В настоящем протоколе описан пошаговый метод анализа механики дыхания мышиной модели ex vivo с использованием метода принудительных колебаний (FOT).
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Оценка функции легких на мышиной модели ex vivo
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Механика дыхания является ключевой областью исследований в определении и лечении патологий легких путем оценки функциональных возможностей легких. Механика легких может быть оценена с помощью различных маневров легких, в которых задействованы различные формы колебательных волн. При применении к легким эти маневры измеряют множество переменных, таких как давление, объем и поток, на основе реакции на формы волны. Затем эти сигналы рассчитываются и анализируются для определения таких параметров, как истеричность, устойчивость, податливость, демпфирование тканей и эластанс тканей, обеспечивая подробную оценку общей функции легких. Анализ механики дыхания особенно важен при оценке донорских легких для трансплантации легких. Настоящий протокол является первым в своем роде, предлагая комплексный и воспроизводимый поэтапный метод оценки механики дыхания с использованием мышиной модели ex vivo . Он включает в себя подробную информацию о выбранной модели животного, восстановлении, хранении и консервации легких, а также экспериментах с использованием системы, основанной на методе принудительных колебаний. Кроме того, в нем описывается анализ данных, клиническая значимость и применение метода принудительных колебаний при изучении модели ex vivo .
Введение
Трансплантация легких представляет собой единственное долгосрочное лечение терминальной стадии заболевания легких. Ежегодно во всем мире около 4 600 человек получают трансплантацию легких, но почти 600 пациентов умирают в листе ожидания из-за нехватки подходящих донорских легких. В целях увеличения пула доступных легких системы распределения доноров постоянно корректируются, что привело к тому, что хирурги вынуждены преодолевать большие расстояния в поисках донорских органов3. Увеличение расстояний неизменно увеличивает время холодной ишемии, что диктует необходимость в дополнительных методах сохранения органов.
В настоящее время стандартом сохранности донорских органов при трансплантации легких является холодная статическая консервация при 4 °С, ограничивающая время сохранения до 6-8 ч - небольшое окно жизнеспособности длятрансплантации. Тем не менее, при больших расстояниях и связанном с этим увеличении времени ишемии оценка функции легких до трансплантации имеет решающее значение4. С развитием политики в области трансплантации легких были проведены новые исследования, направленные на удовлетворение этой потребности. Недавние исследования показали, что сохранение холодного статического электричества при 10 °C является более оптимальной температурой хранения для сохранения легких, что приводит к улучшению функции легких, устойчивости к травмам и сопоставимым показателям первичной дисфункции трансплантата при имплантации 4,5,6,7,8. Кроме того, исследования, посвященные перфузии легких ex vivo (ЭВЛП), показали значительное улучшение использования донорского легкого и трансплантации без ущерба для реципиентов9. В то время как использование EVLP для расширения пула доноров для трансплантации легких и продления срока хранения хорошо задокументировано, эта технология является дорогостоящей, трудоемкой и требует специализированного обучения для выполнения10 лет. Таким образом, существует потребность в дополнительных методах изучения функции легких ex vivo, которые являются всеобъемлющими, недорогими и воспроизводимыми.
Традиционные измерения механики легких, например, кривые податливости, сопротивления, упругости и давления-объема, могут быть надежно определены с помощью бодиплетизмографии или с помощью аппаратов искусственной вентиляции легких с использованием однокамерной модели. Более детальная механика может быть получена с помощью модели вынужденных колебаний в соответствии с моделью постоянной фазы, которая может разделить механику дыхательных путей на центральные и периферические компартменты (ньютоновское сопротивление, тканевое демпфирование/эластанс, гистерезивность)11. Несмотря на то, что применение этих методов является воспроизводимым и всеобъемлющим, до сих пор ограничением являлось требование выполнения таких мер в модели in vivo, предположительно, когда обескровленное легкое теряет структуру в альвеолярном входном кольце12. В этом исследовании использовался коммерчески доступный аппарат искусственной вентиляции легких для небольших грызунов на основе метода принудительных колебаний с целью разработки модели ex vivo для лучшей характеристики механики легких для трансплантации легких.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Это исследование было одобрено Комитетом по исследованиям на животных в соответствии с Руководством Национальных институтов здравоохранения по уходу и использованию лабораторных животных. Использовали мышей дикого типа C57Bl/6 в возрасте 6-8 недель и массой от 18 до 28 г. Подробная информация о реагентах и оборудовании представлена в Таблице материалов.
1. Подготовка
- Используйте операционный микроскоп с 20-кратным увеличением для всех хирургических процедур.
- Очистите и простерилизуйте все хирургические инструменты перед началом процедуры. Используйте автоклавные инструменты или используйте подходящий стерилизующий раствор для поддержания асептических условий.
2. Экстракция донорских легких
- Выполнять все операции следует в стерильных условиях.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап выполняется в специально отведенном хирургическом помещении и в стерильных условиях. - Поместите мышь в анестезиологическую индукционную камеру и индуцируйте анестезию с 5% изофлураном в кислороде и поддерживайте анестезию с 3,5% изофлураном в кислороде на протяжении всей процедуры (в соответствии с утвержденными в учреждении протоколами).
- Запишите вес мыши до первого разреза.
- Закрепите мышь на операционном столе и обеспечьте надлежащую глубину анестезии, надавливая на палец ноги. Если мышь отстраняется от боли, увеличьте анестезию по мере необходимости.
- Удалите легкие у донора в соответствии со стандартной процедурой13.
ПРИМЕЧАНИЕ: Легкие и сердце были извлечены в блоке для перфузации легких ex vivo, а часть трахеи была удалена для последующей интубации.
3. Хранение и консервация легких
- После того, как легкие будут удалены у донора, интубируйте трахею с помощью внутривенного ангиокатетера 18 G, осторожно продвигая катетер, следя за тем, чтобы он не проколол трахею.
- Закрепите трахею над канюлей с помощью шелкового шва 3-0, обеспечивая плотное прилегание. Продвигайте внутривенный ангиокатетер 18 G до тех пор, пока он не окажется в пределах выходного тракта правого желудочка (RVOT), сразу за легочным клапаном.
- Запишите время, когда легкие были удалены из организма.
- Храните легкие в конической пробирке объемом 50 мл, содержащей коммерчески доступный раствор для консервации, при температуре 4 °C или 10 °C в течение ночи.
4. Настройка и калибровка
- Начните с включения системы и/или программного обеспечения.
- Запустите программу, нажмите кнопку «Создать новое исследование» и следуйте инструкциям на экране, чтобы определить протокол и назначить предметы.
- Нажмите « Сеанс экспериментов » и войдите в систему, используя инициалы имени и фамилии пользователя.
- Начните маркировать объекты в соответствии с согласованным соглашением об именовании.
- Введите информацию о поле, дате рождения и весе каждого субъекта.
- Выберите и назначьте объекты на место измерения и подтвердите веса.
- Продолжайте настройку и калибровку программного обеспечения, следуя инструкциям на экране.
ПРИМЕЧАНИЕ: Во время калибровки трубки к Y-образной трубке системы был прикреплен канюля того же типа, которая использовалась при интубации донорских легких, для обеспечения консистенции. - Повторите калибровку, если значения калибровки выходят за пределы допустимых диапазонов.
- Отмените запросы, чтобы начать проветривание до тех пор, пока она не будет готова. Экспериментальные сеансы с вентиляцией и регистрацией данных могут быть начаты позже.
5. Вентиляция легких и сбор данных
- Извлеките легкие из конической трубки объемом 50 мл. Для промывания капилляров легких необходимо промыть выходной тракт правого желудочка (РВОТ) с помощью ранее установленного внутривенного ангиокатетера 18 G с дополнительным консервирующим раствором в дозе 60 мл/кг.
ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимо проявлять большую осторожность, чтобы избежать обезвоживания донорских легких, так как это является известным фактором при изучении механики легких. - Закрепите донорские легкие на аппарате искусственной вентиляции легких и начните эксперимент.
- Нажмите « Начать вентиляцию», а когда будете готовы, нажмите «Начать запись », чтобы начать экспериментальный сеанс.
ПРИМЕЧАНИЕ: Аппарат искусственной вентиляции легких, используемый в этом исследовании, был настроен на частоту дыхания 150 вдохов/мин, дыхательный объем 10 мл/кг и PEEP 3. - Запустите каждую задачу, дважды щелкнув по задаче для оценки механики легких в списке задач в правой части страницы.
- Выполните задачу «Глубокая инфляция », расположенную в списке задач, чтобы еще больше убедиться в том, что ателектатические области задействованы, а объемы легких стандартизированы. Подробнее см. раздел Результаты.
- Приступайте к последовательности задач.
ПРИМЕЧАНИЕ: Функцию легких можно оценить с помощью нескольких задач по оценке механических свойств. Deep Inflation стандартизирует объем легких, в то время как Prime-8 стабилизирует механику легких. PV-P и PV-V измеряют статическую и динамическую податливость, сопротивление дыхательных путей и проводимость. Snapshot 150 обеспечивает быструю оценку сопротивления, податливости и эластичности, в то время как QuickPrime оценивает сопротивление дыхательных путей и тканей вместе с вязкоэластичностью легких. Эти задачи в совокупности обеспечивают всесторонний анализ функции легких. В данной статье в качестве репрезентативных результатов представлены данные для задач, выполняемых в Deep Inflation, Snapshot 150 и QuickPrime (с использованием коммерчески доступного оборудования). Объемы легких были стандартизированы между возмущениями с помощью задачи «Глубокая инфляция», чтобы свести к минимуму искажающие переменные при интерпретации данных. - Запустите выбранную последовательность задач в трех экземплярах.
- Нажмите « Остановить запись », а затем «Остановить вентиляцию».
- Экспортируйте данные по отдельности или перейдите к следующей теме и повторите шаги 5.1-5.9.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для данных, полученных из возмущений Snapshot 150 и QuickPrime, для надежного анализа требуется COD >0,95.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Для модели мыши представлено графическое изображение экспериментального плана (рисунок 1). Легкие надували с использованием коммерчески доступной системы искусственной вентиляции легких на основе метода принудительных колебаний для небольших грызунов для оценки механики дыхания донорской ткани в различных условиях (рис. 2). При сравнении результатов между группами сохраненных донорских легких было обнаружено, что группы донорских легких, которые хранились при 10...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Важность и потенциальное применение
Механика дыхания обычно используется в различных приложениях для изучения патологии легких и повреждений легких. Изучение механики дыхания было описано много раз в связи с прогрессированием таких заболеваний, как ОРДС, и в случаях вспомогательной вентиляции легких, но в литературе оно описано гораздо меньше, поскольку оно относится к трансплантации органов 15,16,17,18,19.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что исследование проводилось без каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть неверно истолкованы как конфликт интересов.
Благодарности
Авторы хотели бы поблагодарить Софи Паченси за использование системы искусственной вентиляции легких, а также Колина Уэлша за его помощь. Рисунок 1 был создан с использованием biorender.com. Это исследование было поддержано грантом Клинического и трансляционного института Южной Каролины (NIH/Национальный центр развития трансляционных наук) под номером UL1-TR001450.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 18 G ангиокатетер | B. Braun | 4251687-02 | Прямая втулка |
| 24 G ангиокатетер | B. Braun | 4251601-02 | Прямая втулка |
| 3 мл шприц | Fisher Scientific | 14-823-41 | |
| 3-0 шелковый шовный материал | Medex | ETH-A304H | |
| 50 мл конические трубки | Thermo Fisher | 339652 | |
| 70% EtOH | Fisher Scientific | BP82031GAL | |
| Анестезиологическая индукционная камера | Harvard Apparatus | 75-2030 | Герметичная индукционная камера для крыс |
| Наркозный аппарат | Harvard Apparatus | 75-0238 | Мобильная анестезиологическая система с пассивной продувкой |
| Анестезиологическая маска | Harvard Apparatus | 59-8255 | Маска для анестезии крыс |
| Тупые микрощипцы | World Прецизионные инструменты | 501217 | Щипцы для повязки, 12,5 см, прямые, зубчатые |
| C57Bl/6 мышей | Charles River | Код штамма 027 | Дикий тип, 6-8 недель, 18-28г |
| Цифровые весы | Fisher | Scientific S72422 | |
| Система FlexiVent | Scireq | NC2926059 | методом принудительных колебаний на основе аппарата искусственной вентиляции легких для мелких грызунов |
| Инсулиновый шприц, 1 мл | Fisher Scientific | 14-841-33 | |
| Изофлуран, USP | Piramal Critical Care | NDC 66794-017-25 | |
| Операционный микроскоп или хирургические лупы | AmScope | SM-3BZ-80S | 3,5x - 90x Стереомикроскоп |
| Perfadex раствор | Xvivo | 19811, 19850 | |
| Чашки Петри | Fisher Scientific | FB0875714 | |
| Стерильные ватные палочки | Puritan | 25-806 1WC | |
| Стерильные марлевые губки | Fisher Scientific | 22-037-902 | |
| Хирургические ножницы | World Precision Instruments | 1962C | Ножницы Метценбаума |
Ссылки
- Erdman, J., et al. Lung transplant outcomes in adults in the United States: Retrospective cohort study using real-world evidence from the SRTR. Transplantation. 106 (6), 1233-1242 (2022).
- Valapour, M., Lehr, C. OPTN/SRTR 2022 Annual Data Report: Lung. , Available at: https://srtr.transplant.hrsa.gov/annual_reports/2022/Lung.aspx (2022).
- Benvenuto, L., Arcasoy, S. The new allocation era and policy. J Thorac Dis. 13 (11), 6504-6513 (2021).
- Ali, A., et al. Static lung storage at 10 °C maintains mitochondrial health and preserves donor organ function. Sci Transl Med. 13 (611), eabf7601(2021).
- Wang, L., et al. The effect of ischemic time and temperature on lung preservation in a simple ex vivo rabbit model used for functional assessment. J Thorac Cardiovasc Surg. 98 (3), 333-342 (1989).
- Date, H., et al. In a canine model, lung preservation at 10 °C is superior to that at 4 °C: A comparison of two preservation temperatures on lung function and on adenosine triphosphate level measured by phosphorus 31-nuclear magnetic resonance. J Thorac Cardiovasc Surg. 103 (4), 773-780 (1992).
- Hoetzenecker, K., et al. The advent of semi-elective lung transplantation-prolonged static cold storage at 10 °C. Transpl Int. 37 (1), 12310(2024).
- Abdelnour-Berchtold, E., et al. Evaluation of 10 °C as the optimal storage temperature for aspiration-injured donor lungs in a large animal transplant model. J Heart Lung Transplant. 41 (12), 1679-1688 (2022).
- Moreno Garijo, J., Roscoe, A. Ex vivo lung perfusion. Curr Opin Anaesthesiol. 33 (1), 50-54 (2020).
- Rajab, T., Keshavjee, S. Ex vivo lung perfusion. Artif Organs. 44 (1), 12-15 (2020).
- Oostveen, E., et al. The forced oscillation technique in clinical practice: Methodology, recommendations, and future developments. Eur Respir J. 22 (6), 1026-1041 (2003).
- Gibney, B., et al. Structural and functional evidence for the scaffolding effect of alveolar blood vessels. Exp Lung Res. 43 (9-10), 337-346 (2017).
- Rajab, T. Techniques for lung transplantation in the rat. Exp Lung Res. 45 (9-10), 267-274 (2019).
- Evaluation of ventilation at 10 °C as the optimal storage condition for donor lungs in a murine transplant model. Hill, M., et al. The International Society for Heart and Lung Transplantation 44th Annual Meeting and Scientific Sessions, Prague, Czech Republic, , (2024).
- Hess, D. Respiratory mechanics in mechanically ventilated patients. Respir Care. 59 (11), 1773-1794 (2014).
- Henderson, W., et al. Fifty years of research in ARDS: Respiratory mechanics in acute respiratory distress syndrome. Am J Respir Crit Care Med. 196 (7), 822-833 (2017).
- Mauri, T., et al. Respiratory mechanics to understand ARDS and guide mechanical ventilation. Physiol Meas. 38 (12), R280-R303 (2017).
- Bersten, A., et al. Respiratory mechanics and surfactant in the acute respiratory distress syndrome. Clin Exp Pharmacol Physiol. 25 (11), 955-963 (1998).
- Grinnan, D., Truwit, J. Clinical review: Respiratory mechanics in spontaneous and assisted ventilation. Crit Care. 9 (5), 472-484 (2005).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
