Этот протокол описывает культивирование, сбор и концентрирование секретируемых белков Mycobacterium tuberculosis. Белки фильтрата культуры (CFP) количественно оценивают, разделяют на 20 фракций с помощью изоэлектрической фокусировки и далее разрешают на 30 фракций с помощью препаративного SDS-PAGE и системы электроэлюирования.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Разделение и фракционирование культуральных фильтратных белков (СЛТ) из микобактерий туберкулеза
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Секретируемые белки Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) играют решающую роль в патогенезе туберкулеза, иммунной модуляции и прогрессировании заболевания. Понимание их состава и функций имеет важное значение для выявления новых биомаркеров, которые могут помочь в диагностике туберкулеза, разработке вакцин и терапевтических вмешательствах. Данное исследование посвящено систематическому выделению, фракционированию и характеризации культуральных фильтроватных белков (CFP) для проведения комплексного иммунологического и протеомного анализа. CFP были получены из культур M. tuberculosis H37Rv, выращенных в химически определенных условиях для обеспечения контролируемой экспрессии белка. Надосадочную жидкость культуры очищали с помощью фильтрации и концентрировали с использованием системы полых волокон для удержания белков выше 10 кДа. Фракционирование было достигнуто за счет жидкофазной изоэлектрической фокусировки, разделяющей белки на основе их изоэлектрических точек на 20 различных фракций. Дальнейшее разрешение проводили с помощью препаративного электрофореза в виде додецилсульфата натрия и полиакриламидного геля (SDS-PAGE) с последующим электроэлюированием, в результате чего получали 30 белковых фракций. Фракционированные белки, полученные с помощью этого подхода, являются ценным ресурсом для иммунологического профилирования и протеомного анализа на основе масс-спектрометрии. Систематически выделяя и характеризуя секретируемые белки, это исследование способствует идентификации биомаркеров, специфичных для туберкулеза, что может повысить точность диагностики и улучшить наше понимание патогенеза M. tuberculosis .
Введение
Обширные исследования показали значительную роль секретируемых белков в росте и иммунных взаимодействиях Mycobacterium tuberculosis1. Фильтрат культуры M. tuberculosis содержит сложный набор белковых и небелковых компонентов, что делает его ценным ресурсом для понимания его биологии и иммуногенных свойств. Ранние протеомные исследования выявили около 450 белков в культуральном фильтрате2, многие из которых играют решающую роль в вызывании иммунных реакций против туберкулеза. Идентификация этих иммунологически значимых антигенов имеет важное значение для разработки иннов....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Подробная информация о реагентах и оборудовании, использованных в этом исследовании, приведена в Таблице материалов.
1. Рост Mycobacterium tuberculosis и получение белков фильтрата культуры (СЛТ)
- Приготовление жидкой среды Саутона
- В 950 мл дистиллированной воды соединить следующие компоненты: глицерин, 30,0 мл; Калия дигидроортофосфат (KH2PO4), 0,5 г; Сульфат магния, 0,5 г; Лимонная кислота, 2,0 г; Гидролизат казеина, 0,5 г; Сульфат железа и аммония, 0,05 г; Глутамат натрия, 4,0 г.
- Отрегулируйте pH до 7,2, испо....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
На рисунке 1 показана сложность приготовленных культуральных фильтроватных белков (CFP). Первоначально 100 мкг CFP подвергали двухстраничному анализу для оценки его сложности. Этот анализ выявил наличие почти 100 различных белковых пятен в CFP (рис. 1).
20 фракций, собранных при каждом прогоне, были проанализированы с помощью SDS-PAGE. Из них три репрезентативные дроби из трех разных прогонов показаны на рисунке 2.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Белки фильтрата культуры (СЛТ) Mycobacterium tuberculosis представляют собой сложную смесь разнообразных белковых компонентов, присутствующих в различных концентрациях. Протеомные исследования выявили до 1314 белков в CFP 4,5. Многочисленные исследования подчеркнули решающую роль CFP в модуляции иммунных реакций. В частности, CFP играют незаменимую роль как в клеточно-опосредованном иммунитете, характеризующемся
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Ä Система фильтрации тангенциального потока KTA | ЦИТИВА | 29038437 | |
| Амфолиты (pH от 3,0 до 10,0 ) | БИО-РАД | 1632094 | |
| Амфолиты (pH от 4,0 до 6,0 ) | БИО-РАД | 1631143 | |
| Анализ белка БЦА | МЕРК | 71285-М | |
| Прописные буквы | МЕРК | С2632 | |
| Гидролизат казеина | МЕРК | 65072-00-6 | |
| Лимонная кислота | МЕРК | С0759 | |
| Дигитонин | МЕРК | 300410 | |
| ДТТ | МЕРК | D9779 | |
| Сульфат железа и аммония | ХИМЕДИА | GRM10944 | |
| Глицерин | МЕРК | Г5516 | |
| Глицерин | МЕРК | 252859 | |
| Наклон Ловенштейна-Йенсена | ХИМЕДИА | СЛ001 | |
| Сульфат магния | МЕРК | М7506 | |
| Быстросъемная вакуумная система фильтрации Millipore Stericup | МЕРК | S2HVU11RE | |
| Фосфорная кислота | МЕРК | 695017 | |
| Дигидроортофосфат калия | МЕРК | П0662 | |
| Гидроксид калия | МЕРК | 484016 | |
| Препаративная ячейка IEF (Rotofor) | БИО-РАД | 170-2986 | |
| Азид натрия | МЕРК | С2002 | |
| Глутамат натрия | МЕРК | 49621 | |
| Гидроксид натрия | ХИМЕДИА | МБ095 | |
| Трис | МЕРК | 252859 | |
| Мочевина | МЕРК | У5128 | |
| Цельный гель Eluter аппарат | БИО-РАД | 1651250 |
Ссылки
- Gomez, M., Johnson, S., Gennaro, M. L. Identification of secreted proteins of Mycobacterium tuberculosis by a bioinformatic approach. Infect Immun. 68 (4), 2323-2327 (2000).
- de Souza, G. A., et al.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
