Усовершенствованная методика доставки жидкости в легкое мыши: интубация с помощью потребительского отоскопа

Краткое содержание

Этот протокол показывает, как оптимальное позиционирование мыши и трансоральное введение отоскопа на основе камеры обеспечивает визуализацию голосовой щели, быструю интубацию с минимальной травматизацией тканей и стабильную доставку жидкости в легкие.

Аннотация

Последовательная доставка жидкостей, в том числе потенциальных методов лечения, в легкие имеет решающее значение для моделирования легочных заболеваний и доклинического терапевтического развития. Тем не менее, современные методы, используемые у мышей, такие как аспирация ротоглотки методом вытягивания языка, могут привести к вариабельной доставке. В этой статье мы опишем использование доступного отоскопа с подсветкой, подключенного к мобильному телефону, для визуализации голосовой щели и обеспечения прямой инокуляции в дыхательные пути. Мы подробно описываем оптимизированную технику постановки с адекватным освещением и средствами позиционирования. Также описывается, как можно надежно провести интубацию с помощью гибкого катетера 20 G с волоконно-оптическим светом или без него. Этот метод значительно снижает вариабельность внутрилегочной доставки и увеличивает объем доставляемой жидкости, достигающей легких. Из-за уменьшенной вариативности, при использовании этого метода можно использовать меньшие размеры когорты животных вместо закапывания ротоглотки методом вытягивания языка. Ниже приведен метод эффективной, быстрой и последовательной интубации мышей и доставки в легкие, включая надежное подтверждение установки эндотрахеальной трубки. Благодаря этой усовершенствованной методологии последовательная, безопасная интубация и воспроизводимая, эффективная доставка в легкие находятся в пределах досягаемости.

Введение

Во всем мире респираторные заболевания являются основной причиной смерти детей в возрасте до 5 лет и одной из основных причин заболеваемости и смертности среди взрослых¹. В 2021 году инфекция SARS-CoV2 была третьей по значимости причиной смерти в США². Мышиные модели часто используются для изучения заболеваний легких, включая астму, пневмонию, хроническое навязчивое заболевание легких и фиброз легких. Почти все эти модели требуют доставки жидких агентов в легкие. Это может быть сделано путем прямой канюляции трахеи (обычно под прямой визуализацией с использованием хирургической техники разрезания), интраназального родоразрешения или орофарингеальной аспирации с помощью хорошо зарекомендовавшего себя метода вытягивания языка ^3,4,5. Однако все эти методы имеют недостатки. Образование рубцовой ткани после хирургической техники разрезания делает ее неподходящей для исследований, требующих повторного введения агентов в легкое, а последние два метода могут привести к вариабельной доставке в легкие. Кроме того, при использовании метода вытягивания языка может быть выражена травма тканей языка, а эффективность доставки зависит от исследователя, выполняющего процедуру, см. рисунок 1.

Рисунок 1: Управляемая интубация и инстилляция ИТ приводят к улучшению доставки в легкие и меньшей вариабельности по сравнению с вытягиванием языка. (А) Три разных исследователя вводили 50 мкл разбавленных индийских чернил методом вытягивания языка, установленным методом введения орофарингеального (ОП). Два исследователя также доставляли чернила в легкое с помощью интубации, как описано. (Б) Легкие были удалены через 1-4 ч после родов и сфотографированы с 2-кратным увеличением. Фотографии оценивали на предмет окрашенной области с помощью ImageJ. (n=6 (интубация) или 9 (операционное введение), результаты 2 или 3 независимых повторений 2-3 разными исследователями, p<0,0001 Т-критерия Уэлча) (C) Вариабельность введения в легкие также рассчитывалась как процентное отклонение от среднего значения. Администрирование ОП было гораздо более вариативным. (p = 0.0317, t-критерий Уэлша, GraphPad Prism 10.2.3 вся статистика и построение графиков) (Использовались мыши-самцы и самки C57BL/6J, им было ~10 недель.) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Анатомия мышей делает интубацию сложной и трудоемкой. Рот маленький, и щечная ткань может мешать исследователю видеть rima glottidis⁶. Кроме того, голосовые складки очень маленькие, и их может быть сложно рассмотреть, так как они лежат близко к основанию языка. Наконец, подтверждение правильного расположения эндотрахеальной трубки затруднено, так как небольшой дыхательный объем часто не позволяет запотеть зеркало⁷. Эти трудности послужили толчком к внедрению ряда инновационных методов интубации мышей. Эти усовершенствованные методы включают использование неонатального ларингоскопа и провода для введения катетера в трахею ^8,9, использование волоконно-оптического источника света для направления и усиления катетера^10,11, а также использование^{видеопотока} в реальном времени6. В последнее время использование клинического отоскопа помогло в оротрахеальной интубации¹². Другие использовали трансиллюминацию для визуализации голосовой щели и интубировали мышей ^7,13,14. Однако у этих методов есть много недостатков. Использование средств для депиляции на шее мыши и близость животного к горячему источнику света делают трансиллюминацию далеко не идеальным подходом. Использование иглы внутри катетера или введение острых инструментов в рот означает, что некоторые методы укрепления катетера подвергают животных чрезмерному риску. Наконец, разрез над трахеей для подтверждения размещения имеет значительные недостатки, включая необходимость стерильности и накопление рубцовой ткани. На данный момент интратрахеальная инстилляция путем интубации оказалась слишком сложной для широкого^{внедрения15}, а достижения в области методологии оставались разрозненными и неиспользованными во многих лабораториях15. Дальнейшие исследования были сосредоточены на выборе анестетика во время родов, обнаружив, что кетамин может иметь преимущества по сравнению с изофлураном⁵. Тем не менее, изофлуран, не являясь контролируемым веществом и быстро исчезая после завершения процедуры, обладает привлекательными преимуществами, поэтому мы использовали эту форму анестезии, оптимизируя другие аспекты этой методологии^16,17.

Метод, который мы описываем, преодолевает проблемы визуализации, которые пытались решить другие, снижает риски для экспериментальных животных, сокращает время, необходимое для внутритрахеального введения небольших объемов через эндотрахеальную трубку, увеличивает объем жидкости, достигающей легких, и предлагает улучшенный метод подтверждения установки эндотрахеальной трубки. Использование подставки для подвешивания, магнитных рук помощи (зажимы из кожи аллигатора на гибких руках, закрепленных на основании) и более яркого освещения позволяет отдельному исследователю эффективно проводить интратрахеальную доставку. Визуализация упрощается с помощью «домашнего» отоскопа с возможностью подключения к WIFI. Этот аппарат более доступен по цене, чем коммерческие инструменты для интубации. Кроме того, подключение к Wi-Fi позволяет одновременно транслировать видео на портативное устройство (например, мобильный телефон), что делает его подходящим для тренировок. Для интубации может использоваться либо волоконно-оптический источник света, продетый через гибкий катетер (ПТФЭ) размером 20 г x 1 дюйм (с удаленной иглой), либо катетер без света. Глубина контролируется двумя методами – добавлением интубационного предохранительного клина (конического ограждения на катетере) и наблюдением за глубиной в видеопотоке. Установка эндотрахеальной трубки подтверждается с использованием «пузырькового метода» для более четкой визуализации дыхательного объема по сравнению с традиционным методом зеркального тумана¹⁸. Это менее стрессово для животного, чем использование обструкции трахеи для изменения императивных позывов к дыханию¹⁰ для подтверждения размещения. Комбинированное использование удлинительной трубки, соединенной с катетером, для подтверждения успешной интубации (далее именуемое пузырьковым методом), упрощенное от Watanabe et. ⁷, а потребительский видеоотоскоп за одну процедуру делает интубацию практичным методом терапевтической доставки в легкие и явным улучшением метода вытягивания языка (см. Рисунок 1). Если вы ищете надежный, последовательный и доступный метод нехирургической доставки жидкости в легкие мыши, особенно без использования контролируемых веществ (например, кетамина) или дорогостоящего оборудования, следующий метод может быть идеальным.

Протокол

Крайне важно, чтобы эти процедуры были рассмотрены и одобрены институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC), указанным в протоколе, а перед началом работы были проведены консультации с ветеринарным персоналом. IACUC в нашем учреждении утвердил протокол до начала эксперимента и рассмотрел видеоконтент перед отправкой. Поддержка и обучение были получены через отделение сравнительной медицины Тулейна, чтобы обеспечить высочайший стандарт ухода за всеми нашими лабораторными животными.

1. Настройка

ПРИМЕЧАНИЕ: Настройка приведена на рисунке 2 .

Рисунок 2: Станция, используемая для управляемой интубации, подготовлена, как показано на рисунке. Слева направо: пипетки для доставки, пузырьковая трубка для подтверждения правильного размещения эндотрахеальной трубки, щипцы, шпатель, педиатрическое носовое зеркало (обсуждается, но не требуется для этой процедуры), вспомогательные руки, увеличительный свет, подставка для мыши с носовым конусом, волоконно-оптический зонд, индукционная камера для анестезии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

1. Очистите предохранительный клин, входящий в комплект для интубации, с помощью прокладки для подготовки изопропанола. Наденьте чистый предохранительный клин (зеленый цвет на видео) на гибкую канюлю весом 20 г и безопасно выбросьте прилагаемую иглу.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используемый комплект для интубации грызунов (Таблица материалов) включает в себя предохранительные клинья для интубации. Это небольшие конические рукава, которые помещаются на гибком катеттере размером 20 г x 1 дюйм. Они предотвращают повреждение катетера килем.
2. Соберите другие необходимые инструменты, в том числе мобильный телефон, коммерческий отоскоп, подставку для мыши с носовым конусом, мелко зазубренные щипцы, подготовленную эндотрахеальную трубку (из 1.1) и оптоволоконный светильник, если вы его используете. Перед использованием очистите все это с помощью прокладок для подготовки изопропанола.
3. Возьмите примерно 20 см гибкой трубки. Согните его в форме буквы U, добавьте соединение с замком Люэра на одном конце и закрепите его стяжкой. Добавьте в тюбик 200-300 μЛ стерильной фильтрованной воды или индийских чернил. В дальнейшем эта сборка называется «пузырьковой трубкой».
4. Сделайте шовную петлю, завязав ~13 см плетеного шелкового шовного материала размера 0 по кругу. Поместите эту петлю в верхнюю часть подставки и убедитесь, что обе стороны шва закреплены, а подставка чистая. Поместите подставку для мыши на металлическую лупу. Расположите помогающие руки вокруг того места, где будет рот мыши.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Многие поставщики делают сменные стенды (см. Таблицу материалов), и один из них может быть изготовлен в лаборатории дешево ^4,7,14. Для подвешивания животного использовался шовный материал из плетеного шелка размера 0. Однако использование других материалов для той же цели было описано ^4,13.
5. Поместите мышь в индукционную камеру для анестезии. Используйте постоянный расход O₂ при 0,8 л/мин и 2% изофлуране. Обезболите животное в достаточной степени (см. примечание), чтобы оно не проснулось во время установки носового конуса. Не стоит значительно подавлять частоту дыхания мыши. Регулярное дыхание помогает оценить голосовые складки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Частота дыхания мыши должна быть нормальной. Этот критерий используется для установления подходящей глубины анестезии. Этот показатель может варьироваться у разных животных и может превышать 200 вдохов/мин. Таким образом, нецелесообразно или нецелесообразно подсчитывать дыхание или использовать щипки для пальцев ног.
   ВНИМАНИЕ: При необходимости эту процедуру можно прервать. Однако животные не должны оставаться в индукционной камере дольше, чем это строго необходимо.
6. Подключите отоскоп к мобильному телефону и убедитесь в стабильности видеопотока.
   ВНИМАНИЕ: Чтобы свести к минимуму воздействие изофлурана на исследователей во время этой процедуры, используйте химический респиратор при выполнении нескольких интубаций или обучении этому методу. Как вариант, можно провести процедуру в вытяжном шкафу.

2. Постановка на животных

1. Как только первое животное уснет, выньте его из индукционной камеры, загривкате, а его верхние зубы расположите по длине шва. Слегка натяните животное, чтобы сохранить положение шва, положив мышь обратно на подставку.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В среднем, животные находятся под наркозом в течение 2 минут, включая индукцию. Это значительно снижает риск для животного, устраняет необходимость в офтальмологической смазке и предотвращает накопление слюны. Работайте над тем, чтобы держать животных под действием седативных препаратов как можно меньшее время.
2. Отрегулируйте угол горловины немного назад (поместив горловину в незначительное расширение, 5°-15°). Аккуратно надавите носовым конусом на ноздри. Не стоит сильно давить на конус вниз, так как он может мешать наложению шва, подвешивая мышь.
3. Крепко обхватите язык как можно ближе к нижней губе, используя большие, мелко зазубренные щипцы. Потяните его вниз и в сторону от верхних зубов к одной стороне нижних зубов.
   ВНИМАНИЕ: Длительное вытяжение, чрезмерное напряжение или раздавливание языка могут поставить под угрозу здоровье животных. Пожалуйста, следите за языком на наличие признаков травмы (синяков, кровотечений, отека или высыхания) и, если это наблюдается, прервите процедуру и предупредите ветеринарный персонал.
4. Если вы используете помогающие руки, опорите щипцы в этом положении. В зависимости от опыта и остроты зрения исследователя, увеличительное стекло с подсветкой может помочь правильно расположить животное.
5. Подайте волоконно-оптический фонарь (если используется) через гибкий катетер с установленным предохранительным клином для интубации (зеленый цвет на видео).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не прикрепляйте оптоволоконный кабель к источнику света слишком плотно. Слишком сильное нажатие затрудняет удаление света, при этом эндотрахеальная трубка остается на месте.

3. Визуальная оценка голосовых связок и интубация

1. Держа отоскоп в недоминантной руке, слегка надавите им на язык. Затем наклоните камеру и ее источник света, чтобы визуализировать голосовые связки у основания языка.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Незначительные различия в анатомии и цвете тканей могут затруднить ориентацию. Используйте движения, связанные с дыханием, для подтверждения структурной идентификации.
2. При включенном волоконно-оптическом свете (если вы используете) подайте канюлю вдоль верхней части отоскопа, слегка касаясь основания языка или губной части отоскопа для справки. Протолкните его в рот мыши между мягкой поддоной и выступом отоскопа.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если волоконно-оптический свет не используется, на этом этапе к катетеру можно прикрепить «пузырьковую трубку», описанную в шаге 4. Яркое, сфокусированное освещение во рту мыши необходимо для этой модификации процедуры.
3. Отрегулируйте угол входа так, чтобы катетер был очень неглубоким. Сразу после введения катетера (менее чем на 1 мм за голосовыми складками) поднимите кончик катетера так, чтобы он был почти параллелен столешнице. Это предотвращает выталкивание надгортанника дорсально в пищевод. Особенно во время тренировок, когда возникают трудности или в начале опыта, использование видеопотока неоценимо для размещения эндотрахеальной трубки между голосовыми складками.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Выработка слюны не препятствует просмотру голосовых складок во время выполнения этой процедуры. Тем не менее, использование ватного аппликатора с наконечником копья для удаления обструктивной слюны описано в предыдущих публикациях при интубации крыс¹⁹. Этот метод может оказаться полезным, если слюна становится проблемой.
   1. При возникновении сопротивления немедленно извлеките катетер и дайте дыханию нормализоваться. Если наблюдается кровотечение, обратитесь к ветеринарному персоналу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При продвижении катетера практически не должно быть сопротивления.

4. Подтверждение установки эндотрахеальной трубки

1. Визуально подтвердить, что эндотрахеальная трубка находится в правильном месте с помощью отоскопа. Кроме того, обеспечьте правильное размещение трубки, учитывая, что трахея оказывает меньшее сопротивление во время установки, чем пищевод. Обратите внимание, что в соответствующем положении эндотрахеальная трубка находится на ~5 мм за голосовыми складками. Ищите свет от волоконно-оптического источника, проходящий через кожу шеи, чтобы еще раз убедиться в правильности размещения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Предохранительный клин для интубации должен предотвращать слишком сильное введение эндотрахеальной трубки. Предохранительный клин предотвращает травмирование киля; Тем не менее, это не должно препятствовать продвижению. Его следует использовать в качестве меры безопасности, и оптимальная глубина часто меньше, чем допускается клином.
2. Затем, удерживая эндотрахеальную трубку на месте, снимите волоконно-оптический свет. Обеспечьте правильное размещение катетера с помощью «пузырькового метода» (подробно описано ниже), а не зеркального запотевания.
3. Извлеките пузырьковую трубку, подготовленную на шаге 1.3. Приготовьте его заранее перед процедурой и повторно используйте для всех животных.
   ВНИМАНИЕ: 200-300 μЛ воды или чернил в пузырьковой трубке никогда не следует отсасывать. Чтобы этого избежать, убедитесь, что жидкость находится далеко от замка Люэра.
4. Установив эндотрахеальную трубку, закрепите пузырьковую трубку на месте с помощью замка Люэра. Приливный объем должен быть сразу очевиден. В противном случае эндотрахеальная трубка находится на неправильном месте. Быстро удалите его и дайте мышке вернуться к нормальной частоте дыхания.
   ВНИМАНИЕ: Неправильное размещение катетера в пищеводе приведет к сдавливанию трахеи, что препятствует достаточному дыханию. Неправильное смещение часто сопровождается затрудненным дыханием (в том числе заметным вкладом межреберных мышц) и/или резким снижением частоты дыхания. Кроме того, канулирование пищевода может привести к мышечному спазму, что затрудняет последующую интубацию; По этой причине мы рекомендуем использовать несколько животных во время тренировок.

5. Интратрахеальное введение

ВНИМАНИЕ: Как и метод вытягивания языка для родов из ротоглотки, доставка через интубацию может привести к утоплению животного. У мышей-подростков и взрослых мышей 50 мкл является в целом безопасным объемом жидкости для доставки и достаточным для распространения по всем легким.

1. Если для введения используется шприц: Отсоедините пузырьковую трубку и замок Люэра от катетера, прикрепите заряженный шприц со скольжением Люэра и нажмите на поршень, чтобы получить желаемый объем (максимум 50 мкл).
2. При использовании пипетки для введения: Введите пипетку нужного объема (максимум 50 мкл) непосредственно в катетер и дайте мыши вдохнуть раствор.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если вы тренируетесь, рассмотрите возможность использования индикатора, такого как разбавленные, отфильтрованные индийские чернила или метиленовый синий.
3. Чтобы обеспечить диффузную доставку в легкие, промывайте доставленную жидкость в легкие до 500 μл^{воздуха20}. Это можно сделать либо с помощью предварительно загруженного шприца с замком Люэра объемом 0,5 мл, либо с помощью пипетки P1000 с фильтрующим наконечником, оба из которых доказали свою надежность. При желании можно провести многократное углубление дозатора без риска отрицательной аспирации подаваемой жидкости.
   ВНИМАНИЕ: При инокуляции животного с использованием этого метода рассмотрите возможность снижения концентрации инокулюма из-за повышения эффективности доставки по сравнению с орофарингеальной аспирацией или интраназальной доставкой.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При промывке посевного материала воздухом может потребоваться использование объема, превышающего дыхательный объем (~200 μл). Тем не менее, использование 500 мкл не сопряжено с риском развития баротравмы, так как это составляет лишь около половины жизненной емкости²¹. Взрослые мыши имеют резервную емкость вдоха около ~800 μл, поэтому даже если мышь вдохнула непосредственно перед полунжением, баротравма^{не возникает}. Подумайте, могут ли меньшие объемы продувки воздуха удовлетворить ваши потребности в распределении инокулюма (рекомендуется 100-200 мкл).

6. Оценка доставки

ПРИМЕЧАНИЕ: Это делается только в том случае, если вы тренируетесь или практикуете процедуру.

1. Гуманно усыпьте животное в соответствии с утвержденным протоколом IACUC. В качестве основного метода эвтаназии применялись асфиксия_СО2 в качестве основного метода эвтаназии и вывих шейки матки в качестве подтверждающего метода эвтаназии.
2. Откройте грудную стенку и удалите легкие. Для этого откройте брюшину, получив доступ к диафрагме с каудальной стороны и проткнув ее маленькими ножницами там, где можно увидеть сердце. Это приведет к втягиванию легких и даст больше места для открытия грудной полости путем разрезания ребер.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если требуется перфузия для уменьшения притока крови в легкие, на этом этапе выполняйте процедуру через правый желудочек сердца.
3. После удаления коротко промойте легкие 1 мл стерильного PBS. Положите их на белую поверхность (как хирургическая губка), чтобы обнажить максимальную площадь, сохраняя при этом относительное положение лепестков.
4. Сфотографируйте легкие ex vivo (мы использовали мобильный телефон), откройте изображения в ImageJ и количественно оцените окрашенные и неокрашенные участки, обводя контур фронта красителя. Количественно оцените площадь окрашивания с помощью независимого слепого исследователя, чтобы избежать систематической ошибки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании люминесценции и IVIS, как показано на рисунке 3, визуализация in vivo в реальном времени должна быть проведена вместо Шага 6.

Результаты

Как видно на рисунках 1 и 3, внутрилегочная инокуляция с использованием традиционного метода вытягивания языка (доставка через ротоглотку) привела к неравномерному распределению чернил и большей вариабельности между исследователями. Напротив, инстилляция ИТ после интубации приводила к более стабильной доставке как в правое, так и в левое легкие и была менее вариабельной (Рисунки 1C и Рисунок 3D). В легких животных, которым вводили чернила с помощью орофарингеальной аспирации с использованием вытягивания языка, чернила являются тонкими и присутствуют только вблизи крупных дыхательных путей животных (рис. 1А). Напротив, когда для доставки чернил использовалась управляемая интубация, они распространялись гораздо дальше в ткани, отмечая гораздо большую площадь легких. Когда площадь поверхности легкого, окрашенная чернилами, сравнивали между методами, метод интубации оказался значительно превосходящим метод вытягивания языка (рис. 1B). Вариабельность подачи чернил также была значительно ниже в условиях интубации (Рисунок 1C). Увеличенная площадь окрашенных легких и меньшая вариабельность количества жидкости, достигающей легких, убедительно свидетельствуют о том, что доставка ИТ превосходит вытягивание языка.

Как видно на видео 1, традиционные эндоскопы (в том виде, в котором они были опубликованы ранее) имеют слишком большое фокусное расстояние, чтобы оценить голосовые складки и направить расположение эндотрахеальной трубки ^6,19. Напротив, видеоизображения, сделанные с помощью потребительского отоскопа (рис. S1 и временные метки: 6:34 и 7:05 на видео), имели гораздо лучшее разрешение, что привело к улучшению визуализации голосовой щели.

Этот метод интубации включает в себя многократные проверки размещения трубки в трахее. Дыхательный объем мыши был легко заметен при использовании пузырькового метода (Рисунок S2 и временная метка: 8:25) и действует как окончательная гарантия того, что любая доставленная жидкость попадет в легкие.

Для дальнейшей оценки различий между двумя методами доставки мы оценили экспрессию трансгенов в легочной ткани после того, как мышам была введена 1 x 10¹¹ vg AAV6.2-люциферазы с использованием двух различных методов (инстилляция ротоглотки методом вытягивания языка или внутритрахеальная доставка после управляемой интубации). Через семь дней после введения вектора были проведены измерения люминесценции с помощью системы визуализации in vivo (IVIS) (Рисунок 3A). Затем мы рассчитали среднее излучение в обоих легких. За 10 минут до визуализации (30 с экспозиции) им вводили (подкожно) 200 мкл люциферина (15 мг/мл). Как показано на рисунке 3B, животные, получавшие вектор путем инстилляции ротоглотки, имели люминесцентный сигнал, который был широко распространен как в грудной клетке, так и в носовой области. Напротив, у животных, получавших вектор путем интратрахеальной доставки с использованием управляемой интубации, наблюдалась концентрированная люминесценция в легких. Среднее излучение у интубированных животных было значительно больше по сравнению с орофарингеальным доставкой, что указывает на повышение эффективности доставки вектора в легкие и снижение вариабельности доставки, рассчитанной с использованием разницы со средним значением (Рисунок 3C и Рисунок 3D).

Положительными результатами метода интубации были воспроизводимые инстилляции объемом до 50 мкл в легкие мыши (выполненная на рисунке 1 и рисунке 3) с диффузным распределением по всему легкому (как показано на рисунке 1), а не в других областях (например, верхние дыхательные пути/нос, как показано на рисунке 3).

Любой вред, причиненный животному, чрезмерный стресс, уменьшение объема жидкости, достигающей легких, плохое распределение инокулюма в легких или длительные потребности в тренировках могли бы представлять собой негативный результат, но не происходили.

Видео 1: Традиционное эндоскопическое изображение ротоглотки и голосовых складок мыши не в фокусе и его трудно эффективно использовать. Фокусное расстояние этого эндоскопа 3 см означает, что голосовые складки и ориентацию трудно оценить. Язычок внизу слева. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать это видео.

Рисунок 3: Интубация обеспечивает большую доставку в легкие с меньшей вариабельностью по сравнению с аспирацией ОП .(A) Мышам BALB/c в возрасте 6-10 недель вводили 1x10¹¹ vg AAV6.2-Luciferase (Penn Vector Core), а затем оценивали с помощью биолюминесцентной визуализации in vivo (IVIS) через 7 дней. За 10 минут до визуализации (экспозиция 30 с) им вводили (подкожно) 200 мкл люциферина (GoldBio, 15 мг/мл). (Создано с biorender.com) (B) Репрезентативные изображения IVIS мышей, получающих AAV6.2-люциферазу с помощью OP-аспирации (вытягивание языка, слева) или IT-доставки (интубация, справа). Области интереса имеют одинаковый размер, а среднее излучение в пределах области показано на изображении. (C) Количественная оценка сигнала люциферазы у мышей с аспирацией OP (n=7) и интубационной (n=5). p<0,0001 с помощью непарного t-критерия Уэлша с последующим логарифмическим преобразованием исходных данных люциферазы. (D) Отклонение от среднего значения в процентах от среднего среднего излучения. (p=0,0381, Т-критерий Уэлша) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок S1: Показаны примеры изображений с потребительского отоскопа, используемого в описанном протоколе для управляемой интубации (слева) и эндоскопа аналогичной стоимости и доступности (справа). Обратите внимание на явные различия в фокусе между изображениями. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Рисунок S2: Пример изображения, показывающий использование пузырьковой трубки. Приливный объем быстро перемещает каплю в пузырьковой трубке на несколько сантиметров. Капля движется очень мало, если трубка находится в пищеводе. С помощью этого метода можно было оценить частоту дыхания и дыхательный объем. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Рисунок S3: Базовая осветительная установка, которая устраняет необходимость в покупке дорогостоящего оптоволоконного комплекта освещения. Игла 20 G была пропущена через конический оптоволоконный кабель объемом 50 мл, оптоволоконный кабель 0,75 мм, который был куплен дешево (и оптом) и разрезан по длине (~ 1 м) лезвием бритвы и закреплен на месте. Фиксация катетера на месте не требовалась из-за плотного прилегания к оптоволоконному кабелю. Закрепление конической крышки над фонариком мобильного телефона обеспечивает достаточную светопроводимость для проведения интубации в затемненной комнате. Эта сборка еще больше снижает затраты, которые берет на себя лаборатория, использующая эту технологию. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Обсуждение

Интубация и интратрахеальная инстилляция являются лучшими методами доставки жидкости в легкие, но многочисленные проблемы, связанные с анатомией мышей, препятствуют широкому внедрению в легочных^{исследовательских} лабораториях. Несмотря на то, что он обеспечивает эффективную доставку инокулюма в легкие, потенциальным недостатком доставки ИТ с помощью этого и других методов интубации является обход верхних дыхательных путей. Интраназальное родоразрешение является проверенным методом, который не обходит верхние дыхательные пути. Хотя интраназальная доставка часто используется в легочных вирусологических лабораториях и может быть более эффективной в некоторых случаях²², она не отражает естественный путь воздействия²³ для некоторых аспирированных агентов, приводит к более вариабельному количеству инокулюма в легких²⁴ и менее эффективна при использовании изофлурана в качестве анестетика⁵. В связи с этим была проведена обширная работа по аэрозольным аппаратам и их сравнению с другими методами доставки легких²⁵, но эти методы представляют опасность, связанную с аэрозолями, и, как правило, являются дорогостоящими. Все эти трудности привели к инстилляции ротоглотки методом вытягивания языка²⁶, которая является предпочтительным методом доставки легочной жидкости во многих лабораториях. Как мы показали, этот метод гораздо более вариатиален, чем интратрахеальная инстилляция после интубации. Кроме того, во время введения нельзя оценить доставку методом вытягивания языка, и язык мыши может быть вызван чрезмерной травмой из-за напряжения, необходимого для предотвращения глотания. Язык также удерживается в технике управляемой интубации и инстилляции IT. Однако, поскольку на видео видна голосовая щель, исследователю, использующему наш метод, не нужно форсировать положение гортани, оказывая значительное напряжение на язык. Это снижение тракции приводит к меньшей травматизации тканей. Однако, несмотря на значительные преимущества, которые дает интубация и инстилляция IT, на пути их использования в некоторых лабораториях стоят проблемы. Например: сдавливание трахеи из-за ошибочного канюляции пищевода может затруднить дыхание и увеличить смертность; слишком глубокое введение эндотрахеальной трубки может привести к повреждению киля или главного ствола бронхов; И, наконец, мышиная интубация традиционными методами занимает много времени, что делает ее непрактичной для большинства исследователей, ищущих надежную внутрилегочную доставку. Наш метод устраняет трудности, связанные с интубацией мышей, даже преодолевая анатомические барьеры для интубации мышей.

Было предложено несколько методов преодоления анатомических проблем интубации мышей путем внедрения визуальных средств. Например, было предложено использование традиционного эндоскопа⁶. Тем не менее, большая фокусная глубина инструмента плохо подходит для использования для интубации мышей (Рисунок S1). Это также хорошо видно на видео 1, где голосовые складки видны, но размыты. Клинические отоскопы также использовались для прямой ларингоскопии¹². Однако стоимость клинических отоскопов и отсутствие видеопотока делают их недоступными для большинства лабораторий и плохо пригодными для обучения. Использование широко доступного потребительского отоскопа значительно повысило практичность управляемой интубации. Более короткое фокусное расстояние, меньший корпус и расширенная кромка депрессора обеспечивают более четкую видеопередачу, лучшую маневренность и позиционирование, а кромку отоскопа можно использовать для давления на основание языка, что улучшает доступ к rima glottidis. Помимо этих визуальных средств, трансиллюминация также использовалась для успешной визуализации голосовой щели и интубации мышей ^7,13,14. Тем не менее, подходы, основанные на трансиллюминации, могут потребовать депиляторов на области, перекрывающей шейку мыши, непосредственной близости к горячему источнику света, использования иглы внутри катетера, введения острых инструментов в рот мыши и/или небольшого разреза над трахеей для подтверждения размещения. Описанный здесь метод позволяет избежать этих рисков и опирается на лучшие аспекты этих опубликованных методов. В дополнение к преодолению анатомических барьеров для интубации, в нашем методе были учтены финансовые соображения.

Использование вспомогательных рук, подставки для мыши, отоскопа и оптоволоконного фонаря делает интубацию более простой в освоении и значительно ускоряет ее выполнение при меньших затратах для лабораторий. Стоимости имеющегося в продаже стенда для интубации можно избежать, если использовать стенд ручной^{работы 27}. Стоимость оптоволоконной световой сборки может быть покрыта путем покупки оптоволоконного кабеля отдельно (по гораздо более низкой стоимости, ~$9 против $218-kent по научным соображениям на момент написания статьи). Чтобы дополнить оптоволоконный источник света, можно использовать коническую крышку объемом 50 мл с отверстием в ней и лентой для сбора света от фонарика мобильного телефона (см. рисунок S3 и таблицу материалов). Das et. Описание аналогичного устройства¹¹. Для некоторых лабораторий снижение стоимости этого решения может сделать наш метод гораздо более доступной процедурой. Помимо затрат, сложность подтверждения установки эндотрахеальной трубки сделала интубацию мышей сложной задачей.

В прошлом, чтобы подтвердить правильное расположение эндотрахеальной трубки, исследователи полагались на запотевание зеркала, держа стоматологическое зеркало над эндотрахеальной трубкой¹⁸. Однако небольшой приливной объем и колебания температуры в помещении часто препятствуют запотеванию зеркал и приводят к ошибкам в суждениях. В случае интубации мышей это представляет серьезный риск получения травмы. Другие прибегают к индуцированию респираторного дистресса путем обструкции эндотрахеальной трубки¹⁰. Это вызывает большой стресс у животного и дает меньше информации, чем «метод пузыря». Кроме того, введение легочных терапевтических средств и воздуха в желудок из-за неадекватного подтверждения установки эндотрахеальной трубки может вызвать дистресс в дополнение к снижению эффективности вводимого препарата. Использование «пузырькового метода» обеспечивает более быстрое и надежное визуальное подтверждение установки эндотрахеальной трубки и является небольшим улучшением по сравнению с аналогичным методом, описанным ранее²⁸. «Пузырьковый метод» также позволяет исследователю приблизительно оценить частоту дыхания и дыхательный объем животного.

Позиционирование животных и визуализация голосовых складок являются ключевыми для этой техники. Мы обнаружили, что педиатрические носовые зеркала были слишком большими и громоздкими, чтобы держать рот открытым, а щеки не мешали во время интубации, но они были очень полезны во время обучения, поскольку позволили исследователю продемонстрировать размещение отоскопа. Научить обучаемого распознавать соответствующую анатомию сложно, и улучшение видимости во рту мыши было ключевым фактором, чему в значительной степени способствовало использование коммерческого отоскопа. Постановка с использованием увеличительного стекла с подсветкой и помощь неотъемлемыми элементами помощи неопытным операторам при интубации, хотя они могут быть не столь важны для опытных операторов.

Во время обучения этому методу может потребоваться устранение неполадок. Если эндотрахеальная трубка входит в пищевод неоднократно, голосовая щель может спазмироваться, мягкое нёбо может быть воспалено, и правильное размещение может быть затруднено. В этом случае дайте животному восстановиться в течение нескольких минут, прежде чем снова попытаться провести интубацию. Количество повторных попыток должно быть указано в протоколе IACUC и всегда соблюдаться. Если вы плохо видите голосовые складки, частота дыхания может быть подавлена из-за слишком большого количества анестезии или расположение мыши может быть неправильным (чаще всего голова слишком сильно наклонена назад). В этом случае измените положение животного и дайте ему восстановиться после анестезии, прежде чем пытаться снова. Пузырьковая трубка должна четко демонстрировать дыхательный объем животного. Если пузырь движется лишь незначительно, это движение может быть вызвано вздохами из-за давления, оказываемого на трахею неправильно расположенной эндотрахеальной трубкой. В этом случае обратитесь к временной метке: 8:25 и рисунку S3 , чтобы увидеть, насколько легко виден дыхательный объем при использовании «пузырьковой трубки» на правильно размещенной эндотрахеальной трубке. Если эндотрахеальная трубка неправильно установлена, немедленно удалите ее и дайте животному восстановиться, прежде чем пытаться повторить процедуру.

Хотя интубация и интратрахеальная инстилляция намного превосходят другие методы, они слишком технически сложны, чтобы получить широкое распространение. Описанные здесь методы делают интратрахеальную инстилляцию и мышиную интубацию доступными и практичными. Хотя будущее применение этого метода в значительной степени зависит от того, что доставляется в легкие и в каком контексте они поступают, простой и надежный метод прокладывает путь ко многим достижениям в биологии легких.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Оптоволоконный LightiКомплект оптоволоконного освещения, мышь	Kent Scientific	ETI-12ETI-MSE-02	Компонент оптоволоконной сборки, совместимый с другими источниками света и заменой оптоволоконного кабеля ниже
Альтернативная оптоволоконная сборка	Braintree Scientifuc	RW-A37 47	альтернатива, не обсуждается (но мы не видим причин, по которым это не будет работать)
Альтернативная оптоволоконная сборка	Гарвардский аппарат	72-9075	альтернатива, не обсуждается (но мы не видим причин, по которым он не будет работать)
Альтернативная оптоволоконная сборка	Ручная работа лаборатории	N/A	Инструкции найдены здесь с использованием резиновой пробки: DOI 10.3791/50318
Альтернативная оптоволоконная сборка	Ручная работа лаборатории	N/A (материалы перечислены ниже)	Изготовлен из конической крышки объемом 50 мл, ленты и подставки для интубации волоконно-оптического волокна 0,75 мм
, мышь	Kent Scientific	ETI-MSE-01	Регулируемая стойка для интубации, доступно множество самодельных версий, используются стойки для наконечников и деревянные платформы, некоторые альтернативы перечислили множество подходящих альтернатив.
Альтернативные стойки для интубации	Braintree Scientifuc	RIS 100	альтернатива, не обсуждаются (но мы не видим причин, по которым это не сработает)
Альтернативные стойки для интубации	Natsume Seisakusho	KN-1014	альтернатива, не обсуждаются (но мы не видим причин, по которым это не сработает)
Альтернативные стойки для интубации	Vetland	000A3467	альтернатива, не обсуждаются (но мы не видим причин, по которым это не сработает)
Альтернативные стойки для интубации	Ручная работа лаборатории	N/A	Изготовлен из 3-кольцевого связующего здесь: DOI 10.3791/60844 (опубликовано несколько альтернативных методов)
Нерассасывающийся плетеный шелковый шовный материал, размер 0	Fine Science Tools	18020-00	длиной более 1 дюйма повредит киль
Safelet IV катетер 20G x 1"	Nipro	NPRCI+2025	Или аналогичный
RS-5358 Микрорассекающий щипцы	Fisher	RS-5358	Или аналогичный, включает в себя помогающие руки
Увеличительное стекло с подсветкой и подставкой, гибкая магнитная рука помощи EOOKU, 5X & 10X 12 В 108 шт. Светодиодные бусины Увеличительная лампа, 3 режима регулируемого поворота Гусиная шея Руки и ; Сверхпрочная опорная плита	Amazon	https://www.amazon.com/Magnifying- EOOKU-Гибкая-Регулируемая-Гусиная Шея /dp/B0C5MC6QNW/ref=sr_1_5?crid=F4 PZY6UOCEE9& dib=eyJ2IjoiMSJ9. gj5cKLw4v3CDSkrQKcs73kXqVtnJl JpBKEp_FcTCIEQSO3EirxEYoH ySohcPg0ZDhmnFwGeLit22nM SJxpz1MPP0 q6-PwbPzzMT0RWB_pXkmSBiAo5xB J4QSf8_BoLZ4u8S8lfIo5WI9-VuXj75X eo0LQfygaSMM gW58XO2bbasOfaw cwxZXs5cTqCUmKh5bRn7A19_ cY2a0-x_ly-27RXXPinVbBNW00Ww8jY55x fnWFCaK5lnPb4VxSV6iTCOhMnkm TopFiA3rCLNXcBDGCwfLdw22w 17T0c_rRhh-Mrew . TtsVr89Bo5YLvaXvarcbKxJ07GK zMMVSg5op4U5eyvA& dib_tag= SE& keywords=увеличитель+стекло+с +свет+EOOKU+3+in+1& qid=1709661 709& sprefix=magnifying+glass+with+ light+eooku+3+in+1%2Caps%2C98& sr=8-5	Или подобные, любые изогнутые мелкозубчатые щипцы подойдут
Удаление ушной серы - Инструмент для удаления ушной серы с 8 шт. Набор ушей - Очиститель ушей с камерой - Набор для удаления ушной серы с подсветкой - Ушная камера с 6 ушными ложками - Очиститель ушей для iOS и Android (черный)	Amazon	https://www.amazon.com/Ear-Wax- Removal-Remover-Android%EF% BC%88Black%EF%BC%89/dp/B0 9KZ8TS7L/ref=pd_lpo_sccl_1/147 -1203879-4147304?pd_rd_w=Lt8 Ta& content-id=amzn1.sym.1ad20 66f-97d2-4731-9356-36b3edf1ae 04& pf_rd_p=1ad2066f-97d2-4731 -9356-36b3edf1ae04& pf_rd_r= MDQ3AHH4AC8T2KFX1RBE& pd_rd_wg=ja4H2& pd_rd_r=52d9 372c-b34b-4f6a-93f6-974754d96 3d9& pd_rd_i=B09KZ8TS7L& psc=1	или аналогичный, доступно несколько брендов
AZIMOM PMMA пластиковый концевой оптоволоконный кабель 0,75 мм (0,02 дюйма) 100 м (328 футов) / рулон для звездного неба потолок все виды светодиодных источников драйвера	двигателя Amazon	https://www.amazon.com/AZIMOM -пластик-вырезаемый-потолок-1pcs0-00 98in328ft/dp/B07WC9JV5N/ref=sr _1_9?dib=eyJ2IjoiMSJ9.K7NmvB hJOux4zdNBKSPo-ac4HYPDPUS F85Qlra7o7G2FQl9MQLj1D7QtPJ cxnAeDiYm_yNWPhwj44nhSfwqM vs1AtulruHGEsfjLEAjRGSFpNLgN H-Ewc190MluERArk91lR9Od6ceB Hkz2AJad11hVUkWEOb0-emUWW b2U4fNN0upQKgyD1vE eU0DtClQ73tDe22z4CXrSLP7vC D9jF2APfz1liHou_zdiAyCSFb1Df bC8Ymce6zXV0qOD3gQFkm6j NV5bN1DG8SH_BaV4vofzj98T JVRnNElEzUzjx0rY. AMHl3h-jIz GTeGjvej0Nq8FTPLEPmfiQ UDPz_U6ctI0& dib_tag=se& keywords=fiber%2Boptic%2Blight %2Bstrands& qid=1722619884& sr =8-9& th=1	Или аналогично, волокно используется для создания устройства в линии 7
50mL коническая трубка	Cell Treat	229421	любой непрозрачный пластиковый 50mL завинчивающаяся крышка должна функционировать. Не соприкасается и не находится близко к животному, поэтому нет необходимости в стерильности;
Изофлуран	VetOne	Consult Veternary Staff
Innoculum	Н/Д	Специально для вашего эксперимента
Наконечники для пипеток (фильтр)	Н/Д	Стерильный фильтр p100 и использованные наконечники p1000	Бренд/Поставщик не относится
Индукционная камера	Н/Д	Как доступно в вашем учреждении	Бренд/Поставщик не актуален
Подушечки для подготовки изопропанола	Н/Д	Для чистки инструментов	Бренд/Поставщик не актуальны
Трубы	Н/Д	Гибкая трубка малого диаметра будет работать	Для строительства "пузырьковой трубы"  (наш ~3 мм в диаметре и был взят из капельницы внутривенного введения)
Замок Люэра	Н/Д	для установки на трубку выше	Для изготовления «пузырьковой трубки»
3M полулицевой респиратор	3M	17-986-9B	для ограничения воздействия газов
Twist Tie	N/A	N/A	для поддержания U-образной формы пузырьковой трубки