Методическая статья

Подходы структурной биологии и аналитической химии к характеристике метаболических ферментов С-гликозида в микробиоте кишечника человека

1.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/67629

⸱

23 мая 2025 г.

 ,  ,  ,  , 
1The School of Life Science, Beijing University of Chinese Medicine

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Недавние исследования подчеркивают роль ферментов кишечной микробиоты человека в метаболизме С-гликозидов. В данной работе мы представляем комплексную методологию, объединяющую методы аналитической химии (ЖХ-МС/МС и ЯМР) с подходами структурной биологии для систематической характеристики структурных и ферментативных реакционных цепей этих ферментов, метаболизирующих С-гликозид.

Аннотация

Микробиота кишечника стала ключевым модулятором здоровья хозяина, в частности, благодаря своей способности метаболизировать пищевые гликозиды. В то время как С-гликозиды демонстрируют превосходную химическую стабильность и устойчивость к ферментативному расщеплению по сравнению с О-гликозидами, специализированные кишечные бактерии могут избирательно метаболизировать их, улучшая их биодоступность. С момента идентификации ферментов микробной С-гликозидазы точные механизмы реакций остаются не до конца понятными, а стандартизированные методологии изучения этих процессов до сих пор не устоялись. Чтобы восполнить этот пробел, мы внедрили комплексный междисциплинарный подход, сочетающий структурную биологию, энзимологию и аналитические методы, включая жидкостную хроматографию-тандемную масс-спектрометрию (ЖХ-МС/МС) и ядерный магнитный резонанс (ЯМР), для систематической характеристики этих ферментативных активностей. Этот комплексный подход позволяет точно охарактеризовать метаболизм С-гликозидов на молекулярном, ферментативном и метаболическом уровнях.

Введение

В последнее время микробиота кишечника человека привлекла к себе значительное внимание в связи с ее решающей ролью в поддержании здоровья хозяина 1,2. Эти микробные сообщества метаболизируют соединения, полученные от хозяина, продуцируя биологически активные метаболиты 1,2,3. Например, флавоноиды, одни из самых распространенных природных соединений в нашем ежедневном рационе, существуют в основном в виде О- или С-гликозидов, которые сами по себе плохо усваиваются в кишечникечеловека. Тем не менее, микробиота кишечника может преобразовывать эти гликозиды в более биологически активные производные, такие как вторичные гликозиды или агликоны, снижая их растворимость и улучшая их абсорбцию, тем самым улучшая их биологическую активность по сравнению с их нативными формами 5,6.

Исторически сложилось так, что механизмы гидролиза О-гликозидов были широко изучены 7,8. С-гликозиды, характеризующиеся своими гликозидными связями С-С, демонстрируют большую химическую стабильность и устойчивость к расщеплению 9,10. Несмотря на это, некоторые кишечные бактерии развили способность дегликозилировать С-гликозиды11,12. В 1988 году Хаттори и др. впервые продемонстрировали, что некоторые кишечные бактерии могут удалять гликозильные группы из С-гликозидов13. В последующих исследованиях был выделен первый штамм бактерий, способный к такой активности, что позволило продолжить изучение механизмов расщепления С-гликозида14. На сегодняшний день, однако, было идентифицировано и охарактеризовано лишь ограниченное число штаммов кишечных бактерий и ферментов, метаболизирующих С-гликозид 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 . Недавние исследования показали, что ферменты дегликозилирования пуэрарина (даидзеин-8-С-глюкозид) (DgpA/B/C) в штамме PUE способны расщеплять пуэрарин на даидзеин и глюкозу с помощью двухступенчатых процессов: DgpA, оксидоредуктаза семейства Gfo/Idh/MocA, окисляет пуэрарин до 3''-оксо-пуэрина, который затем подвергается реакции элиминации β, опосредованной комплексом DgpB/C, с образованием агликона и глюкозы10. 26. Тем не менее, структурные и функциональные характеристики ферментов, метаболизирующих С-гликозид, в частности системы DgpA/B/C, остаются не до конца изученными, и существует потребность в более совершенных методологиях, в частности, интеграции биологических и химических стратегий, для продвижения исследований вэтой области.

Чтобы восполнить этот пробел, мы используем комплексные междисциплинарные подходы к исследованию метаболической реакции DgpA/B/C, катализируемой микробиотой кишечника человека. В этой реакции DgpA катализирует окисление гликозилов С-гликозидов, в результате чего DgpB и DgpC образуют комплекс DgpB/C, который специфически расщепляет окисленные продукты С-гликозида 10,26,27. Сначала мы провели рекомбинантную экспрессию и очистку DgpA и DgpB/C отдельно. Затем очищенные белки DgpA и DgpB/C кристаллизовали, а их трехмерные структуры определяли с помощью рентгеновской кристаллографии. Наконец, мы восстановили функцию расщепления С-гликозида с использованием полной ферментной системы DgpA/B/C, с комплексным анализом метаболических продуктов, проведенным с помощью сопряженной ЖХ-МС/МС и ЯМР-спектроскопии27. Основываясь на этих подходах, мы изучили метаболизм С-гликозидов, катализируемый ферментной системой DgpA/B/C.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Производство и очистка белка

  1. Построение вектора экспрессии
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании гены DgpA, DgpB и DgpC из микробиоты кишечника человека, штамма PUE , служат модельной системой. Первый этап включает в себя использование экспрессирующих плазмид для производства соответствующих рекомбинантных белков.
    1. Получите кластерную последовательность генов DgpA/B/C (GenBank: LC422372.1) от NCBI. Затем коммерчески синтезируйте ДНК DgpA/B/C и индивидуально клонируйте гены DgpA, DgpB и DgpC в модифицированный вектор pET-28a, который будет продуцировать целевой белок с N-концевым SUMO и меткой 6×His (метка His-SUMO)28.
    2. Трансформируйте каждую из плазмид DgpA, DgpB или DgpC в компетентные клетки E. coli BL21 (DE3). Затем культивируют бактерии в среде LB с 50 мкг/мл канамицина при 37 °С.
    3. Добавьте 0,2 мМ IPTG в среду, когда плотность бактерий (OD600) достигнет 0,6. Культивируйте бактерии при температуре 16 °C в течение 16 часов.
    4. Центрифугируйте каждый из DgpA, DgpB и DgpC, экспрессирующих бактериальную культуру при 4000 x g в течение 20 мин при 4°C. Ресуспендируйте клеточную гранулу в 20 мл буфера А (табл. 1) на каждый 1 л бактериальной культуры.
  2. Очистка белка
    Примечание: Высокая чистота, достаточное количество рекомбинантных ферментов имеет важное значение для функциональной характеризации и структурно-биологических исследований. DgpB и DgpC образуют стабильный белковый комплекс (спонтанно образуют комплекс DgpB/C во время процедуры лизиса) для функционального обеспечения10,26. Затем проводят очистку белка DgpA и комплекса DgpB/C.
    1. Добавьте 1 мМ PMSF в бактериальную ресуспензию. Смешайте бактериальную суспензию DgpB и DgpC, полученную на шаге 1.1.4, и затем лизируйте бактериальную суспензию DgpA или смесь DgpB и DgpC (с образованием функционального комплекса DgpB/C) с помощью ультразвукового клеточного разрушителя.
    2. Центрифугируйте бактериальный лизат при 48 000 x g в течение 40 мин при 4 °C. Сохраните надосадочную жидкость, содержащую белок, и выбросьте бактериальную гранулу.
    3. Очистите комплекс DgpA или DgpB/C от надосадочной жидкости с помощью колонки аффинной хроматографии никеля (Ni-NTA). Элюируйте связанные белки, применяя градиент концентрации имидазола 0 - 50% с буфером A и буфером B (Таблица 1) в очистителе ÄKTA.
    4. Возьмите 10 μL элюированных образцов и смешайте их с 2 μL 5 × белкового красителя, затем выполните электрофорез SDS-PAGE при напряжении 220 В в течение 45 минут с использованием вертикальной системы электрофореза, а затем окрашивание Coomassie Blue для визуализации белковых полос. Соберите фракции, содержащие DgpA или комплекс DgpB/C на основе анализа SDS-PAGE, для дальнейшего использования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: DgpA (44 кДа) с меткой His-SUMO (17 кДа) мигрирует со скоростью около 61 кДа (рисунок 2D), в то время как DgpC (33 кДа) с меткой His-SUMO (17 кДа) мигрирует примерно на 50 кДа, а DgpB (15 кДа) с меткой His-SUMO (17 кДа) мигрирует со скоростью около 33 кДа (рисунок 2J).
    5. Диализ сложных образцов DgpA или DgpB/C на этапе 1.2.3 с использованием мембраны для отсечения молекулярной массы 10 кДа против буфера С для удаления имидазола и убиквитин-подобной протеазы 1 (ULP1; Таблица материалов) фермент для удаления метки His-SUMO29.
    6. Загрузите образец диализованного белка в буфер C (таблица 1) через колонку ионообменной хроматографии (колонка Q). Затем элюируют связанный белок из колонки с использованием градиента концентрации хлорида натрия в диапазоне от 100 мМ до 600 мМ, приготовленного с использованием буфера C и буфера D (таблица 1) в очистителе ÄKTA.
    7. На шаге 1.2.3 проведите анализ комплекса DgpA и DgpB/C с элюированием из столбца Q с помощью SDS-PAGE, отметив молекулярные массы: His-SUMO tag (17 кДа), DgpA (44 кДа), олигомерные полосы DgpA (выше 95 кДа) (рисунок 2E), DgpB (15 кДа), DgpC (33 кДа), олигомерные полосы DgpB и DgpC (от 53 кДа до 95 кДа) (рисунок 2K).
    8. Очистите белок с помощью колонки исключения размера (SEC) с буфером E (Таблица 1). Проведите анализ SDS-PAGE с использованием белков из фракции элюирования с последующим окрашиванием Coomassie Blue для визуализации белковых полос. Соберите фракции, содержащие целевой белок DgpA или комплекс DgpB/C, после анализа с помощью SDS-PAGE.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Полоса DgpA наблюдается на уровне около 44 кДа с олигомеризованной полосой DgpA выше 95 кДа (рисунок 2F), в то время как DgpC находится на уровне около 33 кДа, а DgpB - около 15 кДа с олигомеризованными DgpB и DgpC (между 53 кДа и 95 кДа) (рисунок 2L).
    9. Измерьте концентрацию белка комплекса DgpA или DgpB/C с помощью нанокапли при длине волны 280 нм. Затем сконцентрируйте комплекс DgpA или DgpB/C примерно до 20 мг/мл с помощью ультрафильтрационных трубок, аликвотируйте их и мгновенно заморозьте жидким азотом. Храните комплекс DgpA или DgpB/C при температуре -80 °C для дальнейшего использования.
  3. Сбор данных о спектре кругового дихроизма (CD)
    Примечание: Поскольку гликозиловое окисление, катализируемое DgpA, служит важнейшим этапом инициации метаболического пути, CD-спектроскопия была специально использована для проверки как надлежащего состояния сворачивания, так и вторичной структурной целостности DgpA. Эти структурные параметры критически важны как для ферментативной активности, так и для успешной кристаллизации белка.
    1. Разбавьте белок DgpA до 0,2 мг/мл с помощью 1 буфера PBS (pH 7,4) (Таблица 1).
    2. Загрузите 1x PBS буфер (pH 7,4) в кварцевую кювету и запишите базовый спектр CD на длине волны 200 - 260 нм с помощью CD-спектрометра для чувствительного обнаружения вторичной структуры и различий в состоянии сворачивания27.
    3. Замените буферную кювету образцами белка из 1.3.1, запишите спектр CD на длине волны 200 - 260 нм и вычтите базовый уровень буфера, чтобы получить спектр CD для образца белка.
    4. Соберите три сканирования для проверки точности и проанализируйте данные на наличие особенностей вторичной структуры и состояния сворачивания белка (рис. 3G, 3H).

2. Кристаллография и определение структуры белка

Примечание: После подтверждения того, что DgpA поддерживает надлежащую складчатость и структурную целостность, для определения трехмерных структур обоих DgpA были применены подходы структурной биологии. Учитывая, что каталитическая компетентность комплекса DgpB/C была биохимически подтверждена с помощью предыдущих функциональных анализов 10,26,27, этап спектральной верификации CD был опущен.

  1. Рост и оптимизация кристаллов белка
    1. Смешайте 0,5 мкл очищенного DgpA (20 мг/мл) или комплекса DgpB/C (20 мг/мл) с равным объемом (0,5 мкл) пластового раствора из кристаллизационных наборов на 48-луночных кристаллических планшетах методом сидячих капель30. Перенесите кристаллические пластины при температуру 16 °C для роста кристаллов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Наблюдайте за этими сидячими каплями с помощью микроскопа, чтобы определить условия (включая концентрацию белка и осадков, таких как PEG 3350, формиат магния и т. д.) для роста сложных кристаллов DgpA или DgpB/C.
    2. Выполните оптимизацию кристаллизации как для DgpA, так и для комплекса DgpB/C с использованием метода диффузии пара с висячими каплями30.
    3. Для DgpA начните с условия, определенного на шаге 2.1.1 (20 мМ формиата магния, 20% PEG3350) и примените ортогональный подход к оптимизации, протестировав шесть градиентов концентрации PEG3350 (17%, 18%, 19%, 20%, 21% и 22%) по четырем градиентам концентрации формиата магния (16 мМ, 18 мМ, 20 мМ и 22 мМ)30.
    4. Кристаллизационные капли приготовить, смешав 0,8 мкл раствора белка DgpA (10 или 20 мг/мл) с 0,8 мкл резервуарного раствора на покровных стеклах силанизированного стекла. Затем переверните покровные стекла над 24-луночными кристаллизационными планшетами и инкубируйте при 16 °C для роста кристаллов.
    5. Для оптимизации комплекса DgpB/C используйте тот же подход: смешайте 0,8 мкл белкового комплекса (10 или 20 мг/мл) с 0,8 мкл резервуарного раствора, содержащего ацетат магния (16, 18, 20 или 22 мМ) и PEG 8000 (8%, 9%, 10%, 11%, 12% или 13%). Аналогичным образом установите подвесные капли на силанизированные покровные стекла над 24-луночными планшетами и инкубируйте при 16°C.
    6. Дать кристаллам белка комплекса DgpA и DgpB/C вырасти до полного размера до тех пор, пока они не перестанут расти, а затем перенести кристаллы в раствор для замачивания, содержащий буфер-резервуар и 5 мМ субстратных соединений (глюкозу и пуэрин) комплекса DgpA и DgpB/C при 16 °C в течение 30 мин.
    7. Перенесите кристаллы, в том числе DgpA (без глюкозы или без субстрата) и комплекс DgpB/C (без субстрата), в раствор криопротектора, содержащий состояние буфера для замачивания с добавлением 25% глицерина, и немедленно храните их в жидком азоте для сбора данных.
      Примечание: Несмотря на то, что кристаллы комплекса DgpA и DgpB/C были пропитаны субстратами (глюкозой и пуэрином), только глюкоза была успешно включена в каталитический центр DgpA. Следовательно, для структурного анализа были получены три различные кристаллические формы: DgpA с глюкозой (рис. 3E); не содержащий субстрата DgpA (рис. 3B-C); и бессубстратный комплекс DgpB/C (Рисунок 3D). Криопротекторный раствор защищает кристаллы белка, предотвращая образование льда при мгновенном охлаждении в жидком азоте, тем самым сохраняя их структурную целостность и сводя к минимуму радиационно-индуцированное повреждение. Обычно в состав раствора входит маточный раствор в качестве основы, в него добавляют оптимизированные концентрации криопротекторов (например, глицерина или этиленгликоля).
  2. Сбор данных и определение структуры
    1. Соберите данные рентгеновской дифракции кристалла для DgpA с глюкозой или в безсубстратной форме и комплекса DgpB/C в бессубстратной форме в Шанхайском центре синхротронного излучения (SSRF) Шанхайского национального научного центра белка (NFPS) с падающей длиной волны 0,978 Å.
    2. Обработка трех наборов рентгеновских дифракционных данных, включая комплекс DgpA и DgpB/C, с использованием программного обеспечения для обработки кристаллографических данных31. Сначала загрузите исходные данные, затем последовательно выполните функции индекса, интеграции и масштабирования, нажимая соответствующие кнопки в программном обеспечении. Сгенерируйте обработанный выходной файл (output.sca), пригодный для последующего определения структуры.
    3. Определите структуры DgpA с глюкозой или в бессубстратных формах (рис. 3B-C, 3E) и комплекса DgpB/C в безсубстратных формах (рис. 3D) с помощью метода молекулярного замещения (таблица материалов). А затем уточнить структуры и электронные карты, включив в них соответствующие лиганды (такие как глюкоза, Mn2+, H2O и т. д.).31.

3. Контроль активности реакции и определение кинетических параметров

Примечание: Система DgpA/B/C опосредует превращения C-гликозидов через определенный двухступенчатый каскад: DgpA инициирует катализ путем окисления сахарной части, генерируя промежуточный продукт, который комплекс DgpB/C впоследствии расщепляет или изомеризует 10,26,27. В данном исследовании DgpA/B/C относится к ферментам, ответственным за этот каскад реакций, при этом следует отметить, что прямого взаимодействия между DgpA и комплексом DgpB/C не происходит. Эта связанная активность может быть строго количественно определена с помощью трех взаимодополняющих подходов: анализ продукта ВЭЖХ, спектрофотометрические анализы, связанные с DCPIP, мониторинг переноса электронов, или детальная кинетическая характеристика параметров реакции27,32. В частности, продукты расщепления С-гликозида (даидзеин), образующиеся при катализе DgpA/B/C, анализировали с помощью ВЭЖХ (УФ-детектирование при длине волны 265 нм). Формообразование продукта количественно определяли с помощью стандартной калибровочной кривой (метод построения стандартной кривой подробно описан в примечании к шагу 3.3.2.), а кинетические параметры определяли путем подгонки скоростей формирования продукта к модели Михаэлиса-Ментена с помощью нелинейного регрессионного анализа27,32. Анализ ингибирования, измеряющий влияние глюкозы на расщепление С-гликозидной связи пуэрарина, предоставил подтверждающие доказательства того, что сахариды могут служить субстратами для DgpA. Впоследствии с помощью анализа DCPIP отслеживаются реакции окисления сахаров, измеряя восстановление 2,6-дихлорфенолинофенола синего цвета (DCPIP) до бесцветного лейко-DCPIP, поскольку он принимает электроны из окисленных сахаров33, тем самым отражая каталитическую активность DgpA.

  1. Мониторинг активности DgpA/B/C с помощью ВЭЖХ
    1. Проведите катализируемую DgpA/B/C реакцию расщепления или изомеризации C-гликозида в 500 мкл буфера F (табл. 1), содержащего 20 мкМ DgpA и комплекс DgpB/C (из этапа 1.2.7), и 0,1 мМ либо: пуэрарина или генистеина-8-С-глюкозида для реакций расщепления, или дайдзина или генистина для реакций изомеризации27. Проводите реакции при 37 °C в течение 8 ч и завершите их, добавив в реакционную смесь 1,5 мл метанола.
    2. Центрифугируйте реакционный раствор при 16 000 × г в течение 15 мин для удаления белкового осадка, образовавшегося в результате денатурации фермента, вызванной метанолом. Отфильтруйте надосадочную жидкость с помощью фильтрующей мембраны 0,22 мкм.
    3. Выполнение анализа ВЭЖХ с градиентным элюированием, при расходе 1 мл/мин при объеме инжекции 10 мкл и длине волны детектирования УФ 265 нм.
      Мобильные фазы представляли собой ацетонитрил (Mobile Phase A) и 0,1% водно-уксусную кислоту (Mobile Phase B) с градиентным элюированием. Градиент элюирования подвижной фазы составляет: 5%-20% А через 0-5 мин, 20%-45% А через 5-15 мин, 45%-52% А через 15-18 мин, 52%-55% А через 18-19 мин, 55%-5% А через 19-21 мин и 5% А через 21-23 мин. Ферментная система DgpA/B/C демонстрирует заметно различную каталитическую эффективность по отношению к таким субстратам, как дайдзин и генистин, что приводит к существенным различиям в соответствующих скоростях образования их продуктов. Для количественной оценки кинетики конверсии подложки и динамики накопления продукта был проведен комплексный анализ временного хода с использованием ВЭЖХ с интервалами 0, 2, 4, 6, 12, 16, 20, 24, 36 и 48 часов.
  2. Мониторинг активности DgpA с помощью анализа на 2,6-дихлорфенолиндофенол (DCPIP)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ DCPIP контролирует окисление сахара путем измерения восстановления синего DCPIP до бесцветного лейко-DCPIP, поскольку он принимает электроны из окисленных сахаров33. В данном случае репортерный анализ DCIPIP был использован для регистрации окислительной активности DgpA по отношению к различным гликозилированным соединениям, моносахаридам, дисахаридам или полисахаридам. Использовался дикий тип DgpA и его дефектные сахарсвязывающие мутанты, включая D182A, Δ(308-316) и Δ(311-316)27.
    1. Инкубируйте 0,8 мМ DCPIP, 50 мкМ белок, включая дикий тип DgpA и три его сахарсвязывающих дефектных мутанта (DgpA D182A, DgpA Δ(308-316) или DgpA Δ(311-316)), с 10 мМ субстратов, включая пуэрарин, витексин, генистин, растворимый крахмал, мальтотриозу, лактозу, сахарозу, глюкозу или мальтозу в 1x PBS буфере (pH 7,4).
    2. После 20 ч реакции зарегистрируйте изменение поглощения DCPIP при длине волны 600 нм с помощью считывателя микропланшетов33.
  3. Определение скорости ингибирования глюкозы в реакции расщепления С-гликозидной связи пуэрарина
    Примечание: DgpA принадлежит к семейству ферментов сахарооксидоредуктаз, способных окислять сахарную часть С-гликозидов. На рисунке 3Е показано, что глюкоза связана с каталитическим центром DgpA, а протокол определения структуры DgpA подробно описан на шаге 2.2.3. Для изучения конкурентного связывания DgpA между глюкозой и С-гликозидом пуэрином были проведены следующие эксперименты.
    1. Проведите реакцию в 1 × PBS буфере (pH 7,4). Добавьте различные концентрации глюкозы (1 мМ, 5 мМ, 10 мМ, 20 мМ, 50 мМ, 80 мМ и 100 мМ) в систему реакции расщепления С-гликозида (пуэрина), как описано в шаге 3.1. Проводите реакцию при 37 °C в течение 12 часов.
    2. Выполните количественный анализ продукта (даидзеина) с использованием калибровочной кривой ВЭЖХ для эталонного соединения (стандартный даидзеин). Рассчитайте скорость ингибирования, сначала определив разницу в выходе продукта между реакциями, содержащими различные концентрации глюкозы, и реакциями расщепления неингибированного С-гликозида (без глюкозы), а затем разделите эту разницу на выход продукта из неингибированной реакции.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы построить калибровочную кривую для количественного анализа ВЭЖХ, подготовьте последовательное разведение эталона (например, пуэрарина или даидзеина) в диапазоне концентраций (например, 0,1-1 мМ, с шагом 0,1 мМ). Проанализируйте каждую концентрацию с помощью ВЭЖХ, запишите пиковые области и сопоставьте их с соответствующими стандартными концентрациями. Выполните линейный регрессионный анализ (y = mx + b, где y = площадь пика, x = концентрация) для построения стандартной кривой. Затем уравнение регрессии может быть использовано для интерполяции неизвестных концентраций образцов из их измеренных пиковых областей.
  4. Определение кинетических параметров
    Примечание: Кинетические параметры широко признаны в качестве критически важных золотых стандартов для количественной оценки ферментативной каталитической эффективности. Для количественной оценки реакций, катализируемых DgpA/B/C, были определены кинетические параметры реакций расщепления С-гликозида пуэрарина, катализируемых DgpA/B/C.
    1. Подготовьте градиенты концентрации субстрата С-гликозида (пуэрина) (в диапазоне от 0,01 до 4 мМ с 2-кратным шагом) для катализируемой DgpA/B/C реакции расщепления С-гликозида.
    2. Проведите реакцию при 37 °C в течение 8 ч в соответствии со методом, описанным в шаге 3.1. Выполните количественный анализ продукта (даидзеина) с использованием калибровочной кривой ВЭЖХ стандартного даидзеина. Затем рассчитайте скорость реакции (скорость образования продукта), разделив количественное количество на время реакции.
    3. Определение кинетических параметров Km и kcat путем подгонки рассчитанной скорости реакции и концентрации субстрата к модели Михаэлиса-Ментена с помощью статистического программного обеспечения (Таблица материалов).

4. Приготовление и детектирование промежуточного продукта реакции

Примечание: Помимо активности расщепления С-гликозидов, DgpA/B/C также катализирует изомеризацию О-гликозидов в С-гликозиды. Следовательно, когда О-гликозиды используются в качестве субстратов для DgpA/B/C, промежуточные продукты будут образовываться в виде изомеризованных С-гликозидов. Чтобы охарактеризовать промежуточный продукт (пуэрин), промежуточное соединение очищали и впоследствии анализировали с помощью инструментов аналитической химии, включая LC-MS/MS и ЯМР-спектроскопию.

  1. Получение промежуточного продукта реакции в реакции изомеризации DgpA /B/C-гликозида 27
    1. Готовят катализируемую DgpA/B/C реакцию изомеризации O- в C-гликозид с использованием 0,2 мМ O-гликозида (даидзина) в качестве субстратов и комплекса 20 мкМ DgpA и DgpB/C в реакционном объеме 90 мл, следуя протоколу, описанному на вышеуказанном шаге 3.1.
    2. Очистите промежуточный продукт С-гликозид (пуэрин) с помощью препаративной ВЭЖХ по стратегии градиентного элюирования (ПРИМЕЧАНИЕ).
      Мобильные фазы представляли собой ацетонитрил (Mobile Phase A) и 0,1% водно-уксусную кислоту (Mobile Phase B) с градиентным элюированием. Градиент элюирования подвижной фазы составляет: 5%-20% А через 0-5 мин, 20%-45% А через 5-15 мин, 45%-52% А через 15-18 мин, 52%-55% А через 18-19 мин, 55%-5% А через 19-21 мин и 5% А через 21-23 мин.
    3. Рассчитайте концентрацию очищенного промежуточного продукта с помощью стандартной калибровочной кривой ВЭЖХ на шаге 3.3.2, получите около 6 мг пуэрарина в реакционной системе 90 мл на шаге 4.1.1, а затем высушите очищенные промежуточные продукты с помощью вакуумного центробежного концентратора для дальнейшего использования.
  2. Определение характеристик промежуточного продукта реакции с ЖХ-МС/МС
    1. Соберите высушенные промежуточные продукты с шага 4.1.3. Взвесьте 100 мкг промежуточных продуктов, полученных из даидзина, затем растворите его в 2 мл метанола до достижения конечной концентрации 50 мкг/мл. Центрифугируйте при давлении 13 500 x g в течение 10 мин и соберите надосадочную жидкость для анализа ЖХ-МС/МС.
    2. Используйте ту же программу градиентного элюирования ВЭЖХ на шаге 4.1.2 для анализа ЖХ-МС/МС с объемом впрыска 5 мкл.
  3. Определение характеристик промежуточного продукта реакции с помощью ЯМР
    1. Растворить 4 мг очищенных промежуточных продуктов реакции дайдзина в 340 мкл диметилсульфоксида-d 6 для 1Н и 13С ЯМР-спектроскопии. Установите следующие параметры прибора: температура 298 К, прокладка 3 раза, длительность импульса 18 мкс, задержка релаксации 1,5 с, 48 сканирований, при прочих параметрах при стандартных настройках27.
    2. Соберите спектры ЯМР 1, H и 13C с помощью ЯМР-прибора с частотой 600 МГц.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Следуя процедурам, изложенным в разделе Рисунок 1, мы сначала экспрессировали гены DgpA, DgpB и DgpC в E. coli Ячейки BL21(DE3). Так как DgpB и DgpC образуют стабильный ферментный комплекс (комплекс DgpB/C)10,26,27,34клетки, экспрессирующие эти два белка, были объединены для совместной очистки. После лизиса клеток надосадоч...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В настоящее время структурные и функциональные характеристики ферментов метаболизма С-гликозидов в полевых условиях остаются неясными, а соответствующие методы исследования отсутствуют 10,24,26. Используя значительные преимущества комбинированной химии и биотехнологии 40,41,42,43,44,45, исследование предлагает методологию исследования, которая использует структурную биологию, ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

Благодарности

Это исследование финансируется программой Startup fund в Пекинском университете китайской медицины (BUCM) (90011451310011) до W.M., программой чрезвычайного фонда против COVID-19 в BUCM (1000061223476) до W.M., инновационной командой и программой развития талантов Национального управления традиционной китайской медицины (ZYYCXTD-C-202006) до W.M. и независимым исследовательским проектом для аспирантов в BUCM(ZJKT2023012) до H.P. Мы благодарим всех сотрудников лаборатории Вэньфу Ма за полезную дискуссию.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
2,6-дихлориндофенол (DCPIP)Solarbio Science and TechnologyD6350
2-меркаптоэтанол(&бета;-ME)Sigma-Aldrich08168
  5× Белковый красильный красительSangon BiotechC508320
уксусной кислотойShanghai MACKLINA111247
ацетонитрилThermo Fisher Scientific™? InvitrogenA12147
Bruker Avance III HD 700 МГц ЯМР спектрометрBrukerAVANCE III HD 700 МГц
Bruker Ultrashield 400 Plus 400 МГцBrukerAVANCE III 400 МГц
Центрифуга 5424REppendorf022620601
Chirascan™ plus CD спектрометрПрикладная фотофизикаChirascan™  
DaidzeinShanghai Yuanye Bio-TechnologyB20227
DaidzinShanghai Yuanye Bio-TechnologyB20226
Dithiothreitol(DTT)Solarbio Science and TechnologyD8220
E. coli BL21 (DE3) компетентные клеткиThermo Fisher Scientific™? InvitrogenEC0114
GenisteinShanghai Yuanye Bio-TechnologyS31565
Genistein-8-C-глюкозидShanghai Yuanye Bio-TechnologyBP2095
GenistinShanghai Yuanye Bio-TechnologyS31591
GlucoseSigma-AldrichG8270
GraphPad Prism 9Программное обеспечениеGraphPadВерсия? Prism 9Рассчитать кинетические параметры Km и kcat
HiLoad Superdex 200 pg препаративные колонки SECCytiva28989335
HisTrap HP Его колонки для очистки белка метокCytiva17524802
HiTrap Q FF анионообменная хроматографическая колонкаCytiva17515601
HKL-3000HKL research Inc  версия 723
Колонка ВЭЖХ TC-C18(2), 170Å, 5&микро; m, 4,6 x 250 ммAgilent Technologies518925-902
Изопропил &бета;-D-1-тиогалактопиранозид? IPTG)Sigma-AldrichPHG0010
лактозаSigma-Aldrich17814
LC-20AT, высокоэффективная жидкостная хроматографияShimadzuLC20AT
MaltoseSigma-Aldrich47288
МальтотриозSigma-Aldrich443713
хлорид марганцаShanghai Yuanye Bio-TechnologyS31112
МетанолТермо Фишер Научный&торговля;? InvitrogenM23142
NAD+Solarbio Science and TechnologyN8110
Olympus SZX12 СтереомикроскопOLYMPUS SZX7
фенилметилсульфонилфторид (PMSF)Sigma-AldrichP7626 
PhenixКоманда разработчиков Phenix1.21.2Phenix — это комплексный пакет программного обеспечения для определения кристаллической структуры белка, объединяющий методы SAD (одноволновая аномальная дисперсия) и MR (молекулярная замена) с программным обеспечением Phaser.
Препаративный высокоэффективный жидкостный хроматографWaters2545/2998
Набор для скрининга кристаллов белкаHampton ResearchHR2-110/HR2-112/HR2-144/HR2-126/HR2-098
PuerarinShanghai Yuanye Bio-TechnologyB20446
Встряхивающий инкубаторShanghai Zhichu Instrument Co.,Ltd  ZQZY-AF8
SnakeSkin&торговля; Диализная мембрана, 10 кДа MWCO, 35 ммThermo Fisher Scientific™? Invitrogen88245
Растворимый крахмалSigma-AldrichS9765
Sorvall LYNX 6000 Сверхскоростная центрифугаThermo Fisher Scientific™
SpectraMax i3x Многорежимный считыватель микропланшетовMOLECULAR DEVICESSpectraMax i3x 
SpectraMax QuickDrop микрообъемный спектрофотометр технические характеристикиМОЛЕКУЛЯРНЫЕ УСТРОЙСТВАQuickDrop
SucroseSigma-AldrichS5016
SunFire C18 OBD Prep Колонка Воды186002741
Thermo Fisher Scientific Q EXACTIVEThermo Fisher Scientific™? InvitrogenIQLAAEGAAPFALGMBDK
Убиквитин-подобная протеаза 1Thermo Fisher Scientific™? Сверхнизкотемпературный12588018
Thermo Fisher Scientific905GP-ULTS
Вакуумный центробежный концентраторBeijing JM TechnologyCV600
VitexinSigma-Aldrich49513
75006590 морозильник Invitrogen

Ссылки

  1. Gomaa, E. Z. Human gut microbiota/microbiome in health and diseases: a review. Antonie Van Leeuwenhoek. 113 (12), 2019-2040 (2020).
  2. Thursby, E., Juge, N. Introduction to the human gut microbiota. Biochem J. 474 (11), 1823-1836 (2017).
  3. Nie, Q., et al. Gut symbionts alleviate MASH through a secondary bile acid biosynthetic pathway. Cell. 187 (11), 2717-2734.e33 (2024).
  4. Xie, L., et al. Comparison of flavonoid O-glycoside, C-glycoside and their aglycones on antioxidant capacity and metabolism during in vitro digestion and in vivo. Foods. 11 (6), (2022).
  5. Zhang, S. -J., Guo, J. -R., Kang, A., Di, L. -Q. Advance in studies on gut microbiota in de-glycosylation of traditional Chinese medicine glycosides. Zhongguo Zhong yao za zhi= Zhongguo Zhongyao ZazhiChina Journal of Chinese Materia Medica. 38 (10), 1459-1466 (2013).
  6. Xie, G. -Z., Hui, H. -Y., Peng, M. -J., Tan, Z. -J. Biotransformation of glycosides in herbal medicine by gut microbiota. World Chinese Journal of Digestology. 26 (4), 221(2018).
  7. Vuong, T. V., Wilson, D. B. Glycoside hydrolases: catalytic base/nucleophile diversity. Biotechnol Bioeng. 107 (2), 195-205 (2010).
  8. Davies, G., Henrissat, B. Structures and mechanisms of glycosyl hydrolases. Structure. 3 (9), 853-859 (1995).
  9. Ito, T., Fujimoto, S., Shimosaka, M., Taguchi, G. Production of C-glucosides of flavonoids and related compounds by Escherichia coli expressing buckwheat C-glucosyltransferase. Plant Biotechnology. 31 (5), 519-524 (2014).
  10. Wei, B., et al. Discovery and mechanism of intestinal bacteria in enzymatic cleavage of C-C glycosidic bonds. Appl Microbiol Biotechnol. 104, 1883-1890 (2020).
  11. Che, Q. M., Akao, T., Hattori, M., Kobashi, K., Namba, T. Metabolism of aloesin and related compounds by human intestinal bacteria: a bacterial cleavage of the C-glucosyl bond and the subsequent reduction of the acetonyl side chain. Chem Pharm Bull (Tokyo). 39 (3), 704-708 (1991).
  12. Wei, B., et al. Discovery and mechanism of intestinal bacteria in enzymatic cleavage of C-C glycosidic bonds. Appl Microbiol Biotechnol. 104 (5), 1883-1890 (2020).
  13. HATTORI, M., et al. Metabolism of barbaloin by intestinal bacteria. Chem Pharm Bull (Tokyo). 36 (11), 4462-4466 (1988).
  14. Che, Q. -M., Akao, T., Hattori, M., Kobashi, K., Namba, T. Isolation of a human intestinal bacterium capable of transforming barbaloin to aloe-emodin anthrone1. Planta medica. 57 (01), 15-19 (1991).
  15. Braune, A., Blaut, M. Deglycosylation of puerarin and other aromatic C-glucosides by a newly isolated human intestinal bacterium. Environ Microbiol. 13 (2), 482-494 (2011).
  16. Braune, A., Blaut, M. Intestinal bacterium Eubacterium cellulosolvens deglycosylates flavonoid C-and O-glucosides. Appl Environ Microbiol. 78 (22), 8151-8153 (2012).
  17. Hasanah, U., Miki, K., Nitoda, T., Kanzaki, H. Aerobic bioconversion of C-glycoside mangiferin into its aglycone norathyriol by an isolated mouse intestinal bacterium. Biosci Biotechnol Biochem. 85 (4), 989-997 (2021).
  18. Kim, D. -H., et al. Intestinal bacterial metabolism of flavonoids and its relation to some biological activities. Arch Pharm Res. 21, 17-23 (1998).
  19. Kim, M., Lee, J., Han, J. Deglycosylation of isoflavone C-glycosides by newly isolated human intestinal bacteria. J Sci Food Agric. 95 (9), 1925-1931 (2015).
  20. Tao, Z., et al. Isolation and identification of Enterococcus gallinarum P581a, a strain of intestinal bacteria deglycosylating flavone C-glycosides. J Gen Appl Microbiol. 68 (3), 125-133 (2022).
  21. Wang, S., et al. A newly isolated human intestinal strain deglycosylating flavonoid C-glycosides. Arch Microbiol. 204 (6), 310(2022).
  22. Xu, J., et al. Application of ultra-performance liquid chromatography coupled with quadrupole time-of-flight mass spectrometry to determine the metabolites of orientin produced by human intestinal bacteria. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 944, 123-127 (2014).
  23. Zheng, S., et al. A newly isolated human intestinal bacterium strain capable of deglycosylating flavone C-glycosides and its functional properties. Microb Cell Fact. 18, 1-10 (2019).
  24. Braune, A., Engst, W., Blaut, M. Identification and functional expression of genes encoding flavonoid O-and C-glycosidases in intestinal bacteria. Environ Microbiol. 18 (7), 2117-2129 (2016).
  25. Kumano, T., et al. FAD-dependent C-glycoside-metabolizing enzymes in microorganisms: Screening, characterization, and crystal structure analysis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 118 (40), e2106580118(2021).
  26. Nakamura, K., Zhu, S., Komatsu, K., Hattori, M., Iwashima, M. Deglycosylation of the isoflavone C-glucoside puerarin by a combination of two recombinant bacterial enzymes and 3-oxo-glucose. Appl Environ Microbiol. 86 (14), e00607-e00620 (2020).
  27. He, P., et al. Structural mechanism of a dual-functional enzyme DgpA/B/C as both a C-glycoside cleaving enzyme and an O- to C-glycoside isomerase. Acta Pharm Sin B. 13 (1), 246-255 (2023).
  28. Wang, Z., et al. Pro isomerization in MLL1 PHD3-bromo cassette connects H3K4me readout to CyP33 and HDAC-mediated repression. Cell. 141 (7), 1183-1194 (2010).
  29. Mossessova, E., Lima, C. D. Ulp1-SUMO crystal structure and genetic analysis reveal conserved interactions and a regulatory element essential for cell growth in yeast. Mol Cell. 5 (5), 865-876 (2000).
  30. Delucas, L. J., et al. Protein crystallization: virtual screening and optimization. Prog Biophys Mol Biol. 88 (3), 285-309 (2005).
  31. Minor, W., Cymborowski, M., Otwinowski, Z., Chruszcz, M. HKL-3000: the integration of data reduction and structure solution--from diffraction images to an initial model in minutes. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 62 (Pt 8), 859-866 (2006).
  32. Li, M., et al. An efficient C-glycoside production platform enabled by rationally tuning the chemoselectivity of glycosyltransferases. Nat Commun. 15 (1), 8893(2024).
  33. Peters, B., et al. Characterization of membrane-bound dehydrogenases from Gluconobacter oxydans 621H via whole-cell activity assays using multideletion strains. Appl Microbiol Biotechnol. 97 (14), 6397-6412 (2013).
  34. Nasseri, S. A., et al. An alternative broad-specificity pathway for glycan breakdown in bacteria. Nature. 631 (8019), 199-206 (2024).
  35. Rose, J. P., Wang, B. C. SAD phasing: History, current impact and future opportunities. Arch Biochem Biophys. 602, 80-94 (2016).
  36. Abramson, J., et al. Accurate structure prediction of biomolecular interactions with AlphaFold 3. Nature. 630 (8016), 493-500 (2024).
  37. Taberman, H., Parkkinen, T., Rouvinen, J. Structural and functional features of the NAD(P) dependent Gfo/Idh/MocA protein family oxidoreductases. Protein Sci. 25 (4), 778-786 (2016).
  38. Jahn, B., et al. Understanding the chemistry of the artificial electron acceptors PES, PMS, DCPIP and Wurster's Blue in methanol dehydrogenase assays. J. Biol. Inorg. Chem. 25, 199-212 (2020).
  39. Yu, L., et al. Biotransformation of puerarin into puerarin-6 ″-O-phosphate by Bacillus cereus. J Ind Microbiol Biotechnol. 39 (2), 299-305 (2012).
  40. Lin, H., et al. Lysineless HiBiT and NanoLuc tagging systems as alternative tools for monitoring targeted protein degradation. ACS Med Chem Lett. 15 (8), 1367-1375 (2024).
  41. Ma, K., et al. A Widespread Radical-Mediated Glycolysis Pathway. J Am Chem Soc. 146 (38), 26187-26197 (2024).
  42. Yang, L., Lei, S., Xu, W. Rising above: exploring the therapeutic potential of natural product-based compounds in human cancer treatment. Tradit Med Res. 10 (3), 18(2025).
  43. Zhu, C., Cook, S. P. A concise synthesis of (+)-artemisinin. J Am Chem Soc. 134 (33), 13577-13579 (2012).
  44. Schade, A. E., et al. AKT and EZH2 inhibitors kill TNBCs by hijacking mechanisms of involution. Nature. , 1-9 (2024).
  45. Karpinska, K., et al. Selective degradation of MLK3 by a novel CEP1347-VHL-02 PROTAC compound limits the oncogenic potential of TNBC. J Med Chem. 67 (17), 15012-15028 (2024).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

C

Похожие статьи