тщательное снятие фиксатора.
5. Добавьте в каждую лунку по 0,8 мл раствора красителя О, оставьте при комнатной температуре на 30 минут.
6. Отсадите раствор пятна, дважды постирайте с 1 мл 75% этанола.
7. Добавьте по 1 мл противокрасителя гематоксилина в каждую лунку на 2 минуты, затем аспирируйте.
8. Добавьте 2 мл PBS в каждую лунку и наблюдайте за результатами адипогенного окрашивания под микроскопом.
9. Запечатайте окрашенную шестилуночную пластину парапленкой и храните при температуре 4 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не храните более 1 недели. Липидные капли могут сливаться, теряя окрашивающее состояние.

Results

BMSC, полученные от мышей, были изолированы и культивированы в течение примерно 2 недель для получения третьего пассажа (P3) BMSC (рис. 3). Как показано на рисунке 3А, клетки, только что извлеченные из костного мозга, остались мононуклеарными с видимыми каплями жира. Веретенообразные клетки появлялись в культуральной чашке, достигая 60%-80% конфлюенции на^5-й день культивирования (рис. 3B, ...

Discussion

Терапия стволовыми клетками вызвала значительный интерес благодаря своему потенциалу революционизировать регенеративную медицину. Доклинические исследования предоставили существенные доказательства в поддержку клинического применения стволовых клеток, в частности BMSCs¹³. Тем не менее, такие проблемы, как низкий выход клеток, контаминация и медленный рост, препятствуют их клиническому применению. Таким образом, существует острая потребность в исследованиях, направ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Шприц 1 мл (игла для шприца 22 г)	ДОБРАЯ ГРУППА (KDL)	60017031
1-ступенчатый NBT/BCIP	Пирс Биотехнология, Инк.	34042	Окрашивание щелочной фосфатазой
10% нейтральный буферизованный формалин	Wexis	5200250	фиксация клеток
6-луночный планшет	Лаборатория	11110	Клеточная культура
24-луночный планшет	Лаборатория	11310	Клеточная культура
40 μ m Сетчатый фильтр	Корниг	352340	Фильтрация для удаления агломератов
Шприц 50 мл	ДОБРАЯ ГРУППА (KDL)	60017040
75% этанола	Шанхай Няньюэ Биотехнология Ко., Лтд	31009001	Дезинфицируйте кожу мышей
Ализарин Ред С	Сигма-Олдрич	А5533	Обнаружение отложений кальция и кальцинированных узелков
Моноклональное антитело APC CD44 (клон: IM7)	eBioscience	17-0441-82	Проточная цитометрия
APC Rat IgG2b для контроля изотипа (клон: eB149/10H5)	eBioscience	17-4031-82	Проточная цитометрия
Автоклав	Японская компания Hiryama	ХВЕ-50	Стерилизационные хирургические инструменты
CO2 инкубатор	Thermo Fisher Technology (China) Co., Ltd.	300583057	Клеточная культура
Цитофлексная флоуметрия	Бекман Коултер	А00-1-1102	Проточная цитометрия
Дексаметазон	Сигма-Олдрич	Д4902	Остеогенная дифференциация BMSC
Тарелка (100 мм)	Корнинг	430167	Клеточная культура
Блюдо (60 мм)	Корнинг	430166	Размещение образца во время трансплантации
Дезинфицирующие ватные шарики	Шанхай Хунлун Индастриал Ко., Лтд.	20230627	Дезинфицируйте кожу мышей
Одноразовые стерильные перчатки	Шанхай Хунлун Индастриал Ко., Лтд	YT21131	Стерильная операция
Диета для облученных грызунов с двойным львом	Сучжоу Шуанши Экспериментальная технология кормов для животных Лтд.	Великобритания 14924.3	Корма
Фетальная сыворотка крупного рогатого скота	Шанхайская компания Biosun Sci& Тек Ко., Лтд.	БС-0002-500	Клеточная культура
FITC Хомяк против крыс CD29 (клон: Ha2/5)	BD Biosciences	555003	Проточная цитометрия
FITC Hamster IgM, λ 1 Контроль изотипа (клон: G235-1)	BD Biosciences	553960	Проточная цитометрия
желатин (0.1%)	ОриСелл	ГЛТ-11301	усиливают адгезионную способность клеток
Клетка для мышей IVC	Сучжоу Царь обезьян Технология экспериментального оборудования для животных Ко., Лтд.	ЧХ-ММБ-2	Барьер для животных
L-аскорбиновая кислота	Сигма-Олдрич	А8960	Остеогенная дифференциация BMSC
Перо для пометок	Зебра Трейдинг (Шэньчжэнь) Ко., Лтд.	YYST5	Отметьте клеточную информацию на чашке Петри
Модификация MEM Alpha (1X)	Шанхай Няньюэ Биотехнология Ко., Лтд	SH30265	Клеточная культура
Набор для адипогенной дифференцировки мезенхимальных стволовых клеток костного мозга мыши	Циаген	МУКСМХ-90031	Дипогенная дифференциация БМСК
Nikon Eclipse Ti2 Инвертированный микроскоп Synstem	Япония Nikon Corporatin	Ti2-U	Наблюдайте за клетками и фотографируйте
Офтальмологические ножницы	Шанхай Няньюэ Биотехнология Ко., Лтд	Y00030 JZ	Срезать кожицу
Офтальмологический пинцет	Шанхай Няньюэ Биотехнология Ко., Лтд	BS-ZER-S-100 Биошарп	Получить костную ткань мыши.
ПАСТЕРОВСКАЯ ПИПЕТКА	Шанхай Няньюэ Биотехнология Ко., Лтд	БС-ХГ-03М	Аспирация питательной среды
PE Rat Anti-Mouse CD31 (клон: Ha2/5)	BD Biosciences	553373	Проточная цитометрия
ПЭ крысы IgG2a, κ Контроль изотипа (клон: R35-95)	BD Biosciences	553930	Проточная цитометрия
PE-Cyanine7 Ly-6A/E (Sca-1) Моноклональное антитело (клон: D7)	eBioscience	25-5981-82	Проточная цитометрия
PE-Cyanine7 Крыса IgG2a каппа контроль изотипа (клон: eBR2a)	eBioscience	25-4321-82	Проточная цитометрия
Пенициллин-стрептомицин	Шанхай Няньюэ Биотехнология Ко., Лтд	2585636	Клеточная культура
PerCP-Cy5.5 Крыса против мыши CD45 (клон: Ha2/5)	BD Biosciences	561869	Проточная цитометрия
PerCP-Cy5.5 крыса IgG2b, κ Контроль изотипа (клон: A95-1)	BD Biosciences	550764	Проточная цитометрия
Скальпели	Фабрика хирургических инструментов oShanghai Medical Devices? Group?Co., Ltd.	J11010-10# JZ	Изолируйте задние конечности и туловище мыши, а также удалите посторонние ткани из кости
Стерильный капюшон	Thermo Fisher Technology (China) Co., Ltd.	ЭКО0,9	Хирургический операционный стол
стерильные хирургические простыни	Хэнань Хуаюй Медицинское оборудование Ко., Лтд.	20160900	Обеспечить стерильную операционную зону
Тюбик (50 мл)	Шанхай Байсай, Биотехнологическая Компания, Лтд.	Здание-BL2002500	Хранение раствора отфильтрованной ячейки
трипсин-ЭДТА (0,25%)	Gibco	25200056	переваривать адгезивные клетки
&бета;-глицерофосфат	Сигма-Олдрич	Г5422	Остеогенная дифференциация BMSC