Методическая статья

Живая визуализация рециркуляции синаптических везикул в нервно-мышечном соединении расчлененных личинок данио-рерио

1.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/67633

⸱

7 февраля 2025 г.

 , 
1Department of Physiology, Osaka Medical and Pharmaceutical University

В этой статье

Краткое содержание

Нервно-мышечное соединение личинки данио-рерио является привлекательной моделью для изучения синаптической физиологии. Он поддается многим экспериментальным методикам, включая электрофизиологию и оптическую визуализацию. В этой статье мы опишем протокол визуализации синаптической передачи с помощью зонда на основе pHluorin под вертикальным эпифлуоресцентным микроскопом.

Аннотация

Нейронная коммуникация опосредована синаптической передачей, которая зависит в первую очередь от высвобождения нейротрансмиттеров, хранящихся в синаптических везикулах (SV), в ответ на потенциал действия (AP). Поскольку SV рециркулируются локально в пресинаптической окончании, координация экзоцитоза SV и эндоцитоза важна для устойчивой синаптической передачи. pH-чувствительный зеленый флуоресцентный белок, называемый pHluorin, является мощным инструментом для мониторинга экзо/эндоцитоза SV, нацеливаясь на просвет SV. Тем не менее, отслеживание рециркуляции SV, управляемой AP, с помощью зондов на основе pHluorin по-прежнему в значительной степени ограничено препаратами культур in vitro , поскольку введение генетически кодируемых зондов и последующая оптическая визуализация в целом технически сложны для животных моделей или препаратов тканей in vivo . Рыбки данио-рерио — это модельная система, обладающая ценными характеристиками, включая простоту генетических манипуляций, оптическую прозрачность и быстрое внешнее развитие. Недавно мы создали трансгенную рыбку данио, которая высоко экспрессирует меченный pHluorin зонд в окончаниях моторных нейронов, и разработали протокол для мониторинга AP-управляемого SV-экзо/эндоцитоза в нервно-мышечном соединении (NMJ), хорошо зарекомендовавшей себя модели синапсов, которая формируется in vivo. В этой статье мы покажем, как приготовить препарат NMJ для личинок данио-рерио, подходящий для визуализации pHluorin. Мы также показываем, что препарат позволяет проводить покадровую визуализацию под обычным вертикальным эпифлуоресцентным микроскопом, обеспечивая экономически эффективную платформу для анализа функции NMJ.

Введение

Синаптическая передача, опосредованная высвобождением нейромедиаторов из синаптических везикул (СВ) в пресинаптической окончании, является фундаментальным процессом, лежащим в основе нервной функции1. В ранних исследованиях синаптическая передача измерялась в основном с помощью электрофизиологических методов, которые обнаруживают постсинаптическую реакцию, вызванную нейротрансмиттерами и их рецепторами. Однако за последние несколько десятилетий было разработано несколько типов методов визуализации, которые непосредственно визуализируют пресинаптическую функцию. Одним из наиболее широко используемых зондов является pH-чувствительный зеленый флуоресцентный белок под названием pHluorin 3,4.

Рециркуляция синаптических везикул (СО) в пресинаптических окончаниях является важнейшим процессом для устойчивой передачи нейротрансмиттеров5. После высвобождения нейротрансмиттеров в результате экзоцитоза SV, просвет которых обычно поддерживается на кислом pH 6,7, мембрана и белки SV немедленно извлекаются из плазматической мембраны посредством эндоцитоза. Вновь образованные SV затем повторно подкисляются, а нейротрансмиттеры перезагружаются. Когда pHluorin нацеливается на SV-просвет путем слияния его с SV-белком, он проявляет минимальную флуоресценцию в состоянии покоя. Однако при экзоцитозе SV он подвергается воздействию нейтрального pH во внеклеточном пространстве, что приводит к яркой флуоресценции. Впоследствии флуоресценция постепенно снижается после повторного закисления SV. Таким образом, флуоресценция pHluorin позволяет контролировать процессы переработки SV.

В новаторских исследованиях синаптобревин/VAMP 2, везикулярный белок SNARE (растворимый рецептор белка прикрепления NSF), ответственный за слияние синаптических везикул в синапсах переднего мозга8 и наиболее распространенный среди белков SV9, был выбран в качестве партнера по слиянию для pHluorin, а полученный белок слияния был обозначен как synaptopHluorin (SpH)3,4. Тем не менее, SpH демонстрирует низкое отношение сигнал/шум (S/N) из-за значительной поверхностной экспрессии зонда. Таким образом, другие белки SV были протестированы в качестве партнеров-носителей 10,11,12. На сегодняшний день доказано, что везикулярные транспортеры демонстрируют самую низкую поверхностную экспрессию 13,14,15. Использование этих зондов было первоначально установлено в культивируемых нейронах млекопитающих для отслеживания АР-управляемой рециркуляции SV 8,9,10,11,12,13 и было распространено на другие препараты, включая препарированные ткани и животных in vivo 16,17,18,19,20.21,22.

Личинки данио-рерио представляют собой модельную систему с ценными характеристиками, включая простоту генетических манипуляций, оптическую прозрачность и быстрое внешнее развитие. Трансгенные рыбки данио-рерио, экспрессирующие pHluorin, слитые с синаптофизином, называемые SypHy, были получены и применены в нескольких экспериментальных установках, например, для мониторинга спонтанного SV-слияния спинномозговых нейронов in vivo21, AP-независимой рециркуляции SV в синапсах ленточного типа in vivo 20,22 или в изолированных клетках 23,24,25. Тем не менее, применение визуализации pHluorin для рециркуляции SV, вызванной AP, в модели рыбок данио все еще ограничено.

Нервно-мышечное соединение (NMJ) служит привлекательной моделью для изучения синаптической физиологии26, и в нескольких исследованиях была успешно выполнена визуализация рециркуляции SV, вызванной AP, с SpH у мышей 18,19. Использование NMJ для переработки SV у рыбок данио было впервые предложено Wen et al.16. Недавно мы создали рыбок данио Tg, которые высоко экспрессируют pHluorin, помеченный везикулярным транспортером GABA (VGAT), в частности, в моторных нейронах27. Этот зонд также содержит HaloTag в тандеме с pHluorin в люминальном хвосте VGAT и, следовательно, называется VpHalo. Несмотря на то, что VGAT эндогенно не экспрессируется в холинергических мотонейронах, мы подтвердили, что VpHalo локализуется во всех пулах SV и должным образом рециркулируется в ответ на AP путем комбинации электрофизиологической записи, зависимого от активности мечения SV лигандами HaloTag и визуализации pHluorin27 в реальном времени. Благодаря высокому уровню экспрессии и минимальной поверхностной фракции VpHalo, препарат NMJ из этой рыбы Tg позволил контролировать рециркуляцию SV, вызванную AP, с хорошим соотношением S/N. Кроме того, разреженное распределение NMJ в прозрачном теле делает конфокальную лазерную сканирующую микроскопию ненужной для этой цели. Несмотря на то, что мониторинг рециркуляции SV, вызванного AP, у неповрежденных рыбок данио рерио является желательным направлением в будущем, первостепенное значение имеет разработка препарата NMJ, пригодного для валидации использования зонда на основе pHluorin в хорошо контролируемых условиях, как это было сделано в культивируемых препаратах 3,4,10,11,12,13,14,15 . В этой статье мы описываем протокол вскрытия для подготовки образца NMJ личинки данио-рерио, который может быть использован для нескольких типов экспериментов, например, для записи токов на торцевой пластине с помощью патч-хомута, маркировки HaloTag переработанных SV и визуализации pHluorin в реальном времени, как обсуждалось выше. Кроме того, мы сосредоточились на подробном протоколе визуализации пХлуорина в реальном времени с использованием этого препарата NMJ и предоставили его на обычном эпифлуоресцентном микроскопе, оснащенном устройством для электрической стимуляции и системой перфузии раствора.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все процедуры на животных проводились в соответствии с рекомендациями по уходу и использованию животных в Осакском медицинском и фармацевтическом университете. Рыбок данио выращивали и содержали в темном цикле от 14 до 10 часов. Эмбрионы и личинки содержались при температуре 28-30 °C в яичной воде, содержащей 0,006% морской соли и 0,01% метиленового синего. Эксперименты проводили через 4-7 дней после оплодотворения (dpf). Рекомендуется кормить рыб два раза в день, начиная с 5 dpf, когда эксперименты проводятся после 6 dpf. Среду необходимо менять перед каждым кормлением.

1. Приготовление растворов

  1. Приготовьте 200 мл внеклеточного раствора (112 мМ NaCl, 2 мМ KCl, 10 мМ HEPES, 10 мМ глюкозы, 2 мМ CaCl2, 1 мМ MgCl2, pH 7,3-7,4). Смешайте 6,4 мл 3,5 М NaCl, 0,4 мл 1 М KCl, 1 мл 1 М HEPES (pH 7,5), 0,4 мл 1 М CaCl2, 0,2 мл 1 М MgCl2 и 360 мг глюкозы и добавьте 200 мл сверхчистой воды. Если pH находится за пределами диапазона 7,3-7,4, отрегулируйте его с помощью 1 М NaOH. Для каждого эксперимента используйте свежеприготовленный внеклеточный раствор.
  2. Приготовьте 100 мл внеклеточного раствора, содержащего 3 мкМ D-тубокурарина (D-TBC). Добавьте 20 мкл 15 мМ стокового раствора D-TBC в 100 мл внеклеточного раствора.
    Примечание: Исходный раствор D-TBC готовится в воде и хранится при температуре -20 °C.
    ВНИМАНИЕ: Надевайте перчатки и делайте приготовления в капюшоне при работе с порошком D-TBC. При работе с раствором D-TBC также рекомендуется надевать перчатки.
  3. Приготовьте 25 мл внеклеточного раствора, содержащего 0,02% трикаина (MS-222). Добавьте 0,5 мл 1% стокового раствора трикаина к 25 мл внеклеточного раствора.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Стоковый раствор трикаина готовится в воде и хранится при температуре 4 °C. Трикаин используется только для вскрытия, а не во время визуализации.

2. Препарирование биполярного электрода из тетастеклянного капилляра

  1. Потяните капилляры тета-стекла с помощью съемника микропипетки так, чтобы диаметр наконечника был в диапазоне 3-10 мкм (рис. 1A).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мы рекомендуем протокол с двумя или более этапами для вытягивания капилляра.
  2. Подсоедините пипетку из тета-стекла (внутренний диаметр 1,17 мм и толщина перегородки 0,165 мм) к изолятору стимулов. Наполните пипетку внеклеточным раствором. Вставьте тонкую платиновую проволоку (диаметром 0,1 мм) в каждое отверстие капилляра тетастекла и подсоедините задний конец провода к изолятору стимулов (рис. 1B). Будьте осторожны, чтобы не закоротить два платиновых провода.

3. Подготовка образцов

ПРИМЕЧАНИЕ: Данный протокол был оптимизирован для использования с личинками27 данио-рерио Tg(hb9:tTAad, TRE:TagRFP-P2A-VpHalo), у которых следующие два белка, связанные пептидом расщепления P2A, бицистронно экспрессировались специфически в моторных нейронах: репортерный красный флуоресцентный белок TagRFP и сенсорный белок VpHalo, представляющий собой слияние белка pHluorin и HaloTag с люминальной частью VGAT (рисунок 2A). Промотор hb9 управляет экспрессией tTAad (тетрациклин-контролируемый трансактиватор-продвинутый), который, в свою очередь, индуцирует экспрессию генов под составным промотором тетрациклинового элемента ответа (TRE). Индуцируемая Tet система экспрессии повышает уровень экспрессии белка. pHluorin позволяет в режиме реального времени отслеживать рециркуляцию SV, зависящую от активности, в то время как HaloTag визуализирует SV, переработанные в течение определенного периода, путем ковалентной маркировки слитого белка (рис. 2A). Хотя оба метода имеют уникальные преимущества, в этой статье мы сосредоточимся на визуализации pHluorin.

  1. В стеклянную чашку Петри налить 25 мл внеклеточного раствора, содержащего 0,02% трикана.
  2. Для вскрытия перенесите личинку в чашку Петри. Снимите кожу личинки с помощью двух тонких щипцов. Используйте первые щипцы, чтобы удержать личинку на месте, и сожмите кожу на тыльной стороне плавательного пузыря другими щипцами (рисунок 3A).
  3. Удалите плавательный пузырь, внутренние органы и голову с помощью скальпелей. Кожа с обеих сторон тела рыбы часто может быть удалена одновременно, см. Видео 1.

4. Помещение образца в камеру визуализации и введение стимулирующего электрода

ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку рН просвета в покое у SV ниже pH 6,0, флуоресценция pHluorin в NMJ у живых рыб едва заметна (Рисунок 2B). Однако, когда просвет SV был подщелачен, наблюдалась ограниченная локализация VpHalo до NMJ (рис. 2C). Примечательно, что конфокальное изображение z-стека NMJ показало, что они не перекрывают друг друга в плоскости xy, за исключением краев сегментов тела (рис. 2C). Основываясь на этом наблюдении, мы предположили, что эпифлуоресцентный микроскоп применим для визуализации VpHalo в реальном времени у личинок рыбок данио, что было подтверждено, как подробно описано в следующем протоколе.

  1. Перенесите образец в камеру для визуализации (рис. 3B) с помощью стеклянной пастеровской пипетки с отполированным огнем наконечником. Механически зафиксируйте образец капроновой нитью, приклеенной к С-образной платиновой проволоке так, чтобы она была ориентирована под углом, примерно параллельным стимулирующему электроду. (Рисунок 3В).
    ПРИМЕЧАНИЕ: С-образная платиновая проволока с нейлоновой нитью была изготовлена в лаборатории. Примерно 1 см платиновой проволоки диаметром 0,5 мм формировали в С-образную форму и постукивали молотком для ее расплющивания. Капроновую нить можно получить из предметов быта. Мы приклеили капроновую нить, которую мы получили, разобрав кухонную сушилку, доступную в продуктовом магазине. Подобное устройство фиксации обычно используется в эксперименте28 со срезом мозга.
  2. Непрерывно перфузируйте образец внеклеточным раствором, содержащим 3 мкМ D-TBC со скоростью приблизительно 1,0 мл/мин, используя систему перфузии с гравитационным потоком.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется контролировать температуру в камере с помощью встроенного нагревателя раствора.
  3. Введите электрод стимуляции в спинной мозг. Держите электрод, приготовленный из пипетки из тета-стекла в шаге 2, на держателе пипетки, оснащенном моторизованным микроманипулятором. Вставьте электрод в образец так, чтобы кончик находился рядом со спинальными моторными нейронами, которые расположены на вентральной стороне спинного мозга и могут быть идентифицированы как TagRFP-положительные нейроны в этом образце (рис. 3D). Переместите электрод под косым углом от соседнего сегмента в целевое положение.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Граница между сегментами тела плотная и труднопроницаемая, поэтому необходимо медленно нажимать на электрод. Положение наконечника электрода очень важно. Если он удален от спинного мозга, он стимулирует соседние мышцы напрямую, что приводит к большому дрейфу изображения при последующей покадровой съемке.

5. Получение изображения

  1. Выберите область изображения. На основе изображения флуоресценции TagRFP в реальном времени выберите область визуализации, которая включает более нескольких бутонов и исключает те, которые находятся на границе сегмента тела (рис. 2C и рис. 4A). Выберите область в пределах одного и того же сегмента тела стимулирующего электрода, поскольку иннервация моторных нейронов ограничена в пределах одного сегмента тела29,30. Переключите блок флуоресцентного фильтра на флуоресценцию GFP/pHluorin.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этой экспериментальной установке pHluorin был визуализирован с фильтрами возбуждения 470/40 нм и эмиссионными фильтрами 510/20 нм. Изображение TagRFP проводилось с фильтрами возбуждения 555/20 нм и эмиссионными фильтрами 595/44 нм. Программное обеспечение Micro-Manager используется для одновременного управления получением изображения с помощью научной камеры cMOS и TTL-затвора светодиодного источника света. Для синхронизации получения изображений и электрической стимуляции Arduino используется в качестве цифрового устройства ввода-вывода. Еще один вариант, который не требует скрипта, — использовать Digidata и ее программное обеспечение от Molecular Devices.
  2. Определите настройку программного обеспечения для получения изображений и цифрового устройства ввода-вывода, чтобы синхронизировать получение изображений и электрическую стимуляцию. Оптимизируйте экспозицию и интенсивность источника света для получения достаточно яркого изображения в режиме интервальной съемки 1 Гц без насыщения и введите время экспозиции в поле Экспозиция [мс] главного окна Micro-Manager.
  3. Определите частоту стимуляции, количество потенциалов действия (AP) и время между началом получения изображения и доставкой стимуляции, закодировав их в скрипте Arduino. В зависимости от параметров определите количество полученных изображений, соответствующее общей длине получения изображения, и введите его в поле «Количество» окна «Многомерное получение» микроменеджера. Установите значение 1 с в поле Интервал, чтобы получить интервальную съемку с частотой 1 Гц. Для электрической стимуляции подайте импульсы постоянного напряжения продолжительностью 1 мс (70 мВ) через изолятор стимулов.
  4. Выполнение получения изображений. Выполните команду дигитайзера и выполните получение изображения. Убедитесь в отсутствии недопустимого дрейфа изображения и в том, что можно наблюдать реакцию pHluorin. В противном случае положение электродов будет неправильным. Вернитесь к шагу 4.2.
    Повреждение тканей, которое потенциально может повлиять на реакцию pHluorin, может быть легко идентифицировано с помощью DIC-изображения мышечных волокон. Если при отсутствии такого повреждения не наблюдается реакции на пХлуорин, расположение электродов может быть неправильным. Это можно определить как большой дрейф изображения, потому что неправильное расположение электродов вызывает сокращение мышц, как описано в шаге 4.2. Другая проблема, которая иногда приводит к невозможности вызвать реакцию pHluorin, — это попадание воздуха в капилляр тета-стекла, что приводит к электрической изоляции электрода. Сокращение мышц из-за неправильного расположения электродов приводит к смещению изображения по оси Z, которое не может быть скорректировано при последующем анализе изображений (см. шаг 6.5). Поэтому рекомендуется выявлять данные с большими дрейфами изображения во время получения изображений и исключать их.
  5. В зависимости от цели эксперимента изменяйте интенсивность стимуляции (т.е. частоту и количество импульсов) и/или температуру. Сохраните покадровые изображения в виде стопки временных рядов изображений в формате TIFF. Смотрите видео 2.

6. Анализ изображений

ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте Fiji для выполнения следующей обработки и анализа изображений. Используйте Microsoft Excel или аналогичное программное обеспечение для работы с электронными таблицами для расчета результатов измерений. Используйте Igor Pro для выполнения подгонки кривой по полученному результату.

  1. Создайте разностное изображение, которое выделяет активные синапсы, как описано ниже.
    1. Откройте стек изображений временных рядов на Фиджи, выбрав «Файл» > «Открыть». Если отображаемые изображения тусклые, выберите Изображение >Настроить >Яркость/Контрастность >Авто. Не нажимайте кнопку «Применить», так как это приведет к изменению интенсивности сигнала, что сделает дальнейший анализ невозможным. Выберите «Анализ» > «Задать масштаб » и введите коэффициент калибровки, определенный в условиях изображения.
    2. Создайте стопку из пяти изображений, сделанных в период до стимулирования, выбрав «Изображение > Дублировать » и введя соответствующее число, обозначающее диапазон последовательности изображений (например, 11–15 для эксперимента с периодом до стимуляции 15 с).
    3. Выберите «Изображение > стеки > проекте Z» и выберите «Средняя интенсивность» в раскрывающемся меню «Тип проекции». Нажмите OK, чтобы создать репрезентативное изображение периода, предшествующего стимулированию (рисунок 4B). Процесс усреднения важен для уменьшения влияния колебаний сигнала.
    4. Создайте усредненное изображение периода после стимулирования, используя аналогичную обработку (рисунок 4B). Продублируйте стопку из пяти изображений сразу после окончания стимуляции (например, 26-30-е изображение для эксперимента с 15 с до стимуляции и 10 с для периода стимуляции). Выберите «Калькулятор обработки > изображений» и установите усредненное изображение до стимула и усредненное изображение после стимула как Изображение 1 и Изображение 2 в раскрывающихся меню соответственно.
    5. Выберите «Вычесть » в раскрывающемся меню «Операция» и нажмите OK , чтобы создать разностное изображение, выделяющее активные синапсы (рис. 4B).
  2. Определите области интереса (ROI) для анализа.
    1. Выберите «Правка» > «Выделение» > Укажите и создайте круговую ROI диаметром 7 мкм на изображении разницы, созданном на шаге 6.1. Поместите ROI на выделенный активный синапс и нажмите T, чтобы добавить ROI в Менеджере ROI. В репрезентативном результате, показанном на рисунке 4C-D, вокруг бутонов было расположено 6 ROI.
    2. Разместите еще 5 ROI того же размера в регионах, где не наблюдается увеличения сигнала. Используйте их среднюю флуоресценцию в качестве фонового сигнала на следующем шаге. Сохраните ROI, выбрав Еще >Сохранить » в меню Диспетчер окупаемости инвестиций.
  3. Измерьте интенсивность сигнала и рассчитайте существенное изменение флуоресценции.
    1. Выберите исходный стек временных рядов и перенесите ROI, сохраненные на шаге 6.2, в стек. Выберите Анализ > Задать измерения и установите только флажок Среднее значение серого. Измерьте среднюю интенсивность флуоресценции в ROI за все временные точки, выбрав «Больше > Мультимер» в меню «Менеджер ROI».
    2. Скопируйте все значения в окне «Результаты» и вставьте их в программу для работы с электронными таблицами. Рассчитайте средний фоновый сигнал из 5 фоновых ROI и вычтите его из каждого синаптического ROI, который обеспечивает существенное изменение флуоресценции в каждом бутоне (рис. 4D). Усредняем все данные с одного представления (в данном случае 6 бутонов), считая n = 1 эксперимент. На рисунке 4E каждая трасса, полученная путем усреднения, представлена как F/F0 путем деления значения во всех временных точках на среднее значение в течение начального базового периода.
  4. Оцените постоянную времени затухания флуоресценции (тау) с помощью аппроксимации кривой.
    1. Откройте новую таблицу данных в Igor Pro, выбрав «Окно» > «Новая таблица». Скопируйте данные временной точки и F/F0 из таблицы и вставьте их в таблицу в другую строку. Выберите «Окно» > «Новый график», выберите данные F/F0 как Y Wave и данные временных точек как X Wave, и нажмите Do It , чтобы создать график.
    2. Выберите «Окно» > «Показать информацию» и определите диапазон данных для анализа, поместив один курсор на пик сигнала, а другой — на конец трассы. Выберите Анализ > Аппроксимация кривой» и выберите exp_XOffset в раскрывающемся меню Функция и соответствующие волны X и Y в раскрывающемся меню Волна.
    3. Щелкните Параметры данных и нажмите кнопку Курсоры, чтобы задать диапазон подгонки кривой. Нажмите «Коэффициенты», введите 1 для Y0 и нажмите «Выполнить». Аппроксимация кривой с помощью этой процедуры дает значение тау, представляющее скорость распада флуоресценции, которая отражает скорость эндоцитоза SV и повторного закисления.
  5. Выполните ручную коррекцию дрейфа (необязательно), как описано ниже.
    1. Если в период получения изображения происходит смещение изображения и выбранное пятно выходит за пределы ROI диаметром 7 мкм, запустите плагин Manual Drift Correction. Откройте стек изображений временных рядов на Фиджи, выбрав Файл > Открыть. Выберите инструмент «Точка », щелкнув по панели инструментов «Точка».
    2. Найдите самый яркий бутон в качестве ориентира и поставьте точку в его центре. Нажмите T, чтобы добавить точку в менеджер ROI. Повторите этот процесс для всей последовательности изображений. Отобразите первое изображение и выберите Плагины > Регистрация > Ручная коррекция дрейфа. Сохраните исправленный стек серий изображений в виде нового файла и используйте его для анализа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя дрейф по оси X-Y можно исправить, чрезмерный дрейф по оси Z не может быть исправлен с помощью этого метода.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Если препарированный образец подготовлен без серьезного повреждения тканей и стимулирующий электрод правильно введен в спинной мозг, то с помощью высокочастотной электрической стимуляции можно вызвать устойчивый ответ pHluorin (рис. 4D, E). Фоновая флуоресценция до стимула, вероятно, была обусловлена зондом, присутствующим на поверхности пресинапса. Увеличение флуоресценции во время стимуляции отражает экзоцитотическое высвобождение зонда на поверхность. Последующий распад о...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Личинки данио-рерио NMJ являются новой модельной системой для изучения синаптической физиологии и патологии26,31. Трансгенная рыбка данио-рерио, экспрессирующая SpH нейрон-специфичным образом, уже была получена и использована для анализа мутанта, демонстрирующего локомоторный дефект17. Wen et al.17 продемонстрировали примерно 2-кратное увеличение флуоресценции pHluorin при стимуляци...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Конфликт интересов не декларируется.

Благодарности

Эта работа была поддержана Японским обществом содействия науке KAKENHI Grant 18K06882 для F. O.; и гранты Японского общества содействия науке KAKENHI 21K06429 и 24K10020 для Y.E.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
40-кратный водоиммерсионный объективOlympusLUMPLFLN40XW
4-канальная гравитационная перфузионная системаALAVCPlus-4G
5-кратный объективOlympusNPLN5X
Камера для визуализацииPhysiotechCustum изготовленачерная акриловая пластина (диаметр 10,7 см, толщина 3 мм) с углублением (диаметр 1 см внизу, диаметр 1,5 см вверху) примерно 0,5 мл перфузата.
Цифровое устройство ввода-выводаArduinoUno Rev3
D-тубокурарина дихлорид пентагидратSigma93750
ExcelMicrosoftMicrosoft Office Professional Plus 2016
Fiji / imageJhttps://imagej.net/imageJ 1.54f
Тонкие щипцыAsOne7-562-05 (Dumont #5)
Стекло Пастер пипеткаIWAKIIK-PAS-5PНаконечник должен быть обрезан и отполирован огнем до тех пор, пока окончательный диаметр не составит 1,5– 2 мм. 
Стеклянная чашка ПетриAsOne1-4564-06
Igor ProWaveMetricsVer. 6.37
Встраиваемый растворный обогревательWarner InstrumentsSF-28
Светодиодная система подсветкиX-cyteXYLIS
Methylen blueWako133-06962
Micro-Managerhttps://micro-manager.org/Ver. 2.0.0
Мини магнитный зажим для перфузионной трубкиWarner Instruments64-1553
Моторизованный микроманипуляторScientificaPatchStar
Моторизованная подвижная пластина для образцовScientificaMMSP
Держатель для пипетокNarishigeH-13
Съемник пипетокNarishigePC-100
Платиновая проволока (φ 0,1 мм)NilacoPT-351165
Платиновая проволока (φ 0,5 мм)NiacoPT-351381
СкальпельAsOne8-3086-02 (Feather #11)
Научная фотоаппарат cMOSThorlabsCC215MU
Морской сольюNAPQOInstant Ocean
Stereo MicroscopeOlympusSZX7
Стимульный изоляторAMPIISO-FLEX
Всасывающая трубкаWarner InstrumentsST-3, 64-1406
Регулятор температурыWarner InstrumentsTC-324C
Тета-стекло капиллярныйинструмент СаттераBT-150-10
Трикейн (MS-222)TCIT0941
Вертикальный микроскопOlympusBX51WI

Ссылки

  1. Sudhof, T. C. The synaptic vesicle cycle. Ann Rev Neurosci. 27, 509-547 (2004).
  2. Kavalali, E. T., Jorgensen, E. M. Visualizing presynaptic function. Nat Neurosci. 17 (1), 10-16 (2014).
  3. Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with ph-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
  4. Sankaranarayanan, S., De Angelis, D., Rothman, J. E., Ryan, T. A. The use of phluorins for optical measurements of presynaptic activity. Biophys. J. 79 (4), 2199-2208 (2000).
  5. Chanaday, N. L., Cousin, M. A., Milosevic, I., Watanabe, S., Morgan, J. R. The synaptic vesicle cycle revisited: New insights into the modes and mechanisms. J Neurosci. 39 (42), 8209-8216 (2019).
  6. Egashira, Y., Takase, M., Takamori, S. Monitoring of vacuolar-type h+ atpase-mediated proton influx into synaptic vesicles. J Neurosci. 35 (8), 3701-3710 (2015).
  7. Egashira, Y., et al. Unique ph dynamics in gabaergic synaptic vesicles illuminates the mechanism and kinetics of gaba loading. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (38), 10702-10707 (2016).
  8. Schoch, S., et al. Snare function analyzed in synaptobrevin/vamp knockout mice. Science. 294 (5544), 1117-1122 (2001).
  9. Takamori, S., et al. Molecular anatomy of a trafficking organelle. Cell. 127 (4), 831-846 (2006).
  10. Granseth, B., Odermatt, B., Royle, S. J., Lagnado, L. Clathrin-mediated endocytosis is the dominant mechanism of vesicle retrieval at hippocampal synapses. Neuron. 51 (6), 773-786 (2006).
  11. Fernandez-Alfonso, T., Kwan, R., Ryan, T. A. Synaptic vesicles interchange their membrane proteins with a large surface reservoir during recycling. Neuron. 51 (2), 179-186 (2006).
  12. Kwon, S. E., Chapman, E. R. Synaptophysin regulates the kinetics of synaptic vesicle endocytosis in central neurons. Neuron. 70 (5), 847-854 (2011).
  13. Voglmaier, S. M., et al. Distinct endocytic pathways control the rate and extent of synaptic vesicle protein recycling. Neuron. 51 (1), 71-84 (2006).
  14. Balaji, J., Ryan, T. A. Single-vesicle imaging reveals that synaptic vesicle exocytosis and endocytosis are coupled by a single stochastic mode. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (51), 20576-20581 (2007).
  15. Santos, M. S., Park, C. K., Foss, S. M., Li, H., Voglmaier, S. M. Sorting of the vesicular gaba transporter to functional vesicle pools by an atypical dileucine-like motif. J Neurosci. 33 (26), 10634-10646 (2013).
  16. Wen, H., et al. Synchronous and asynchronous modes of synaptic transmission utilize different calcium sources. Elife. 2, e01206(2013).
  17. Wen, H., Hubbard, J. M., Wang, W. C., Brehm, P. Fatigue in rapsyn-deficient zebrafish reflects defective transmitter release. J Neurosci. 36 (42), 10870-10882 (2016).
  18. Wyatt, R. M., Balice-Gordon, R. J. Heterogeneity in synaptic vesicle release at neuromuscular synapses of mice expressing synaptophluorin. J Neurosci. 28 (1), 325-335 (2008).
  19. Tabares, L., et al. Monitoring synaptic function at the neuromuscular junction of a mouse expressing synaptophluorin. J Neurosci. 27 (20), 5422-5430 (2007).
  20. Odermatt, B., Nikolaev, A., Lagnado, L. Encoding of luminance and contrast by linear and nonlinear synapses in the retina. Neuron. 73 (4), 758-773 (2012).
  21. Almeida, R. G., et al. Myelination induces axonal hotspots of synaptic vesicle fusion that promote sheath growth. Curr Biol. 31 (17), 3743-3754.e5 (2021).
  22. Zhang, Q., et al. Synaptically silent sensory hair cells in zebrafish are recruited after damage. Nat Comm. 9 (1), 1388(2018).
  23. Vaithianathan, T., Henry, D., Akmentin, W., Matthews, G. Nanoscale dynamics of synaptic vesicle trafficking and fusion at the presynaptic active zone. eLife. 5, e13245(2016).
  24. Vaithianathan, T., Wollmuth, L. P., Henry, D., Zenisek, D., Matthews, G. Tracking newly released synaptic vesicle proteins at ribbon active zones. iScience. 17, 10-23 (2019).
  25. Shrestha, A. P., Vaithianathan, T. Tracking the dynamics of single fused synaptic vesicle proteins from a single ribbon active zone in zebrafish retinal bipolar cells. STAR Protoc. 3 (1), 101107(2022).
  26. Egashira, Y., Zempo, B., Sakata, S., Ono, F. Recent advances in neuromuscular junction research prompted by the zebrafish model. Curr Opinion Physiol. 4, 70-75 (2018).
  27. Egashira, Y., Kumade, A., Ojida, A., Ono, F. Spontaneously recycling synaptic vesicles constitute readily releasable vesicles in intact neuromuscular synapses. J Neurosci. 42 (17), 3523-3536 (2022).
  28. Weng, W., Li, D., Peng, C., Behnisch, T. Recording synaptic plasticity in acute hippocampal slices maintained in a small-volume recycling-, perfusion-, and submersion-type chamber system. J Vis Exp. (131), e55936(2018).
  29. Myers, P. Z., Eisen, J. S., Westerfield, M. Development and axonal outgrowth of identified motoneurons in the zebrafish. J Neurosci. 6 (8), 2278-2289 (1986).
  30. Westerfield, M., Mcmurray, J. V., Eisen, J. S. Identified motoneurons and their innervation of axial muscles in the zebrafish. J Neurosci. 6 (8), 2267-2277 (1986).
  31. Brehm, P., Wen, H. Zebrafish neuromuscular junction: The power of n. Neurosci Lett. 713, 134503(2019).
  32. Ben Fredj, N., et al. Synaptic activity and activity-dependent competition regulates axon arbor maturation, growth arrest, and territory in the retinotectal projection. J Neurosci. 30 (32), 10939-10951 (2010).
  33. Mandal, A., et al. Retrograde mitochondrial transport is essential for organelle distribution and health in zebrafish neurons. J Neurosci. 41 (7), 1371-1392 (2021).
  34. Wong, H. C., Drerup, C. M. Using fluorescent indicators for in vivo quantification of spontaneous or evoked motor neuron presynaptic activity in transgenic zebrafish. STAR Protoc. 3 (4), 101766(2022).
  35. Truckenbrodt, S., Rizzoli, S. O. Spontaneous vesicle recycling in the synaptic bouton. Front Cell Neurosci. 8, 409(2014).
  36. Casey, J. R., Grinstein, S., Orlowski, J. Sensors and regulators of intracellular ph. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (1), 50-61 (2010).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

pHluorin

Похожие статьи