В данной работе мы представляем протокол проведения внутрикожной инокуляции Mycobacterium avium в ухе мыши в низких дозах для отражения условий, подобных воздействию.
Методическая статья
Внутрикожная инокуляция Mycobacterium avium в ухо мыши
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
В отличие от естественных нетуберкулезных микобактерий (НТМ) или инфекций, патология которых основана на медленно реплицирующемся организме, аэрозольная инфекция на мышиной модели может вызвать повышенное пролиферацию бактериального роста в легких. Хронические аэрозольные и системные инфекции можно лечить антимикобактериальными препаратами, которые также могут отражать предыдущее воздействие, но эти процедуры длительны и менее репрезентативны для естественного воздействия. Целью этого протокола является разработка менее инвазивной мышиной модели состояний, подобных воздействию NTM, которые являются более трансляционными. В данной статье мы описываем метод внутрикожного воздействия на доклинических мышей через ткань уха с использованием Mycobacterium avium (M. avium) для имитации воздействия и обеспечения иммунных реакций на бактерии без явного заболевания. В этой статье мы опишем метод внутрикожной инъекции в ухо и подтвердим наличие устойчивой и локализованной микобактериальной инфекции, что дает дополнительные возможности для исследования иммунных реакций в этой модели in vivo .
Введение
Нетуберкулезные микобактерии (НТМ) представляют собой расширяющийся список видов, включающих подмножество патогенных бактерий, которые часто трудно поддаются лечению 1,2. NTM может быть обнаружен в источниках окружающей среды, таких как почва, вода и водные аэрозоли 3,4,5. Несмотря на сообщения о тенденциях, свидетельствующих о росте числа инфекций NTM, как группа, они регулярно регистрируются менее чем в 20 штатах США. Лица со специфическими сопутствующими заболеваниями, в том числе лица с муковисцидозом или лица, принимающие иммуносупрессивные препараты, подвергаются повышенному риску продуктивного инфицирования патогенными NTM вида2. Тем не менее, предполагается, что здоровые люди подвергаются повторному и постоянному воздействию NTM из источников окружающей среды, что не приводит к тяжелым или хроническим инфекциям. Существуют некоторые доказательстватого, что воздействие NTM может «обусловливать» общий иммунный ответ на антигены микобактерий при вакцинации8, исходы после контакта с другими микобактериями и диагностическое тестирование9, но на сегодняшний день доклиническое моделирование такого рода воздействия затруднено.
Хронические легочные инфекции10 и методы лечения, которые используются для исследований эффективности вакцин, специфичных для патогенов, не представляют собой относительно безвредных воздействий окружающей среды и, предположительно, различных иммунных реакций. Хронические инфекции, например, могут вызывать серьезные повреждения тканей и распространение болезни10. В последнее время была предпринята попытка восполнить этот пробел в исследованиях, в том числе мышиная модель, обеспечивающая воздействие NTM через питьевую воду, из лаборатории Henao-Tamayo11, где иммунный ответ на это воздействие был подробно изучен. Латентный туберкулез (ТБ) является еще одним заболеванием, вызванным микобактериальной инфекцией, которое было трудно смоделировать на доклинических животных. Лаборатория Кауфмана впервые применила внутрикожные ушные инфекции M. tuberculosis у мышей C57BL/612 и NOS2-/-13 , чтобы имитировать латентную туберкулезную инфекцию, реактивацию и охарактеризовать механизмы гипоксической гранулемы. Nemeth et al. использовали модель внутрикожного уха для имитации предшествующего контакта с M. tuberculosis, характеризуя различные иммунные реакции, чтобы определить, как это влияет напоследующие исходы вызова. Внутрикожная модель уха была успешно описана с использованием 104 колониеобразующих единиц (КОЕ) штаммов M. tuberculosis H37Rv и Erdman, но на сегодняшний день она не была протестирована с использованием изолятов NTM.
Общая цель этого метода заключается в создании воспроизводимой модели НТМ-провокационной провокационной системы, которая ограничивает заболевание, вызванное другими провокационными путями, которые могут быть дополнительно изучены с точки зрения иммунного ответа на воздействие. Воздействие на восприимчивых мышей C57BL/6 высоких доз M. avium в питьевой воде приводит к более инфекционным состояниям, чем при воздействии11. Таким образом, обоснованием для разработки этой методики является предыдущее успешное использование M. tuberculosis в качестве провокационного организма для ушной дермы с относительно более высокой провокационной дозой 12,13,14. В данной работе мы стремились оценить, может ли модель быть успешно адаптирована для изолята M. avium при концентрации бактерий в два раза меньшей, о которой сообщалось ранее: 12,13,14 (10 2 КОЕ). Мы ожидаем, что развитие новых моделей воздействия NTM, а не инфекции, поможет решить нерешенные биологические вопросы о влиянии этого влияния на здоровье и будущую динамику инфекции/вакцинации.
Протокол
Самки C57BL/6 были приобретены в исследовательской лаборатории в возрасте 6-7 недель. Мыши содержались в помещении для животных Детского научно-исследовательского института Сиэтла (SCRI) уровня биобезопасности 2 (BSL-2) в условиях, свободных от патогенов, и обрабатывались в соответствии с экспериментальными протоколами, которые были одобрены Комитетом по институциональному уходу за животными и их использованию (IACUC) SCRI. Все методы были проведены в соответствии с соответствующими руководящими принципами и правилами в отношении благополучия животных. Институт работает по сертификату USDA #91-R-0061 и PHS Assurance #A4337-01. Подробная информация о реактивах и оборудовании, использованных в исследовании, приведена в Таблице материалов.
1. Подготовка бактериальных запасов к посеву
- В шкафу с биологической безопасностью, способствующем работе бактерий, извлеките бутылочку с веществом Mycobacterium avium (ATCC 25291) из хранилища при температуре -80 °C и разморозьте при комнатной температуре.
ПРИМЕЧАНИЕ: Исходные концентрации M. avium определяются заранее, в соответствии с передовой практикой для всех исходных материалов, путем нанесения серийных разведений на агаровые пластины 7H10 и подсчета колониеобразующих единиц (КОЕ). - Используя иглу размером 26 G с тупым наконечником, повторно суспендируйте образец исходного материала, пропуская жидкость вверх и вниз по шприцу объемом 1,0 мл 10 раз или более, чтобы создать однородную суспензию.
- Проверьте концентрацию M. avium путем нанесения 100 мкл последовательных разведений суспензии 1:10 на агаровые пластины 7H10. Инкубируйте планшеты в течение 3 недель при 37 °C и подсчитайте колонии, чтобы убедиться в точности концентрации инокулята.
- Отрегулируйте концентрацию M. avium до предпочтительной дозы, разбавив образец стерильным PBS. Хранить при комнатной температуре до готовности к использованию.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом эксперименте использовалось 102 КОЕ на дозу 10 мкл.
2. Подготовка и обезболивание животных
- Перед введением анестезии подготовьте теплую поверхность, например, грелку, на которой можно держать клетки привитых мышей, стремясь регулировать температуру их тела во время восстановления.
- Вводите мышам коктейль кетамина (100 мг/мл) и ксилазина (20 мг/мл) внутрибрюшинным путем.
- После обезболивания выполните щипцы ног, чтобы убедиться, что мыши достаточно обезболены для проведения процедурных манипуляций.
- Нанесите смазку для глаз с обеих сторон.
3. Платформа для модифицирования и подготовка материалов
- Используйте пенопластовую доску, чтобы создать выступ, на котором мышь может стабилизироваться во время манипуляций.
ПРИМЕЧАНИЕ: Двусторонний скотч поможет удерживать ухо на платформе в плоской ориентации. Клей не должен быть слишком прочным, чтобы сохранить здоровье тканей уха. - Расположите светящуюся лупу для обзора платформы.
- Соберите рядом стерильный шприц Гамильтона и работающий препарат M. avium .
4. Прививка ушной дермы
- Поместите мышь в лежачем положении на вершине выступа таким образом, чтобы ухо можно было расположить на двустороннем скотче.
- Слегка надавите, чтобы прижать ухо к ленте и убедиться, что ухо не будет двигаться.
ПРИМЕЧАНИЕ: Спиртовые салфетки можно использовать на ушах перед инъекцией, чтобы помочь ограничить перекрестное загрязнение и инфекцию кожных комменсалов после инфекции. Однако в пилотных исследованиях таких инфекций не наблюдалось без использования спиртовых салфеток. - Наберите 10 мкл препарата M. avium , содержащего 100 КОЕ, в стерильный шприц Hamilton.
ПРИМЕЧАНИЕ: Взбейте суспензию M. avium перед набором объема 10 μл, чтобы убедиться в ее однородности. - Держите платформу в одной руке, а шприц Hamilton — в другой, следя за тем, чтобы скошенная сторона иглы была направлена вверх (рисунок 1).
- Поместите шприц Hamilton под ушную дерму, слегка надавливая. Убедитесь, что игла не проходит полностью через тонкую ткань уха.
- Как только игла будет на месте, нажимайте на поршень шприца постепенно и медленно.
- Следите за цветом уха во время введения.
ПРИМЕЧАНИЕ: При успешном введении будет наблюдаться непрозрачное возвышение в месте инъекции, похожее на пузырь. - После того, как дозировка будет полностью введена, проверьте ухо мыши и ленту на наличие признаков утечки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если утечка все же происходит, расчетная потерянная доза может быть введена в противоположное ухо. Как минимум, животное должно быть помечено и зарегистрировано как возможное получавшее дозу ниже целевой. - Когда дозировка будет успешной, убедитесь, что мышь помещена обратно в домашнюю клетку, чтобы она подвергалась воздействию теплой поверхности и находилась под наблюдением до тех пор, пока она не придет в себя от анестезии.
5. Оценка бактериальной нагрузки
- Усыпляйте животных в соответствии с протоколами, утвержденными Комитетом по уходу за животными и их использованию.
- В этом случае эвтаназия завершается как минимум двумя методами на одну жертву. Для этой процедуры выбираются два метода: использование асфиксии CO2 и вывих шейки матки.
- Во-первых, удлините трубку, чтобы подать газ CO2 в домашнюю клетку мышей, и вводите газ до тех пор, пока у мышей больше не исчезнет никаких признаков движения. Будьте осторожны и используйте клетку, которая не позволит газу вытекать наружу.
- Далее вывихните шейные позвонки с помощью ручных манипуляций.
- Вскрытие ушей у животных, подвергшихся воздействию M. avium , через четыре недели после контакта (28 дней, что соответствует предыдущим исследованиям12). Рассеките уши 2 мышей с помощью стерильных инструментов. Вставьте уши в конические трубки, содержащие буфер КОЕ (PBS + 0,05% Tween80) и используйте тканевый гомогенизатор для гомогенизации до образования однородной суспензии. Неповрежденные уши также обрабатываются и служат в качестве контрольных.
ПРИМЕЧАНИЕ: Можно использовать любые постконтактные временные точки и органы, представляющие интерес. Для этого эксперимента также были собраны легкие, селезенка, дренирующие лимфатические узлы и органы мозга. - Добавьте 100 мкл гомогената к 700 мкл буфера КОЕ в блоке глубокой лунки в качестве разбавления в 1/8 раза. Повторите по всему блоку, чтобы получилось не менее 5 последовательных разведений. Добавьте 50-100 мкл чистых гомогенатных или серийных разведений (здесь используются разведения от 0 до 5) в трипланшеты с агаром 7H10, равномерно распределите с помощью Т-разбрасывателей и инкубируйте при 37 °C с 5%CO2 в течение 2-3 недель.
- Подсчитайте колониеобразующие единицы (КОЕ) и преобразуйте их в log10 для анализа в программном обеспечении для работы с электронными таблицами.
Результаты
Мы использовали протокол, описанный выше, чтобы определить, может ли быть создана воспроизводимая модель NTM, использующая ушную дерму в качестве пути инфекции или контакта. Уши были собраны у двух животных через 28 дней после испытания, гомогенизированы и покрыты в соответствии с описанием на среде 7H10, селективной к микобактериям. Мы наблюдали, что M. avium сохранялся до 28 дней в ушах, которые были поражены внутрикожно, и отсутствие M. avium в неповрежденном ухе (рис. 2).
В то время как мы не наблюдали диссеминации в ухо через 28 дней после инфекции, другие исследователи, использующие эту модель ушной дермы для моделирования латентного туберкулеза, наблюдали диссемицию в другие дистальные участки органов14. Мы предположили, что более низкая доза провокационной дозы и использование изолята M. avium может снизить распространение в более поздние временные точки, которые могут лучше отражать воздействие по сравнению с хронической инфекцией. Таким образом, эвтаназия была проведена когортам из n=5 мышей, пораженных M. avium , через 28, 56, 90 и 132 дня после заражения. Следующие органы были гомогенизированы по тому же протоколу, что и для тканей уха: легкое, селезенка, дренирующий лимфатический узел (DLN) и мозг. Этот путь заражения приводил к спорадическому распространению с течением времени, когда менее половины животных демонстрировали счетные КОЕ в органах, протестированных через 56 или 90 дней после заражения (Таблица 1). Через 132 дня после заражения у всех мышей в селезенке обнаруживался M. avium (n = 5/5 оцениваемых животных), но, по-видимому, в других органах к этому моменту было минимально (n = 1/5 в DLN) или вообще не было (n = 0/5 в легких или мозге) бактерий (табл. 1).
Рисунок 1: Ориентация иглы скошенной стороной вверх. Перед введением иглы сторона скоса должна быть обращена вверх для правильного введения инокулюма. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 2: Колонизация ушной ткани M. avium через 28 дней после провокации. Самкам мышей C57BL/6 вводили в ухо 102 КОЕ Mycobacterium avium. Проблемное ухо (+) сравнивали с неоспоренным ухом (-) через 28 дней, n=2 отдельных животных из одного эксперимента, причем каждое животное имело свой цвет и символ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
| Время (сутки) | Лог органа10 КОЕ | |||
| Легкое | Селезенка | DLN | Мозг | |
| 28 | 3.08, НД, НД, НД, НД | 2.81, НД, НД, НД, НД | НД, НД, НД, НД, НД | 0.78, 0.90, НД, НД, НД |
| 56 | 2.30, НД, НД, НД, НД | 1.53, 3.43, НД, НД, НД | 2.78, НД, НД, НД, НД | 1.20, НД, НД, НД, НД |
| 90 | НД, НД, НД, НД, НД | 0,60, 3,35, 3,26, НД, НД | НД, НД, НД, НД, НД | 0,60, НД, НД, НД, НД |
| 132 | НД, НД, НД, НД, НД | 4.03, 3.58, 3.58, 4.03, 3.69 | 2.41, НД, НД, НД, НД | НД, НД, НД, НД, НД |
| DLN = дренируемый лимфатический узел, ND = не обнаружен | ||||
Таблица 1: Распространение M. avium из уха с течением времени после заражения. Легкие, селезенка, дренирующий лимфатический узел (DLN) и мозг были собраны у n=5 мышей в определенный момент времени после заражения. Гомогенизированные ткани были покрыты и оценены на предмет роста бактерий. КОЕ органа представлен в виде log10 преобразованных значений, где бактерии были подсчитаны и не обнаружены (ND), где не наблюдалось КОЕ при любой концентрации в пластинчатом покрытии. Данные о временном ходе, репрезентативные для одного эксперимента.
Обсуждение
Здесь мы продемонстрировали, как воспроизводимо воздействовать на мышей микобактериями в модели внутрикожного уха. При выполнении этой процедуры очень важно соблюдать меры предосторожности стерильности и не допускать травм от уколов иглой. При использовании этого метода инокуляции крайне важно иметь правильную станцию настройки и хорошее освещение, чтобы гарантировать, что пространство дермы будет целенаправленным и не будет полностью проколото через ухо. Если это произойдет, в зависимости от исследования, может быть предпринята вторая попытка в другом ухе. Необработанные уши в пределах одной мыши также можно использовать в качестве управления для каждой мыши. Этот метод должен быть доступен исследователям с минимальными потребностями в оборудовании или времени. Выделение мышей и время для обучения помогает снизить вероятность успешности прививки в соответствии с протоколом. Наиболее распространенными ошибками при использовании этой техники являются непопадание шприца во внутрикожное пространство (и прокол через ухо) или слишком быстрое нажатие на шприц, вызывающее непоследовательную доставку или соскальзывание иглы из внутрикожного пространства. Хорошее освещение и увеличение могут помочь с правильным позиционированием иглы для прививки.
Мы используем методологию для «подверженных» условий NTM. Подавляющее большинство M. avium содержится в ухе или DLN. Тем не менее, ограничением этой методологии является то, что диссеминации в системные органы, а именно в селезенку, наблюдалась у всех животных, оцененных через 132 дня после заражения. Может существовать порог бактериального посева, который может снизить количество или частоту диссеминации, что может быть достигнуто с помощью исследования титрования. Эта процедура поддается модификации как организма, например, других видов НТМ, так и вводимой дозы, в зависимости от предмета исследования.
Поведение человека (отсутствие надлежащей очистки питьевой воды, загрязнение окружающей среды, курение), увеличение числа людей с ухудшающимся здоровьем в возрасте15 лет и другими сопутствующими заболеваниями, отсутствие надлежащих диагностических тестов и изменениеклимата16 могут играть роль в росте числа инфекций NTM, и эта тенденция, вероятно, усилится в ближайшем будущем. Мы предполагаем, что такие модели, как доставка слизистой оболочки черезпитьевую воду 11 или внутрикожные ушные инфекции с NTM у мышей, дают возможность определить, какое влияние это растущее воздействие окажет на последующую вакцинацию и эффективность вакцины. Несмотря на то, что мы адаптировали эту методологию модели локализованного уха для M. avium, мы предполагаем, что она может быть успешно использована для других видов NTM в качестве метода воздействия.
Раскрытие информации
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Благодарности
Авторы выражают благодарность преданным своему делу сотрудникам вивария за исключительную заботу о животных на протяжении всего исследования. Авторы также хотели бы поблагодарить лабораторию Хенао-Тамайо в Университете штата Колорадо за то, что они поделились штаммом M. avium , использованным в этом исследовании. Авторы хотели бы поблагодарить сотрудников лабораторий Адерем и Урдал в Детском научно-исследовательском институте Сиэтла за обучение по оригинальной методологии. Этот проект был полностью или частично профинансирован за счет федеральных средств Национального института аллергии и инфекционных заболеваний, Национальных институтов здравоохранения, Департамента здравоохранения и социальных служб в соответствии с контрактом No 75N93021C00029 (для RNC) и грантов R01AI125160 и R01AI183642 (для RNC и SLB).
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 0,05% Tween80 | Sigma | P6224 | |
| 1 мл шприц | Fisher | 15-823-434 | |
| 7H10 агар триплейные пластины | Moltox | 21-40S234 | |
| 26G тупой иглой | Fisher | NC0981254 | |
| Шкаф биобезопасности | Nuaire | NU-543-400 | |
| CO2 инкубатор | Fisher Scientific | 15-103-0513 | |
| Двухсторонняя лента | Скотч | 3136 | |
| Шприц Hamilton 701N микролитр | Fisher | 14-824-16 | |
| Твердая ткань омни наконечники | Fisher | 15-340-102 | |
| Грелка | Kent Scientific | HTP-1500 | |
| Игла для инсулина | Fisher | NC1551333 | |
| кетамин | Patterson Veterinary | 07-890-8598 | |
| Лупа с подсветкой | Brightech | B07MMZ27QK | |
| PBS | ThermoFisher | 10010072 | |
| Гомогенизатор тканей | Omni | TH115 | |
| Подставка для гомогенизатора | тканей Omni | S1000 | |
| Xylazine | Patterson Veterinary | 07-808-1947 |
Ссылки
- Abdelaal, H. F. M., et al. Mycobacterium abscessus: It's Complex. Microorganisms. 10 (7), (2022).
- Baldwin, S. L., et al. The complexities and challenges of preventing and treating nontuberculous mycobacterial diseases. PLoS Negl Trop Dis. 13 (2), p. e0007083(2019).
- Falkinham, J. O. 3rd Environmental sources of nontuberculous mycobacteria. Clin Chest Med. 36 (1), 35-41 (2015).
- Honda, J. R. Environmental sources and transmission of nontuberculous mycobacteria. Clin Chest Med. 44 (4), 661-674 (2023).
- Pfaller, S., et al. Occurrence revisited: Mycobacterium avium and Mycobacterium intracellulare in potable water in the USA. Appl Microbiol Biotechnol. 106 (7), 2715-2727 (2022).
- Mercaldo, R. A., et al. Environmental risk of nontuberculous mycobacterial infection: Strategies for advancing methodology. Tuberculosis (Edinb). 139, 102305(2023).
- Marshall, J. E., et al. Nontuberculous mycobacteria testing and culture positivity in the United States. BMC Infect Dis. 24 (1), 288(2024).
- Ghasemi, F., et al. Effects of non-tuberculous mycobacteria on BCG vaccine efficacy: A narrative review. J Clin Tuberc Other Mycobact Dis. 36, 00451(2024).
- Njagi, L. N., et al. Attenuated tuberculin skin test responses associated with Mycobacterium intracellulare sputum colonization in an adolescent TB prevalence survey in Western Kenya. Tuberculosis (Edinb). 147, 102514(2024).
- Larsen, S. E., et al. Subunit vaccine protects against a clinical isolate of Mycobacterium avium in wild type and immunocompromised mouse models. Scientific Reports. 11 (1), 9040-9040 (2021).
- Dutt, T. S., et al. Mucosal exposure to non-tuberculous mycobacteria elicits B cell-mediated immunity against pulmonary tuberculosis. Cell Rep. 41 (11), 111783(2022).
- Kupz, A., et al. A Mouse Model of Latent Tuberculosis Infection to Study Intervention Strategies to Prevent Reactivation. PLoS One. 11 (7), e0158849(2016).
- Reece, S. T., et al. Serine protease activity contributes to control of Mycobacterium tuberculosis in hypoxic lung granulomas in mice. J Clin Invest. 120 (9), 3365-3376 (2010).
- Nemeth, J., et al. Contained Mycobacterium tuberculosis infection induces concomitant and heterologous protection. PLoS Pathogens. 16 (7), e1008655(2020).
- Jarchow-MacDonald, A., et al. Changing Incidence and Characteristics of Nontuberculous Mycobacterial Infections in Scotland and Comparison With Mycobacterium tuberculosis Complex Incidence (2011 to 2019). Open Forum Infect Dis. 10 (1), ofac665(2023).
- Thomson, R. M., et al. Influence of climate variables on the rising incidence of nontuberculous mycobacterial (NTM) infections in Queensland, Australia 2001-2016. Sci Total Environ. 740, 139796(2020).
Перепечатки и разрешения
