Method Article

Манипулирование механическими силами в развивающемся сердце рыбки данио с помощью магнитных бусин

DOI:

10.3791/67604

⸱

January 3rd, 2025

 ,  , 
1Department of Bioengineering, Imperial College London, 2The Francis Crick Institute, 3Institute of Advanced Medical Sciences, Tokushima University, 4Department of Cell Biology, National Cerebral and Cardiovascular Center Research Institute

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом протоколе описывается метод прививки магнитной бусины в развивающееся сердце рыбки данио с помощью микрохирургии, что позволяет манипулировать механическими силами in vivo и запускать зависимый от механических стимулов приток кальция в клетки эндокарда.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Механические силы непрерывно обеспечивают обратную связь с морфогенетическими программами сердечных клапанов. У рыбок данио развитие сердечных клапанов зависит от сокращения сердца и физических стимулов, генерируемых бьющимся сердцем. Внутрисердечная гемодинамика, управляемая кровотоком, является фундаментальной информацией, формирующей развитие сердца эмбриона. В данной статье мы описываем эффективный метод манипулирования механическими силами in vivo путем прививки магнитной бусины диаметром от 30 до 60 мкм в просвет сердца. Введение шарика осуществляется с помощью микрохирургии в личинках, находящихся под наркозом, без нарушения функции сердца и позволяет искусственно изменять граничные условия, тем самым изменяя силы потока в системе. В результате, присутствие шарика усиливает механические силы, испытываемые клетками эндокарда, и может напрямую вызвать приток кальция, зависящий от механического стимула. Этот подход облегчает исследование путей механотрансдукции, которые управляют развитием сердца, и может дать представление о роли механических сил в морфогенезе сердечных клапанов.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

С момента своего появления в конце 1970-хгодов1 данио рерио (Danio rerio) превратилась в мощную модельную систему для изучения тонкостей развития сердца и врожденных пороков сердца. В отличие от большинства позвоночных, включая эмбрионы мышей и цыплят, которые полагаются на функциональную сердечно-сосудистую систему и не могут выжить при ранних пороках сердца, рыбки данио обеспечивают уникальное преимущество, позволяя исследовать тяжелые фенотипы сердца. Это связано с их небольшими размерами, что способствует достаточному снабжению кислородом за счет пассивной диффузии, позволяя выживать даже при отсут....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Процедуры работы с эмбрионами рыбок данио, описанные в настоящем протоколе, соответствуют Европейской директиве 2010/63/ЕС и руководящим принципам МВД Великобритании в соответствии с PP6020928 лицензии на проект.

1. Получение эмбрионов данио-рерио для прививки бусинами

  1. Пересеките соответствующую линию рыбок данио и выращивайте эмбрионы в среде Danieau при температуре 28,5 °C. Для получения более подробных инструкций по пересечению линий данио-рерио обратитесь к базе данных научного образования JoVE27.
  2. Обрабатывайте эмбрионы 1-фенил-2-тиомочевиной....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Примеры успешной прививки бусин показаны на рисунках 3, видео 3 и видео 4. Магнитная бусина была правильно расположена в предсердии сердца рыбки данио, что позволило обеспечить беспрепятственный кровоток и не наблюдалось кровоизлияния. Кроме того, стенки сердца сохраняли свою структурную целостность, не разрушаясь (Рисунок 3 и Видео 3). Через 24 ч у эмбриона не было признаков отека перикарда, что еще раз подтвер.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Критические шаги в протоколе и устранение неполадок

Посадка эмбрионов рыбок данио рерио

Количество агарозы, используемой для выращивания эмбрионов, имеет важное значение. Сформированный купол не должен быть чрезмерно большим, так как это может затруднить манипуляцию бусиной с поверхности к зародышам. И наоборот, он не должен быть слишком маленьким; Наличие нескольких бусин на вершине агароз.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конфликта интересов, о котором можно было бы заявить.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим сотрудников лаборатории Vermot за обсуждения и комментарии по протоколу. Мы благодарны всем сотрудникам рыбного хозяйства Имперского колледжа Лондона. Этот проект получил финансирование от Европейского исследовательского совета (ERC) в рамках программы исследований и инноваций Европейского Союза Horizon 2020: GA N°682939, Additional Ventures (номер 1019496), MRC (MR/X019837/1) и BBSRC (BB/Y00566X/1). CV-P была поддержана стипендией факультета биоинженерии (Имперский колледж Лондона). HF был поддержан JSPS KAKENHI (23H04726 и 24K02207), программой JST FOREST (23719210), Мемориальным фондом Уэхара, Фондом исследований клет....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
<прочные>Материалы
Необходимое оборудование для выращивания, разведения и сбора
Тарелка со стеклянным дном (35 мм x 15  мм)VWR International734-2905
ТермоблокEppendorfEP5382000031Eppendorf ThermoMixer C
Ювелирные щипцыSigma-AldrichF6521-1EADumont No. 5, L 4 1/4 in., сплав Inox
Микроцентрифужные пробирки 2 млEppendorf30120094
пипетка
чашкаПетри
Стереомикроскоп
<сильно>Реагенты
4 мг/мл стоковый раствор
Danieau's medium (60x стоковый раствор)
PureCube Glutathione MagBeadsCube Biotech32201
PTU (1-фенил-2-тиомочевина)Sigma-AldrichP7629
UltraPure низкая температура плавления агарозныйInvitrogen16520-050
Danieau's medium (60x стоковый раствор)
34,8 г NaClSigma-AldrichS3014
1,6 г KClSigma-AldrichP9541
5,8 г CaCl2· 2H2OSigma-AldrichC3306
9,78 г MgCl2· 6H2O Sigma-Aldrich442611-M
Растворите ингредиенты в H2O до конечного объема 2 л. Отрегулируйте pH до 7,2 с помощью NaOH, затем проведите автоклав.
<сильный>4 мг/мл стоковый раствор трикаина
400 мг порошка трикаина (этил-3-аминобензоатная метасульфонатная соль)Sigma-AldrichA5040
97,9 мл дважды дистиллированный H2O
2,1 мл 1 М Трис (pH 9)
Отрегулируйте pH до 7, затем аликвоту и храните при -20°C.
эмбрионов рыбок данио-рериоПастератрикаина

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291 (5813), 293-296 (1981).
  2. Tu, S., Chi, N. C. Zebrafish models in cardiac development and congenital heart birth defects.....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Zebrafish HeartMechanical ForcesMagnetic BeadsHeart Valve DevelopmentCardiac MorphogenesisMechanotransduction PathwaysCalcium InfluxOptical ImagingMicrosurgeryCardiac Hemodynamics

Related Articles