Method Article

Мультиплексное детектирование экспрессии генов в интактном мозге дрозофилы с использованием итеративной флуоресценции in situ с помощью экспансионной флуоресценции in situ

DOI:

10.3791/67656

⸱

May 2nd, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Project Technical Resources, Janelia Research Campus, Howard Hughes Medical Institute, 2Project Pipeline Support', Janelia Research Campus, Howard Hughes Medical Institute

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Expansion-Assisted Iterescence In Situ Hybridization (EASI-FISH) - это надежный метод, сочетающий экспансионную микроскопию с флуоресцентной гибридизацией in situ (FISH) для обнаружения экспрессии нескольких генов в толстых тканях. В этом протоколе описываются последние достижения в методе и его адаптация для мечения интактной центральной нервной системы дрозофилы.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Понимание экспрессии генов важно для расшифровки клеточных функций. Тем не менее, методы анализа экспрессии многочисленных генов in situ в данной ткани остаются ограниченными. Описанный здесь протокол EASI-FISH был адаптирован для обнаружения экспрессии десятков генов в интактной центральной нервной системе (ЦНС) взрослой дрозофилы с использованием коммерчески доступных реагентов. Этот протокол включает в себя новую формулу геля, которая повышает прочность геля, позволяя проводить несколько раундов гибридизации и встраивать несколько мозгов в один гель. Это усовершенствование увеличивает производительность, способствует оптимальному сравнению условий эксперимента и снижает затраты на реагенты. Кроме того, используя систему GAL4-UAS для совместного детектирования зеленого флуоресцентного белка (GFP), экспрессия генов может быть визуализирована в конкретных типах нейрональных или глиальных клеток. Примечательно, что высокое разрешение, достигнутое с помощью экспансионной микроскопии, в сочетании с чувствительностью метода позволяет обнаруживать одиночные РНК-транскрипты. Этот подход эффективно сочетает в себе высокое качество изображения с высокой пропускной способностью, что делает его мощным инструментом для изучения экспрессии генов во всем интактном мозге мухи.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

FISH был впервые использован у дрозофил более 40 лет назад для картирования генов на политеновых хромосомах1,2. На сегодняшний день одномолекулярный FISH является золотым стандартом для пространственной локализации и количественного определения транскриптов мРНК в интактной ткани3. Однако, из-за проблем с целостностью образца и потерей РНК, методы FISH целого массива одиночных молекул у дрозофил были ограничены только несколькими генами, которые могут быть проанализированы в одном и том же образце4,5,6,7. В то время как недавнее развитие штрих-кодирования (например8,9,10) увеличивает количество транскриптов, которые могут быть обнаружены до нескольких сотен даже в толстых тканях11,12, создание таких протоколов требует значительных вложений ресурсов, что может стать препятствием для внедрения. Действительно, многие изобретательные пространственные транскриптомные методы никогда не выходят за пределы своих исходных учреждений13. Таким образом, простой и сравнительно недорогой метод обнаружения экспрессии десятков генов в одном и том же интактном мозге способствовал бы достижению различных исследовательских целей: валидации данных секвенирования РНК и клеточного атласа, картированию типов молекулярных клеток в ЦНС, количественной оценке различий в экспрессии генов, полам или видоспецифичным различиям, или измерению изменений в экспрессии генов, вызванных большим разнообразием генетических или экологических возмущений, доступных у дрозофил.

Экспансионная микроскопия - это метод, который позволяет исследователям наблюдать ткани с более высоким разрешением, расширяя их в набухающем гидрогеле14. EASI-FISH сочетает в себе экспансионную микроскопию и РНК FISH15, который использует гибридизационную цепную реакцию (HCR), неферментативный метод для определения связывания олигозонда16. EASI-FISH был впервые разработан как альтернативный подход к тонкой ткани FISH для картирования паттернов экспрессии десятков генов в толстых (300 мкм) срезах ткани латерального гипоталамуса мыши17. Этот метод идеально подходит для применения к мозгу взрослых мух, учитывая, что толщина этой ткани составляет менее 300 мкм, и недавно был описан прототип протокола EASI-FISH для мух18. Здесь препарированный и неподвижный мозг дрозофилы погружен в набухающий гидрогель, где мРНК и белки ковалентно закреплены на полимере геля с алкилирующими агентами Мелфалан-X и Акрилоил-Х (Ac-X) соответственно. После расщепления белка, которое обеспечивает изотропное расширение мозга, ген-специфичные ДНК-олигозонды гибридизуются с мРНК в ткани для обнаружения интересующих их транскриптов. Флуоресцентно помеченные ДНК-шпильки затем добавляются на втором этапе гибридизации. Несколько молекул шпильки полимеризуются в реакции HCR с образованием метастабильных полимеров ДНК. Это приводит к усилению сигнала для отдельных транскриптов, которые могут быть обнаружены как яркие пятна с помощью светового листа или конфокальной микроскопии.

Ковалентное закрепление мРНК и белка в гелевой матрице и протеолитическое расщепление белков после образования геля создает среду, в которой транскрипты мРНК относительно стабильны и потенциально более доступны для связывания зондов. Стабильность мРНК и геля позволяет проводить несколько раундов повторного зондирования и визуализации, с удалением зондов ДНК и продукта HCR путем инкубации с ферментом DNase1 между раундами15,17. Кроме того, расширение образца снижает автофлуоресценцию и рассеяние света за счет молекулярного удаления скученности и эффективно увеличивает разрешение изображения14. Таким образом, отдельные транскрипты мРНК могут быть легче разрешены.

GFP поддерживает процедуру в достаточной степени, чтобы оставаться обнаруживаемым флуоресценцией или связыванием антител после расширения. Таким образом, этот репортер можно использовать для выделения и сегментации интересующих типов ячеек. В сочетании с множеством доступных нейроноспецифичных драйверных линий расщепленного GAL4 (например, 19,20), это открывает возможность для дальнейшего понимания молекулярной идентичности типа нейронов или идентификации молекулярных подтипов, которые не могут быть легко различимы по их анатомии.

Здесь описана обновленная версия прототипа протокола EASI-FISH EASI-FISH18, которая отличается отличным удержанием мРНК, устранением технических трудностей и большей прочностью геля. Модификации включают увеличение концентрации PFA, снижение температуры фиксации и облегчение подготовки образцов путем установки мозга перед инкубацией с Melphalan-X и Ac-X. Этот протокол также включает в себя новый рецепт геля для повышения прочности геля, что эффективно снижает повреждение геля при выполнении многих раундов FISH и визуализации. Эти изменения делают протокол более простым в выполнении, сокращая время обработки и использование реагентов, а также повышая уверенность в стабильных результатах. Важно отметить, что возможности мультиплексирования увеличены настолько, что десятки генов могут быть исследованы в одном и том же мозге в течение нескольких месяцев. Это иллюстрируется паттернами экспрессии нескольких нейронных генов в мозге взрослой дрозофилы в диапазоне уровней экспрессии.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол был выполнен на взрослых самках (5-6 дней) Drosophila melanogaster, но подходит любой пол или вид дрозофилы. Рецепты гелевых якорей см. в дополнительной таблице 1; для рецептуры геля, Дополнительная таблица 2; и для других реагентов EASI-FISH, Дополнительная таблица 3. Повседневное руководство по материалам и реагентам см. в дополнительной таблице 4. Для держателя геля для светового листа для микроскопа см. Дополнительный файл 1. На рисунке 1A-C показано схематическое изображение встраивания мозга в гели перед расширением и гибридизацией зонда (шаги с 2.1 по 3.8). Рисунок 1D - это фотография встроенного мозга, Рисунок 1E показывает держатель геля для микроскопии светового листа, а Рисунок 1F изображает временную шкалу типичного эксперимента. Коммерческие данные о реагентах и используемом оборудовании приведены в Таблице материалов.

1. Вскрытие и фиксация мозга мухи

  1. Препарирование мозга мухи или ЦНС в холодной среде S2 (подробнее о вскрытии см. в ссылке21)
  2. Чтобы восстановить мозг, добавьте до 20 мозгов или 10 ЦНС в 2 мл холодного 4% PFA/PBS и инкубируйте в течение ночи на нутаторе при температуре 4°C.
    ВНИМАНИЕ: ПФА вредна при проглатывании или вдыхании, раздражает кожу и глаза, а также может быть канцерогенной.
  3. Промойте образец (1x) 2 мл холодного PBT (0,5%, см. дополнительную таблицу 4), затем промойте образец 2 мл холодного PBT (4x) в течение 15 минут на нутаторе при 4 °C.
  4. Промойте образец (1 шт.) 2 мл холодного 70% EtOH. Храните мозг в 2 мл 70% EtOH при температуре 4 °C до 6 месяцев.

2. Наращивание мозга и добавление РНК и белковых линкеров (День 1)

ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда надевайте перчатки и постоянно протирайте оборудование и рабочее пространство с помощью RNase Away. Перчатки необходимы (1) для защиты РНКаз от образцов и (2) для защиты от нескольких реагентов, представляющих опасность для здоровья.

  1. Подготовьте гелевые камеры, протерев незаряженное предметное стекло реагентом для обеззараживания РНКазы. Снимите с силиконовой прокладки непрозрачную пленку, защищающую клей, приклейте прокладку (с 4 камерами) к предметному стеклу и покройте каждую поверхность камеры полилизином толщиной 1 мкл с помощью наконечника для дозатора P20. Высушите на воздухе и повторите процесс.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Шаг 2.1 можно сделать накануне.
  2. Перенесите мозги в ПЦР-пробирку объемом 0,2 мл (до 4 мозгов на трубку) и регидратируйте в течение (2x) 5 мин в 150 мкл PBT (0,1%) и (2x) в течение 5 мин PBS.
  3. Чтобы установить мозги, добавьте 40 μL PBS на камеру, затем аккуратно вдавите мозги в ряд в центр камеры с помощью тонкого пинцета, оставляя некоторое пространство между мозгами (см. Рисунок 1D). Возможен монтаж до 6 мозгов или 2 ЦНС на камеру.
  4. Удалите PBS и немедленно добавьте 50 мкл 20 мМ буфера MOPS. Инкубировать в течение 30 минут при комнатной температуре (RT).
  5. Пока мозг уравновешивается в буфере MOPS, разморозьте исходные растворы Melphalan-X и Ac-X и приготовьте 75 μL раствора Melphalan-X/Ac-X в каждой камере (разбавьте запас Melphalan-X в соотношении 1:1 с буфером MOPS и добавьте Ac-X в соотношении 1:100). Сделайте вихрь и кратковременно вращайте, чтобы собрать раствор; Засекайте время приготовления таким образом, чтобы раствор был готов к концу 30-минутного времени инкубации, не ранее.
    ВНИМАНИЕ: Мелфалан-X вреден при проглатывании или вдыхании, раздражает кожу и глаза, а также может быть канцерогеном.
  6. Удалите весь буфер MOPS и добавьте 50 μL раствора Melphalan-X/Ac-X.
  7. Накройте камеру, поместив сверху защитный колпачок, но не используйте клей для герметизации. Поместите камеру во увлажненную коробку и инкубируйте в защищенном от света месте в течение ночи при RT.

3. Гелеобразование и пищеварение протеиназы К (День 2)

  1. Осторожно снимите покровное стекло и Melphalan-X/Ac-X и промойте установленные мозги (2x) в течение 2 минут 100 μL PBT (0,1%) и (1x) в течение 2 минут 100 μL PBS.
  2. Разморозьте раствор TREx-1000, 4HT, TEMED и APS и держите на льду.
    ПРИМЕЧАНИЕ: TREx-1000 может выпадать в осадок при -20 °C; вихревой хорошо растворяется после оттаивания.
    ВНИМАНИЕ: Эти реагенты вредны или токсичны при проглатывании или вдыхании, а также являются раздражителями кожи и глаз.
  3. Приготовьте гелевый раствор, смешав TREx-1000 с 4HT, TEMED и APS в соотношении 94:2:2:2. Вихрь и держите на льду. Для каждой камеры приготовьте по 150 мкл гелеобразного раствора.
  4. Извлеките PBS из камеры с помощью наконечника для дозатора и осторожно удалите остатки PBS с помощью безворсовой салфетки. Для каждой камеры сразу же добавьте 40 мкл гелеобразного раствора сверху на мозги. Выдерживать при температуре 4 °C в течение 10 минут.
  5. Удалите раствор геля и добавьте 40 μл свежего раствора геля, выдерживая при 4 °C еще 10 мин.<бр/> ПРИМЕЧАНИЕ: Соберите раствор отходов геля в микроцентрифужную пробирку и полимеризуйте перед выбросом.
  6. Удалите раствор геля и снимите прозрачную защитную пленку с поверхности клея на поверхности прокладки. Добавьте последние 45 μL свежего раствора геля, аккуратно наденьте на камеру покровную крышку и избегайте попадания пузырьков воздуха. Нажмите на покровное стекло, чтобы закрыть камеру, и инкубируйте при 4 °C в течение 10 минут (всего 30 минут уравновешивания при 4 °C).
  7. Полимеризуйте гель при 37 °C в течение 1,5 ч.
  8. Как только гели застынут, дайте им остыть на скамейке в течение нескольких минут. Осторожно снимите покровное стекло и снимите силиконовую прокладку новым лезвием бритвы. Затем обрежьте гель в прямоугольник и обрежьте верхний правый угол, чтобы отслеживать ориентацию образца.
  9. Удалите гели со предметного стекла тонкой кистью, смоченной в небольшом количестве ProK Buffer, и перенесите их по отдельности в пробирки микроцентрифуги объемом 2 мл.
  10. Инкубируйте каждый гель с 500 мкл буфера ProK и 5 мкл фермента ProK (1:100) при 37 °C в течение ночи.

4. Расщепление ДНК и зондовая гибридизация (День 3)

  1. Смойте гели (3 раза) в течение 10 минут 1 мл PBS в RT.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте переводные пипетки с тонким наконечником, чтобы не повредить гель при замене растворов.
  2. Инкубировать гели в течение 30 мин в 1 мл буфера DNase1 при 37 °C.
  3. Добавьте 50 мкл фермента DNase1 к 450 мкл буфера ДНКазы. Аккуратно перемешивайте, но не делайте вихря. Инкубировать каждый гель в 500 мкл DNase1 в течение 2 ч 37 °C. Промыть (4x) 15 мин 1 мл PBS при RT.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Гели можно хранить в 5x SSC при 4 °C до или после переваривания/мытья DNазы в течение нескольких недель.
  4. Размораживание гибридизации (hyb) и буфер для промывки зонда. Инкубировать гели в 500 мкл гиб-буфера без зондов в течение 30 мин при температуре 37 °C.<бр/> ВНИМАНИЕ: Буфер для промывки гиба и зонда содержит формамид, который, как подозревают, вызывает рак.
  5. Разведите зонды в соотношении 1:100 в гиб-буфере (10 нМ), приготовив 300 мкл на гель. Инкубируйте гели с гиб-буфером и зондами в течение ночи при 37 °C. Держите буфер для промывки зонда и PBS при температуре 37 °C.

5. Промывка щупом (День 4)

  1. Промойте гели (3 раза) в течение 30 минут с помощью 750 μл буфера для промывки зонда при 37 °C.
  2. Промойте гели (3x) в течение 30 минут, затем (3x) в течение 1 часа с 1 мл PBS при 37 °C.
  3. Промойте гели в 2 мл PBS при RT в течение ночи или при 4 °C в выходные дни.

6. Цепная реакция гибридизации (HCR) с флуоресцентными шпильками (День 5)

ПРИМЕЧАНИЕ: Принцип HCR см. в ссылке22.

  1. Инкубируйте гели в 500 мкл амплификационного буфера (АМФ) в течение 30 мин при РТ.
  2. Нагрейте флуоресцентные шпильки при температуре 95°C в течение 90 секунд в ПЦР-машине и быстро охладите до 25°C в течение 30 минут.
  3. Для каждого зонда разбавьте подходящие пары шпилек (h1 и h2) в соотношении 1:50 в ампер-буфере, приготовив 300 μл на гель и вихрь.
  4. Инкубируйте гели со смесью шпилек в течение 3 часов при RT в темноте.
  5. Промойте гели (2x) в течение 15 минут 750 μл 5x SSCT и (2x) в течение 30 минут 1 мл 0,5x SSCT во время RT.
  6. Если мозг экспрессирует GFP, окрасьте 500 мкл антитела против GFP-AF488 (1:500) в PBT (0,1%), содержащим 5 мг/мл ультрачистого BSA, и инкубируйте в течение ночи (или в выходные) при 4 °C.

7. Монтаж гелей и визуализация (День 6)

  1. После инкубации антител промойте гели один раз и промойте (1x) в течение 30 минут 1 мл PBT (0,1%), а затем (3x) в течение 30 минут с 1 мл PBS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Стирка в PBS приведет к расширению в 2 раза; для 3-кратного расширения постирайте с 0,05x SSC.
  2. Во время стирки дважды смажьте гелевую поверхность гелевого держателя светового микроскопа 1 мкл полилизина, дав ему высохнуть при 37 °C между слоями. Аналогичным образом, для конфокальной визуализации покройте область крепления гелем чашки со стеклянным дном с повторным нанесением полилизина.
  3. Окрашивайте гели в течение 30 мин в RT в 1 мл 5 мкг/мл DAPI/PBS или DAPI/0,05x SSC, или в качестве альтернативы окрашивайте на ночь при 4 °C.
  4. Чтобы закрепить гель на держателе геля (светолистовом микроскопе) или чашке со стеклянным дном (конфокальный микроскоп), поместите гель на покровную крышку и тщательно высушите края безворсовой салфеткой. Убедитесь, что гель ориентирован таким образом, чтобы ткань была ближе всего к объекту. С помощью кисти аккуратно нанесите гель на поверхность полилизина одним движением. Для визуализации искупайте гель в PBS (или 0,05x SSC при расширении до 3x).
    ПРИМЕЧАНИЕ: После визуализации гели можно аккуратно удалить с поверхности полилизина влажной кистью и перенести в микроцентрифужную пробирку объемом 2 мл.
  5. Для немедленного повторного зондирования перейдите к дню 7. Для более длительного хранения (от 1 недели до 6 месяцев) храните гели в 1 мл 5x SSC при температуре 4 °C. Когда будете готовы к использованию, промойте гели (3x) в течение 10 минут 1 мл PBS, прежде чем продолжить.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Степень расширения в целом согласуется в описанных буферах (~2x в PBS и ~3x в 0.05x SSC). Чтобы проверить фактор расширения, измерьте размер мозга до и после расширения на изображениях, полученных с помощью флуоресцентного стереомикроскопа. Чтобы визуализировать мозг после расширения, кратковременно окрасьте его DAPI. Приблизительный коэффициент расширения — это размер после расширения, деленный на размер до расширения.

8. Съемные щупы и шпильки для мультиплексирования (День 7)

  1. Инкубируйте гели в течение 30 минут в 1 мл буфера DNase1 при 37°C.
  2. Добавьте 50 мкл DNase1 к 450 мкл буфера ДНКазы. Аккуратно перемешивайте, но не делайте вихря. Инкубируйте гели в 500 мкл ДНКазы1 в течение 2 ч при 37 °C.
  3. Промыть (4 раза) в течение 15 мин 1 мл PBS в режиме RT. Теперь гели готовы к следующему раунду гибридизации (день 3, шаг 6).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Производительность этого модифицированного протокола EASI-FISH демонстрируется путем обнаружения экспрессии нескольких различных нейротрансмиттер-ассоциированных и нейропептидных генов в мозге взрослой дрозофилы в течение нескольких раундов. Как правило, гелеобразные и расширенные мозги гибридизировали с двумя или тремя зондами за раунд, за которыми следовал HCR с парами шпилек, конъюгированными с Alexa Fluor (AF) 488 (если не экспрессировался GFP), AF546 и AF647 или Janelia Fluor (JF) 669. Визуализация в основн...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Описанный протокол EASI-FISH для интактной нервной системы дрозофилы позволяет обнаруживать десятки транскриптов в одном и том же мозге или ЦНС. Он надежен, прост и чувствителен, и его можно сочетать с обнаружением GFP для идентификации подмножеств нейронов или глии. Поскольку этот метод прост в реализации, он должен облегчить исследования лабораторий дрозофил, заинтересованных в картировании и количественной оценке экспрессии генов в неповрежденном мозге мухи.

EASI-FISH имее...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Никакого конфликта интересов заявлено не было.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим Пола Тиллберга за советы о динамике экспансионной микроскопии, Кристину Христофору за помощь в вскрытии мозга и Джеффри Мейсснера за критические отзывы. Мы также благодарим Таню Вольф и Джерри Рубина, а также Джеффри Мейсснера и Уайатта Корффа за то, что они позволили нам включить результаты, полученные в рамках двух более крупных исследований. Все работы были выполнены в исследовательском кампусе Janelia Research Campus при поддержке Медицинского института Говарда Хьюза за счет средств проектных групп MultiFISH и Fly-eFISH, Джерри Рубина и технических ресурсов проекта.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0,2 мл ПЦР-пробирок США Научный 1402-4700
Микроцентрифужные пробирки 0,5 мл с винтовой крышкой, AmberСША Scientific 1405-9707
0,5М ЭДТА, РН 8, РНКазный свободныйИнвитрогенAM9260G
10М NaOHSigma72068
10x PBS FisherBP 3994
20x SSCThermoFisherAM 9763
40% Акриламид Bio-Rad1610140
4-гидрокси-TEMPO (4HT)Sigma176141
5 М NaCl РНКаза;ThermofisherAM97060G
5 мл Transfer Pipet- Fine tipGlobal Scientific 134070-S20
6-луночная стеклянная нижняя пластина CellvisP06-1.5H-N
Ацетонитрил, безводный ThermoFisher042311-K7
Акриловая кислотаTCIA0141
Акрилоил-X ThermoFisherA20770
(APS)A3678
 Молекулярные инструментыhttps://store.molecularinstruments.com/new-bundle/rna-fish
безводный ДМСОInvitrogenD12345
AstA_B2Молекулярные инструментыPRR477
ChAT_B1Молекулярные инструментыPRG115
Crz_B5Молекулярные инструментыPRR480
DAPISigmaD9542
FIJIhttps://imagej.net/software/fiji/с открытым исходным кодом
FMRFa_B2Молекулярные инструментыPRR487
GAD1_B5Молекулярные инструментыRTE581
GFP Поликлональное антитело, Alexa Fluor 488ThermoFisherA-21311
Гибридизационный буферМолекулярные инструменты
Imaris StitcherOxford Instrumentshttps://imaris.oxinst.com/products/imaris-stitcher
просмотрщик Imaris OxfordInstrumentshttps://imaris.oxinst.com/imaris-viewer
JF-669, SE Tocris6420
MelphalanCaymen Chemicals16665
MOPs BufferFisherBP308-100
N,N Метилен-бис-акриламид Bio-Rad1610142
N,N,N',N'-тетраметилэтилендиамин (TEMED)SigmaT22500
Нуклеаза без воды AmbionAM9932
Олиго Зонды Молекулярные инструментыhttps://store.molecularinstruments.com/new-bundle/rna-fish
параформальдегида (PFA)EMS15710
PBSFisher 
Photoflo-200 EMS74257
Поли-L-лизин гидробромид (полилизин)SigmaP1524
Зонд Промывочный буферМолекулярные инструментыhttps://store.molecularinstruments.com/new-bundle/rna-fish
протеиназы K NEBP8107S
Набор для быстрого удаления нуклеотидов QIAGEN28306
РНКаза удалена ThermoFisher7003, реагент
РНКаза ДНКаза1Qiagen79254
S2 MediumThermoFisher21720024
силиконовые прокладки InvitrogenP24743
Tdc2_B5Molecular InstrumentsRTE880
Tk_B5Molecular InstrumentsPRR484
UltaPure 10% SDSThermofisher15553027
Ultrapure BSAThermoFisherAM2616
Unconjugated и Alexa Fluor-конъюгированные шпилькиMolecular Instruments
VAChT_B1Молекулярные инструментыRTA904
vGLUT_B2Молекулярные инструментыRTB212
Zeis Z7 Гелевый держатель ЯнелияФайлы САПР доступны по запросу
Конфокальный инвертированный микроскоп Zeiss LSM 980Zeisshttps://www.janelia.org/node/46947/#lsm980
светолистовой микроскоп Zeiss Z7 Световой листовой микроскопZeisshttps://www.zeiss.com/microscopy/us/products/light-microscopes/light-sheet-microscopes/lightsheet-7.html
Персульфат аммония Амплификационный буфер Sigma https://store.molecularinstruments.com/new-bundle/rna-fishBP24384для обеззараживанияhttps://store.molecularinstruments.com/new-bundle/rna-fish

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Langer-Safer, P. R., Levine, M., Ward, D. C. Immunological method for mapping genes on phila polytene chromosomes. Proc Natl Acad Sci USA. 79 (14), 4381-4385 (1982).
  2. Gall, J. G. The origin of in situ hybridization - A personal history. Methods. 98, 4-9 (2016).
  3. Kwon, S. Single-molecule fluorescence in situ hybridization: Quantitative imaging of single RNA molecules. BMB Rep. 46 (2), 65-72 (2013).
  4. Long, X., Colonell, J., Wong, A. M., Singer, R. H., Lionnet, T. Quantitative mRNA imaging throughout the entire Drosophila brain. Nat Methods. 14 (7), 703-706 (2017).
  5. Yang, L., et al. Single-molecule fluorescence in situ hybridization for quantitating post-transcriptional regulation in Drosophila brains. Methods. 126, 166-176 (2017).
  6. Meissner, G. W., et al. Mapping neurotransmitter identity in the whole-mount Drosophila brain using multiplex high-throughput fluorescence in situ hybridization. Genetics. 211 (2), 473-482 (2019).
  7. Duckhorn, C. J., Junker, I. P., Ding, Y., Shirangi, T. R. Combined in situ hybridization chain reaction and immunostaining to visualize gene expression in whole-mount Drosophila central nervous systems. Behavioral Neurogenetics. 181, 1-14 (2022).
  8. Eng, C. L., et al. Transcriptome-scale super-resolved imaging in tissues by RNA seqFISH. Nature. 568 (7751), 235-239 (2019).
  9. Zhang, M., et al. Spatially resolved cell atlas of the mouse primary motor cortex by MERFISH. Nature. 598 (7879), 137-143 (2021).
  10. Janssens, J., et al. Spatial transcriptomics in adult Drosophila reveals new cell types in the brain and identifies subcellular mRNA patterns in muscles. eLife. 13, RP92618(2024).
  11. Gandin, V., et al. Deep-tissue spatial omics: Imaging whole-embryo transcriptomics and subcellular structures at high spatial resolution. bioRxiv. , (2024).
  12. Fang, R., et al. Three-dimensional single-cell transcriptome imaging of thick tissues. eLife. 12, RP90029(2023).
  13. Moses, L., Pachter, L. Museum of spatial transcriptomics. Nat Methods. 19 (5), 534-546 (2022).
  14. Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. Optical imaging: Expansion microscopy. Science. 347 (6221), 543-548 (2015).
  15. Chen, F., et al. Nanoscale imaging of RNA with expansion microscopy. Nat Methods. 13 (8), 679-684 (2016).
  16. Schwarzkopf, M., et al. Hybridization chain reaction enables a unified approach to multiplexed, quantitative, high-resolution immunohistochemistry and in situ hybridization. Development. 148 (22), 199847(2021).
  17. Wang, Y., et al. EASI-FISH for thick tissue defines lateral hypothalamus spatio-molecular organization. Cell. 184, 6361-6377 (2021).
  18. Eddison, M., Ihrke, G. Expansion-assisted iterative fluorescence in situ hybridization (EASI-FISH) in Drosophila CNS. protocols.io. , (2022).
  19. Meissner, G., et al. A split-GAL4 driver line resource for Drosophila CNS cell types. bioRxiv. , (2024).
  20. Nern, A., et al. Connectome-driven neural inventory of a complete visual system. bioRxiv. , (2024).
  21. FlyLight Protocol. , HHMI Janelia Research Campus. Available from: https://www.janelia.org/project-team/flylight/protocols (2025).
  22. HCR Amplification Technology. , HCR. Available from: https://www.molecularinstruments.com/technology (2025).
  23. Wolff, T., et al. Cell-type-specific driver lines targeting the Drosophila central complex and their use to investigate neuropeptide expression and sleep regulation. eLife. 14, RP104764(2025).
  24. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  25. Watanabe, K., Chiu, H., Anderson, D. J. Whole-brain in situ mapping of neuronal activation in Drosophila during social behaviors and optogenetic stimulation. eLife. 12, RP92380(2024).
  26. Damstra, H. G. J., et al. Visualizing cellular and tissue ultrastructure using Ten-fold Robust Expansion Microscopy (TREx). eLife. 11, e73775(2022).
  27. Xu, S., et al. Behavioral state coding by molecularly defined paraventricular hypothalamic cell type ensembles. Science. 370 (6514), abb2494(2020).
  28. Wang, Y., et al. EASI-FISH for thick tissue defines lateral hypothalamus spatio-molecular organization. GitHub. , (2021).
  29. Park, G., et al. Using Amira to generate cell body masks in fluorescent light sheet microscopy images of EASI-FISH samples. protocols.io. , (2023).
  30. Bahry, E., et al. RS-FISH: Precise, interactive, fast, and scalable FISH spot detection. Nat Methods. 19 (12), 1563-1567 (2022).
  31. Managan, C., Ihrke, G. EASI-FISH spot counting in Drosophila brain using RS-FISH. protocols.io. , (2024).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Gene ExpressionDrosophila BrainExpansion MicroscopyIn Situ HybridizationEASI FISHMultiplex DetectionConfocal MicroscopyLight Sheet MicroscopyNeuropeptide ExpressionSingle RNA Detection

Related Articles