Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Определение лекарственной чувствительности и лекарственного взаимодействия у микобактерий туберкулеза с помощью микротитра резазурина и шахматного анализа

923 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/67672

⸱

24 октября 2025 г.

 ,  , 
1Department of Immunology, National Institute for Research in Tuberculosis, 2University of Madras, 3Faculty of Medical Research, Academy of Scientific and Innovative Research (AcSIR)

В этой статье

Краткое содержание

В данной работе мы представляем протокол визуализации и стандартизации анализа микротитров резазурина (REMA) и его шахматной вариации для оценки чувствительности к препаратам и профилей взаимодействия Mycobacterium tuberculosis. Этот метод позволяет in vitro оптимизировать комбинации препаратов, которые будут использоваться в схемах лечения и борьбе с туберкулезом с множественной лекарственной устойчивостью.

Аннотация

Появление туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ-ТБ) требует быстрых и точных методов тестирования на лекарственную чувствительность (ТЛЧ) для эффективного лечения. В данном исследовании представлена методология, сочетающая анализ микротитров резазурина (REMA) и шахматный анализ для определения минимальной ингибирующей концентрации (MIC) и оценки лекарственного взаимодействия противотуберкулезных препаратов против Mycobacterium tuberculosis. REMA, адаптированный к 96-луночному формату, использует восстановление красителя резазурина метаболически активным M. tuberculosis в качестве визуального индикатора чувствительности к лекарственным препаратам. В отношении изолятов M. tuberculosis проверяются различные концентрации противотуберкулезных препаратов, а для определения МПК наблюдаются изменения цвета. Затем используется шахматный анализ для оценки потенциальных синергических, аддитивных или антагонистических эффектов между комбинациями лекарств. Этот простой и недорогой метод дает результаты в течение семи дней, что дает значительное преимущество по сравнению с традиционными методами перехода на летнее время. Этот метод дает ценную информацию о летнем времени изолятов M. tuberculosis и облегчает идентификацию перспективных комбинаций препаратов для улучшения результатов лечения МЛУ-ТБ.

Введение

Туберкулез (ТБ), вызываемый Mycobacterium tuberculosis, остается серьезной глобальной проблемой для здравоохранения, которая усугубляется появлением штаммов, устойчивых к лекарствам. По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), в 2023 году было зарегистрировано 10,6 миллиона новых случаев заболевания туберкулезом и 1,3 миллиона смертей, что подчеркивает острую необходимость в более эффективных диагностических и терапевтическихстратегиях1. Туберкулез с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ-ТБ) и туберкулез с широкой лекарственной устойчивостью (ШЛУ-ТБ) создают серьезные проблемы для борьбы с болезнью из-за сложности, токсичности и длительной продолжительности существующих схем лечения 2,3.

Недавнее внедрение новых противотуберкулезных препаратов, таких как бедаквилин и деламанид, нацеленных на уникальные биохимические пути лечения M. tuberculosis, представляет собой прорыв в лечении туберкулеза 4,5. Эти препараты были одобрены в первую очередь для использования в случаях ТБ, устойчивых к фторхинолонам и рифампицину, в рамках одобренных ВОЗ более длительных и коротких схем лечения МЛУ-ТБ 6,7. Тем не менее, определение оптимальных комбинаций лекарственных препаратов и режимов дозирования, особенно когда эти препараты используются в сочетании с установленными методами лечения, остается критически важной областью исследований 8,9. Современные методы определения чувствительности к лекарственным препаратам (DST), хотя и надежны, часто требуют много времени, ресурсов и непрактичны для оценки сложных комбинаций лекарственных препаратов в клинических или исследовательскихусловиях. Это подчеркивает необходимость простых, масштабируемых фенотипических анализов, которые могут оценить как эффективность препарата, так и профили взаимодействия при M. tuberculosis.

Среди таких фенотипических подходов анализ микротитров резазурина (REMA) стал широко распространенным и традиционным методом оценки чувствительности к лекарственным препаратам. Анализ основан на восстановлении синего красителя резазурина до розового метаболически активными бактериями, что служит визуальным индикатором жизнеспособности клеток. Несмотря на то, что принцип использования резазурина для оценки роста бактерий был популяризирован Palomino et al. в 2002году11, он восходит к работе Pital et al.12. За последние два десятилетия метод REMA был широко валидирован и включен в стандартные операционные процедуры исследования микобактерий и диагностического тестирования 13,14,15.

В дополнение к REMA, шахматный анализ, представленный Caleffi-Ferracioli et al., расширяет возможности REMA за счет проведения исследований взаимодействия двух лекарственных препаратов в формате микроразведения с использованием одного и того же считывания на основе резазурина16. Несмотря на то, что этот метод в принципе перспективен, он остается в первую очередь исследовательским инструментом, полезным для скрининга потенциальных синергических или антагонистических комбинаций лекарств во время ранней доклинической оценки, а не рутинным диагностическим анализом.

В данной рукописи REMA или его вариант в шахматном порядке не представлены как новые методы. Скорее, цель данного исследования состоит в том, чтобы обеспечить визуальное представление полезной и валидированной методологии определения МПК и тестирования лекарственного взаимодействия, которая была описана и успешно применена в более ранних исследованиях. Мы предоставляем пошаговый протокол с подробными инструкциями по приготовлению инокулята, титрованию препарата, раскладке планшетов, интерпретации MIC и анализу взаимодействия в шахматном порядке. Данная рукопись направлена на поддержку более широкого и последовательного использования REMA и шахматных тестов при разработке противотуберкулезных препаратов и экспериментальной фармакологии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Химические вещества и материалы, использованные в примерах экспериментов, доступны в файле Table of Materials.

1. Подготовка среды 7Н9-С

  1. На 100 мл среды 7H9-S весить 0,47 г порошка 7H9 и 0,1 г казитона, затем растворить в 90 мл дистиллированной воды; Перемешайте до полного растворения.
  2. Стерилизуйте бульон в колбе объемом 250 мл с помощью автоклава при температуре 121 °C в течение 15 минут.
  3. После автоклавирования и охлаждения добавьте 10 мл добавки олеинового альбумина декстрозы каталазы (OADC) и 0,5 мл глицерина.
  4. Инкубируйте в течение ночи при температуре 37 °C, чтобы проверить стерильность.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Стерильность приготовленной среды 7H9-S проверяется путем ее инкубации в течение ночи при 37 °C. На следующий день среда должна оставаться прозрачной, помутнения не наблюдается.
  5. Храните среду 7H9-S при температуре 4 °C, вдали от прямых солнечных лучей.

2. Препарат посевного материала M.tuberculosis

  1. Приготовление посевного материала из культуры M.tuberculosis , выращенной в твердой среде Lowenstein Jensen (LJ)
    1. С помощью стерильной петли посева соберите полную петлю культуры M. tuberculosis из свежевыращенной (возрастом 21-28 дней) среды ЖЖ.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Осторожно избегайте слишком глубокого проникновения в среду, так как это может потревожить старые колонии.
    2. Поместите собранные бактерии в стерильную бутылочку для бижутерии, содержащую стерильные стеклянные шарики и 2,5 мл бульона 7H9-S. Убедитесь, что стеклянные шарики помогают в механическом разрушении комков во время завихрения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Свежие посевы в период от 21 до 28 дней необходимы для обеспечения надежных результатов тестов на чувствительность. Избегайте использования старых культур, так как они могут привести к непоследовательным результатам.
    3. Закрепите бижутерию и энергично закрутите вихрь не менее чем на 1 минуту. Обеспечьте непрерывное перемешивание, чтобы разбить бактериальные комки, в результате чего образуется относительно мутная суспензия. Цель состоит в том, чтобы обеспечить равномерное распределение бактерий в среде.
    4. Переложите суспензию культуры в свежую бутылку для бижутерии и дайте ей постоять в течение 15 минут. Этот шаг позволяет более крупным бактериальным комкам осесть на дне.
    5. Используя стандарт McFarland 1.0 в качестве эталона, проверьте мутность суспензии для культуры и откорректируйте с помощью бульона 7H9-S до достижения желаемой мутности.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Стандарт Макфарланда, обычно 1,0, используется в качестве эталона для мутности, эквивалентной приблизительно 1,97 × 106 КОЕ/мл17. Стандарт получают путем соединения 0,1 мл 1% хлорида бария и 9,9 1 мл 1% серной кислоты, в результате чего получается мелкодисперсный осадок сульфата бария, который обеспечивает помутнение. Бактериальную суспензию визуально сравнивают со стандартом Макфарланда, держа обе пробирки на белом фоне с черными линиями. Мутность бактериальной суспензии регулируется в соответствии со стандартом.
  2. Приготовление посевного материала из культуры M.tuberculosis , выращенной в жидкой среде 7H9
    1. С помощью стерильной пипетки перенесите 2,5 мл культуры M. tuberculosis (возрастом 2-3 недели) в свежий флакон для бижутерии со стеклянными бусинами.
    2. Перемешайте смесь не менее 1 минуты, чтобы обеспечить однородную суспензию. Вихревое действие помогает разбить любые комки.
    3. Перелейте 2,5 мл суспензии культуры в свежую бутылочку для бижутерии и оставьте на 15 минут, чтобы комки осядли на дне.
    4. Сравните мутность со стандартом McFarland 1.0 и отрегулируйте с помощью бульона 7H9-S для достижения требуемой концентрации.
  3. Разбавление посевного материала
    1. Приготовьте разведение в соотношении 1:10: Чтобы разбавить инокулюм, добавьте 1 мл бактериальной суспензии в 9 мл бульона 7H9-S в стерильном контейнере (это даст примерно 1,97 ×10 5 КОЕ/мл).

3. Приготовление антибиотиков и хранение

  1. Приготовление исходных и рабочих растворов: Приготовьте лекарственные препараты, используемые в примере эксперимента, вместе с их исходными и рабочими растворами, как указано в таблице 1.
    1. Изониазид (INH или I): Для приготовления стокового раствора изониазида в дозе 1 мг/мл растворите 2 мг порошка изониазида в 2,0 мл дистиллированной воды. Стерилизуют раствор с помощью шприцевого фильтра 0,22 мкм.
    2. Моксифлоксацин (МОКС или М): Для приготовления 1 мг/мл стокового раствора моксифлоксацина растворите 2 мг порошка моксифлоксацина в 2,0 мл дистиллированной воды. Стерилизуют раствор с помощью шприцевого фильтра 0,22 мкм.
    3. Бедаквилин (BDQ или J): бедаквилин плохо растворяется в воде. Для приготовления стокового раствора в концентрации 1 мг/мл растворите 2 мг порошка бедаквилина в 2,0 мл ДМСО. Стерилизуют раствор с помощью шприцевого фильтра 0,22 мкм.
    4. Деламанид (DEL или D): Подобно бедаквилину, деламанид плохо растворяется в воде. Для приготовления стокового раствора в концентрации 1 мг/мл растворите 2 мг порошка деламанида в 2,0 мл ДМСО. Стерилизуют раствор с помощью шприцевого фильтра 0,22 мкм.
  2. Хранение: Аликвотировать по 100 мкл каждого исходного раствора препарата в стерильные криовиалы и хранить их при температуре -20 °С до 3 месяцев. После размораживания выбросьте оставшийся раствор. Не замораживайте повторно.

4. Приготовление раствора Резазурина и хранение

  1. Растворите резазурин до конечной концентрации 0,01% или 0,02% в дистиллированной воде. Отфильтруйте раствор через фильтр 0,2 мкм для стерилизации.
  2. Стерилизованный раствор резазурина хранить при температуре 4 °C до 1-2 недель в защищенном от света месте для предотвращения разложения.

5. Подготовка пластины REMA

ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 1 приведено визуальное руководство по настройке 96-луночного микротитровального планшета REMA. 96-луночный планшет обеспечивает достаточное пространство для проведения анализов лекарств в двух экземплярах для каждого препарата в шести двойных разведениях.

  1. Добавить бульон 7H9-S: С помощью многоканальной пипетки добавить 100 мкл бульона 7H9-S в столбцы 2-11, ряды B-G. Обеспечьте равномерное распределение по всем скважинам.
  2. Добавить растворы лекарственных препаратов: Добавить 100 мкл рабочего раствора INH в лунки В2 и В6. Аналогичным образом, добавьте рабочие растворы MOX, DEL и BDQ в соответствующие скважины (B3 и B7, B4 и B8, B5 и B9).
  3. Разбавьте концентрации препарата: с помощью многоканальной пипетки выполните двукратное последовательное разведение из рядов B в G (столбцы 2-9), гарантируя, что после смешивания в ряду G будут отброшены последние 100 μL.
  4. Лунки для контроля роста: Добавьте 100 мкл бульона 7H9-S в лунки B10 и C10 для контроля роста.
  5. Отрицательный контроль и контроль стерильности: Добавьте 200 μл бульона 7H9-S в лунки B11 и C11 для использования в качестве отрицательного и стерильного контроля.
  6. Предотвращение испарения: Добавьте 200 μL стерильной дистиллированной воды во все внешние лунки, чтобы свести к минимуму испарение во время инкубации.
  7. Инокуляционные планшеты: Инокулируйте каждую лунку 100 мкл разбавленной суспензии культуры 1:10, за исключением отрицательной контрольной лунки. Обеспечьте равномерную инокуляцию во всех скважинах.
  8. Запечатайте и инкубируйте: запечатайте планшеты в полиэтиленовые пакеты для поддержания стерильности и инкубируйте при температуре 37 °C в течение 7 дней.

6. Тест на титрование в шахматном порядке REMA

ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к рисункам 2A, B для получения наглядного руководства по шаблону теста для титрования REMA в шахматном порядке для комбинаций лекарственных препаратов (например, BDQ и DEL).

  1. Разбавляйте лекарства по вертикали и горизонтали: Разбавляйте первый препарат (BDQ) по вертикали (строки B-H) и второй препарат (DEL) по горизонтали (столбцы 2-8) для получения различных комбинаций из двух препаратов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Готовьте серийно разведенный рабочий раствор в стерильном флаконе (от 4 мкг/мл - 0,06 мкг/мл) для препарата, который разводят горизонтально.
  2. Добавьте рабочий раствор BDQ для вертикального разведения: Добавьте 100 μл рабочего раствора BDQ в лунки B2 и B8.
  3. Добавьте бульон 7H9-S: С помощью многоканальной пипетки добавьте 50 μL бульона 7H9-S в колонки C2-H8. Обеспечьте равномерное распределение по всем скважинам.
  4. Разбавьте концентрации препарата: с помощью многоканальной пипетки выполните двукратное разведение из рядов B-H (столбцы 2-8), гарантируя отбрасывание последних 50 μL после смешивания в ряду H.
  5. Добавить рабочий раствор DEL для горизонтального разведения: В соответствующие лунки добавить серийно разбавленные рабочие растворы препаратов от 4 мкг/мл до 0,06 мкг/мл.
  6. Лунки для контроля роста: Добавьте 100 мкл бульона 7H9-S в лунки B9 и C9 для контроля роста.
  7. Отрицательный контроль и контроль стерильности: Добавьте 200 μл бульона 7H9-S в лунки B10 и C10 для контроля отрицательной и стерильности.
  8. Инокуляционные планшеты: Инокулируйте каждую лунку 100 мкл разбавленной суспензии культуры 1:10, за исключением отрицательной контрольной лунки. Обеспечьте равномерную инокуляцию во всех скважинах.
  9. Запечатайте и инкубируйте: запечатайте планшеты в полиэтиленовые пакеты для поддержания стерильности и инкубируйте при температуре 37 °C в течение 7 дней.

7. Инкубация и интерпретация результатов

  1. Окрашивание резазурином: После 7 дней инкубации добавьте по 30 мкл резазурина (0,01%-0,02%) в каждую лунку. Запечатайте и инкубируйте пластину на ночь для развития цвета.
  2. Интерпретируйте изменение цвета.
    1. Осмотрите лунки визуально при постоянном белом свете или сбалансированном дневном свете.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Контроль роста (без препарата) должен стать от синего до розового, что указывает на активный бактериальный метаболизм. Голубой цвет говорит о полном торможении роста. Розовый цвет обозначает активный рост, в то время как фиолетовый (смешанный оттенок) представляет собой частичное торможение.
    2. Сравните интенсивность цвета как с отрицательным контролем (только среда), так и с положительным контролем (рост бактерий без лекарства) для точной интерпретации. Чтобы свести к минимуму предвзятость наблюдателя, используйте двойные независимые показания или фотосъемку пластин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Визуальное восприятие может варьироваться в зависимости от условий окружающего освещения, поэтому необходимо постоянное освещение.
  3. Минимальная ингибирующая концентрация (MIC)
    1. Определите МПК как самую низкую концентрацию препарата, при которой лунка остается полностью синей, что указывает на ≥99% ингибирование метаболической активности. Рассмотрите лунки с фиолетовым или розовым цветом, свидетельствующими о частичном или полном росте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Определение MIC с помощью REMA приближается к принципам классического метода пропорций, в котором MIC считается самой низкой концентрацией, ингибирующей ≥99% инокулюма по сравнению с контролем без наркотиков. Хотя REMA не использует подсчет КОЕ, визуальная конечная точка представляет собой фенотипический коррелят этого порогового значения, основанного на пропорциях. Эта интерпретация согласуется с ранее установленными колориметрическими протоколами11,14.

8. Расчет индекса фракционной ингибирующей концентрации (FIC)

ПРИМЕЧАНИЕ: Индекс фракционной ингибиторной концентрации (FIC) помогает определить взаимодействие между двумя препаратами (синергизм, антагонизм или безразличие). Он рассчитывается на основе значений MIC, полученных в результате анализа в шахматном порядке.

  1. Определите МПК для каждого препарата отдельно: С помощью анализа REMA определите МПК для каждого препарата при индивидуальном применении.
  2. Определите МПК для каждого препарата в комбинации: С помощью теста на титрование в шахматном порядке определите МПК каждого препарата при использовании в комбинации со вторым препаратом.
  3. Рассчитайте СИК для каждого препарата.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В таблице 2 приведены формулы, используемые для расчета СИК и индекса СИК. В таблице 3 приведены консолидированные МПК на основе анализа REMA. Репрезентативные значения индексов МПК и FIC приведены в таблице 4.
    1. Интерпретируйте индекс FIC следующим образом:
      FIC ≤ 0,5: Указывают на синергию - препараты работают вместе, подавляя рост более эффективно, чем любой из препаратов по отдельности.
      FIC > от 0,5 до < 4,0: Укажите аддитивность - комбинированный эффект равен сумме отдельных эффектов.
      FIC ≥ 4.0: Указывают на антагонизм – препараты препятствуют активности друг друга.
  4. Пример: Расчет индекса FIC для BDQ и DEL в H37Rv
    1. Определите МПК BDQ для H37Rv (например, 0,125 мкг/мл). В сочетании с DEL запишите MIC BDQ как 0,03 мкг/мл.
    2. Определите МПК DEL для H37Rv (например, 0,063 мкг/мл). В сочетании с BDQ запишите MIC DEL как 0,125 мкг/мл.
    3. Рассчитать FIC для BDQ:
      FIC(BDQ) = MIC BDQ в комбинации/MIC одного BDQ = 0,03 / 0,125 = 0,24
    4. Вычислите FIC для DEL:FIC(DEL) = MIC от DEL в комбинации / MIC только от DEL = 0,125 / 0,063 = 1,98
    5. Сложите оба FIC, чтобы получить индекс FIC:FIC Index = FIC(BDQ) + FIC(DEL) = 0,24 + 1,98 = 2,26
    6. Интерпретируйте результат.
      Примечание: Индекс FIC 2,26 находится в диапазоне аддитивного взаимодействия (от >0,5 до <4,0), что указывает на то, что комбинация BDQ и DEL оказывает аддитивное действие на ингибирование роста M. tuberculosis.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Определение МПК противотуберкулезных препаратов методом REMA анализа
Активность бедаквилина, деламанида, моксифлоксацина и изониазида оценивали с помощью REMA в отношении лекарственно-чувствительного H37RV и лекарственно-устойчивого клинического изолята M. tuberculosis. Бедаквилин, деламанид и изониазид применяли в диапазоне концентраций (от 1 мкг/мл до 0,03 мкг/мл), а моксифлоксацин находился в диапазоне от (от 2 мкг/мл до 0,06 мкг/мл). Затем бактериальные суспензии лекарственно-устойчивых к...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Глобальная угроза, которую представляет лекарственно-устойчивый туберкулез (ЛУ-ТБ), стала актуальной проблемой 1,19. В связи с этим возникла острая необходимость в разработке усовершенствованных и быстрых методов тестирования на чувствительность к лекарственным препаратам (ДСТ), особенно для противотуберкулезных препаратов второго ряда и более новых препаратов. Такие методы имеют важное значение для совершенствования стратегий ле...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Квадратный флакон 250 мл с крышкойШотт Дюран218203655Подготовка СМИ
Бульон 7H9Бектон Дикинсон271310Питательные среды для M. tuberculosis (Комнатная температура)
Планшет на 96 лунок с крышкойКорнинг359696-луночные прозрачные микропланшеты с плоским дном, обработанные полистиролом TC, индивидуально упакованные, с крышкой, стерильные (комнатная температура)
ART-Tips (1000 μ L)ТАРСОНЫ528106Фильтры из гидрофобного полиэтилена с  Полипропиленовый стеллажный фильтр-наконечник стерильный (комнатная температура)
ART-Tips (200 μ L)ТАРСОНЫ528104Фильтры из гидрофобного полиэтилена с  Полипропиленовый стеллажный фильтр-наконечник стерильный (комнатная температура)
Дигидрат хлорида барияМерк217565McFarland Стандартная подготовка (Комнатная температура)
Бедаквилин (BDQ)Янсен и ЯнсенПодарок от Янсена и ЯнсенаПротивотуберкулезный препарат (4° C)
КазитонБектон Дикинсон225930Добавка для бактериального посева (Комнатная температура)
Деламанид (DEL)Оцука ФармасьютикалзПодарок от Otsuka PharmaceuticalsПротивотуберкулезный препарат (4° C)
ДиметилсульфоксидСигма-Олдрич67-68-5Препарат для приготовления бульона (Комнатная температура)
Фильтр 0.2 μ mМногородностьSLGVR33RS0.22  μ m PVDF, одноразовый, стерильный шприцевой фильтр (Комнатная температура)
ГлицеринМерк356350Добавлено в культуральную среду (Комнатная температура)
Петля инокуляцииСигма-ОлдричИ8263Для приготовления суспензии для культуры (Комнатная температура)
Изониазид (INH)Сигма-ОлдричИ3377-5ГПротивотуберкулезный препарат (4° C)
ЖЖ средний НаклонныйБД Микобактозел221414Питательные среды для M. tuberculosis (4° C)
McCartney Bijou Narrow Mouth флакон, 14 млСупертек12.124.0014Для приготовления суспензии для культуры (Комнатная температура)
McCartney Bijou Narrow Mouth флакон, 7 млСупертек12.124.0007Для приготовления суспензии для культуры (Комнатная температура)
Микропипетки (1000 мкм; L)ГилсонF144059MДля точной работы с жидкостями (комнатная температура)
Микропипетки (200 мкм; L)ГилсонFA10005MДля точной работы с жидкостями (комнатная температура)
Моксифлоксацин (МОКС)Сигма-ОлдричSML1581-50МГПротивотуберкулезный препарат (4° C)
Многоканальная пипетка (20– 200 μ L)ВВР849070024Для одновременного пипетирования через лунки
OADCБектон Дикинсон211886Добавка для бактериального посева (4° C)
Наполнители для пипетокМеркZ333980Для точной работы с жидкостями (комнатная температура)
Резазурин натриевая сольСигма-Олдрич62758-13-8Окислительно-восстановительный индикатор для анализов REMA (комнатная температура)
Серологические пипетки, 10 млКорнингCLS4100Использовались стерильные, полистирольные одноразовые пипетки (Комнатная температура)
Штапики из цельного стекла, диаметр 6 ммСигма-ОлдричZ265950Для приготовления суспензии для культуры (Комнатная температура)
Кислота серная 95– 97%Мерк100731McFarland Стандартная подготовка (Комнатная температура)
Шприцы для фильтраДиспо-фургон100032Для использования со шприцевыми фильтрами
Вихревой смесительРЕМИСМ-101 ПЛЮСДля приготовления суспензии для культуры
Полиэтиленовый пакет на молнииСигма-ОлдричZ162949

Ссылки

  1. Global tuberculosis report 2023. , World Health Organization. https://www.who.int/publications/i/item/9789240083851 (2023).
  2. Khawbung, J. L., Nath, D., Chakraborty, S. Drug-resistant tuberculosis: A review. Comp Immunol Microbiol Infect Dis. 74, 101574(2021).
  3. Alame Emane, A. K., Guo, X., Takiff, H. E., Liu, S. Highly transmitted M. tuberculosis strains are more likely to evolve MDR/XDR and cause outbreaks, but what makes them highly transmitted. Tuberculosis. 129, 102092(2021).
  4. Koul, A., et al. Delayed bactericidal response of Mycobacterium tuberculosis to bedaquiline involves remodelling of bacterial metabolism. Nat Commun. 5, 3369(2014).
  5. Matsumoto, M., et al. OPC-67683, a nitro-dihydro-imidazooxazole derivative with promising action against tuberculosis in vitro and in mice. PLoS Med. 3 (11), e466(2006).
  6. WHO consolidated guidelines on tuberculosis: Module 4. treatment drug-resistant tuberculosis treatment. , World Health Organization. At https://www.who.int/publications/i/item/9789240063129 (2020).
  7. Conradie, F., et al. Treatment of highly drug-resistant pulmonary tuberculosis. N Engl J Med. 382 (10), 893-902 (2020).
  8. Lechartier, B., Hartkoorn, R. C., Cole, S. T. In vitro combination studies of benzothiazinone lead compound BTZ043 against Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother. 56 (11), 5790-5793 (2012).
  9. Mallikaarjun, S., et al. Delamanid coadministered with antiretroviral drugs or anti-tuberculosis drugs shows no clinically relevant drug-drug interactions in healthy subjects. Antimicrob Agents Chemother. 60 (10), 5976-5985 (2016).
  10. Pai, M., Nicol, M. P., Boehme, C. C. Tuberculosis diagnostics: State of the art and future directions. Microbiol Spectr. 4 (5), (2016).
  11. Palomino, J. -C., et al. Resazurin microtiter assay plate: Simple and inexpensive method for detection of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother. 46 (8), 2720-2722 (2002).
  12. Pital, A., Pital, R. C., Leise, J. M. A rapid method for determining the drug susceptibility of Mycobacterium tuberculosis. Am Rev Tuberc. 78 (1), 111-116 (1958).
  13. Präbst, K., Engelhardt, H., Ringgeler, S., Hübner, H. Basic colorimetric proliferation assays: MTT, WST, and Resazurin. Methods Mol Biol. 1601, 1-17 (2017).
  14. Schön, T., et al. Antimicrobial susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis complex isolates - the EUCAST broth microdilution reference method for MIC determination. Clin. Microbiol. Infect. 26 (11), 1488-1492 (2020).
  15. Singh, S., et al. Rapid identification and drug susceptibility Testing of Mycobacterium tuberculosis: Standard operating procedure for non-commercial assays: Part 3: Colorimetric Redox Indicator Assay v1.3.12. J Lab Physicians. 4 (2), 120-126 (2012).
  16. Caleffi-Ferracioli, K. R., Maltempe, F. G., Siqueira, V. L. D., Cardoso, R. F. Fast detection of drug interaction in Mycobacterium tuberculosis by a checkerboard resazurin method. Tuberculosis. 93 (6), 660-663 (2013).
  17. Peñuelas-Urquides, K., et al. Measuring of Mycobacterium tuberculosis growth: a correlation of the optical measurements with colony forming units. Braz J Microbiol. 44 (1), 287-290 (2013).
  18. Chandramohan, Y., et al. In vitro interaction profiles of the new antitubercular drugs bedaquiline and delamanid with Moxifloxacin against clinical Mycobacterium tuberculosis isolates. J Glob Antimicrob Resist. 19, 348-353 (2019).
  19. Hameed, H. A., et al. Characterization of genetic variants associated with rifampicin resistance level in Mycobacterium tuberculosis clinical isolates collected in Guangzhou Chest Hospital, China. Infect Drug Resist. 15, 5655-5666 (2022).
  20. Lienhardt, C., et al. New drugs for the treatment of tuberculosis: Needs, challenges, promise, and prospects for the future. J Infect Dis. 205, S241-S249 (2012).
  21. Anoopkumar-Dukie, S., et al. Resazurin assay of radiation response in cultured cells. Br J Radiol. 78 (934), 945-947 (2005).
  22. Baker, C. N., Thornsberry, C., Hawkinson, R. W. Inoculum standardization in antimicrobial susceptibility testing: evaluation of overnight agar cultures and the rapid inoculum standardization system. J Clin Microbiol. 17 (3), 450-457 (1983).
  23. McFarland, J. The nephelometer: an instrument for estimating the number of bacteria in suspensions used for calculating the opsonic index and for vaccines. J Am Med Assoc. XLIX (14), 1176(1907).
  24. Bellio, P., Fagnani, L., Nazzicone, L., Celenza, G. New and simplified method for drug combination studies by checkerboard assay. MethodsX. 8, 101543(2021).
  25. Martin, A., Camacho, M., Portaels, F., Palomino, J. C. Resazurin microtiter assay plate testing of Mycobacterium tuberculosis susceptibilities to second-line drugs: Rapid, simple, and inexpensive method. Antimicrob Agents Chemother. 47 (11), 3616-3619 (2003).
  26. Zhao, L., et al. Evaluation of BACTEC MGIT 960 system for the second-line drugs susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis in China. J Microbiol Methods. 91, 212-214 (2012).
  27. Said, H. M., et al. Comparison between the BACTEC MGIT 960 system and the agar proportion method for susceptibility testing of multidrug resistant tuberculosis strains in a high burden setting of South Africa. BMC Infect Dis. 12, 369(2012).
  28. Caviedes, L., Delgado, J., Gilman, R. H. Tetrazolium microplate assay as a rapid and inexpensive colorimetric method for determination of antibiotic susceptibility of Mycobacterium tuberculosis. J Clin Microbiol. 40 (5), 1873-1874 (2002).
  29. Mouton, J. W., Vinks, A. A. Pharmacokinetic/pharmacodynamic modelling of antibacterials in vitro and in vivo using bacterial growth and kill kinetics. Clin Pharmacokinet. 44 (2), 201-210 (2005).
  30. Sychev, A. V., Lavrova, A. I., Dogonadze, M. Z., Postnikov, E. B. Establishing compliance between spectral, colourimetric and photometric indicators in resazurin reduction test. Bioengineering. 10 (8), 962(2023).
  31. Postnikov, E. B., Sychev, A. V., Lavrova, A. I. Dose-response curve in REMA test: Determination from smartphone-based pictures. Analytica. 5 (4), 619-631 (2024).
  32. Mehlawat, N., Chakkumpulakkal Puthan Veettil, T., Sharpin, R., Wood, B. R., Alan, T. Ultrafast and ultrasensitive bacterial detection in biofluids: Leveraging resazurin as a visible and fluorescent spectroscopic marker. Anal Chem. 96 (45), 18002-18010 (2024).
  33. Grosset, J., Truffot-Pernot, C., Lacroix, C., Ji, B. Antagonism between isoniazid and the combination pyrazinamide-rifampin against tuberculosis infection in mice. Antimicrob Agents Chemother. 36 (3), 548-551 (1992).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Видео скоро будет доступно
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.