Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Разделение и фракционирование культуральных фильтратных белков (СЛТ) из микобактерий туберкулеза

880 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/67679

⸱

11 июля 2025 г.

 ,  ,  , 
1Department of Immunology, National Institute for Research in Tuberculosis, 2Faculty of Medical Research, Academy of Scientific and Innovative Research (AcSIR)

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол описывает культивирование, сбор и концентрирование секретируемых белков Mycobacterium tuberculosis. Белки фильтрата культуры (CFP) количественно оценивают, разделяют на 20 фракций с помощью изоэлектрической фокусировки и далее разрешают на 30 фракций с помощью препаративного SDS-PAGE и системы электроэлюирования.

Аннотация

Секретируемые белки Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) играют решающую роль в патогенезе туберкулеза, иммунной модуляции и прогрессировании заболевания. Понимание их состава и функций имеет важное значение для выявления новых биомаркеров, которые могут помочь в диагностике туберкулеза, разработке вакцин и терапевтических вмешательствах. Данное исследование посвящено систематическому выделению, фракционированию и характеризации культуральных фильтроватных белков (CFP) для проведения комплексного иммунологического и протеомного анализа. CFP были получены из культур M. tuberculosis H37Rv, выращенных в химически определенных условиях для обеспечения контролируемой экспрессии белка. Надосадочную жидкость культуры очищали с помощью фильтрации и концентрировали с использованием системы полых волокон для удержания белков выше 10 кДа. Фракционирование было достигнуто за счет жидкофазной изоэлектрической фокусировки, разделяющей белки на основе их изоэлектрических точек на 20 различных фракций. Дальнейшее разрешение проводили с помощью препаративного электрофореза в виде додецилсульфата натрия и полиакриламидного геля (SDS-PAGE) с последующим электроэлюированием, в результате чего получали 30 белковых фракций. Фракционированные белки, полученные с помощью этого подхода, являются ценным ресурсом для иммунологического профилирования и протеомного анализа на основе масс-спектрометрии. Систематически выделяя и характеризуя секретируемые белки, это исследование способствует идентификации биомаркеров, специфичных для туберкулеза, что может повысить точность диагностики и улучшить наше понимание патогенеза M. tuberculosis .

Введение

Обширные исследования показали значительную роль секретируемых белков в росте и иммунных взаимодействиях Mycobacterium tuberculosis1. Фильтрат культуры M. tuberculosis содержит сложный набор белковых и небелковых компонентов, что делает его ценным ресурсом для понимания его биологии и иммуногенных свойств. Ранние протеомные исследования выявили около 450 белков в культуральном фильтрате2, многие из которых играют решающую роль в вызывании иммунных реакций против туберкулеза. Идентификация этих иммунологически значимых антигенов имеет важное значение для разработки инновационных средств диагностики и вакцин против туберкулеза. Тем не менее, прогресс в этой области осложняется сложностью иммунного ответа на инфекцию M. tuberculosis и техническими ограничениями методов биохимической очистки, используемых для выделения белков микобактерий.

Для определения белков M. tuberculosis были использованы различные методы разделения, что облегчает обнаружение незначительных, но функционально значимых белков и расширяет область протеомных исследований. Идеальный метод разделения позволяет эффективно разлагать сложные белковые смеси на ограниченное число отдельных фракций. Двумя широко используемыми подходами к разделению белков микобактерий являются методы, основанные на хроматографии и электрофорезе 1,2.

Хроматографические методы, включая аффинность, ионный обмен и обратимую фазовую хроматографию, уже более десяти лет являются краеугольным камнем фракционирования белков. Эти методы широко используются для разделения белков M. tuberculosis 3. Однако они ограничены такими факторами, как низкий выход белка и интерференция небелковых компонентов, что может осложнить последующие иммунологические анализы. Эти недостатки ограничивают полезность хроматографии для идентификации иммунологически значимых антигенов.

Чтобы устранить эти ограничения, был принят метод разделения на основе двумерного электрофореза. В первом измерении белки разделяются на основе их изоэлектрической фокусировки (ИЭФ) с помощью препаративной системы ИЭФ, которая разделяет белки в соответствии с их изоэлектрическими точками. Во втором измерении белки дополнительно разрешаются по молекулярной массе с помощью препаративного SDS-PAGE с последующим элюированием с помощью цельногелеобразного элютерного инструмента.

Этот двухмерный подход имеет ряд преимуществ. Он значительно снижает сложность культуральных фильтроватных белков (CFP) за счет их фракционирования на 600 отдельных фракций. Кроме того, фракции подходят для прямого иммунологического анализа, поскольку в процессе элюирования не вводятся компоненты, которые мешают проведению клеточных иммунологических анализов 4,5,6.

В этом протоколе подробно описан приготовление и разделение культуральных белков фильтрата для иммунологического анализа6.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Подробная информация о реагентах и оборудовании, использованных в этом исследовании, приведена в Таблице материалов.

1. Рост Mycobacterium tuberculosis и получение белков фильтрата культуры (СЛТ)

  1. Приготовление жидкой среды Саутона
    1. В 950 мл дистиллированной воды соединить следующие компоненты: глицерин, 30,0 мл; Калия дигидроортофосфат (KH2PO4), 0,5 г; Сульфат магния, 0,5 г; Лимонная кислота, 2,0 г; Гидролизат казеина, 0,5 г; Сульфат железа и аммония, 0,05 г; Глутамат натрия, 4,0 г.
    2. Отрегулируйте pH до 7,2, используя 40% гидроксид калия (примерно 5 мл/л).
    3. Доведите объем до 1 л и автоклавируйте при давлении 15 фунтов на квадратный дюйм в течение 20 минут.
  2. Приготовление суспензии микобактерий
    1. Пересадка колоний Mycobacterium tuberculosis H37Rv (ATCC 27294), выращенных по методу Ловенштейна-Йенсена (LJ), помещается в 2 мл жидкой среды Саутона.
    2. Разбейте комки микобактерий путем энергичного встряхивания стеклянными шариками в стерильных условиях.
  3. Инициация роста микобактерий
    1. Перелейте бактериальную суспензию во флакон McCartney, содержащий 10 мл жидкой среды Sauton.
    2. Выдерживайте флакон при температуре 37 °C в течение 2 недель.
  4. Масштабирование культуры
    1. Переложите выращенную культуру в 200 мл среды Саутона в бутылке объемом 1 л.
    2. Выдерживать в шейкере при температуре 37 °C в течение 4 недель.
    3. Переложите культуру логической фазы в колбу объемом 4 л, содержащую 2 л среды Саутон.
    4. Выращивайте культуру при температуре 37 °C в стационарных условиях еще 4 недели до образования поверхностной пленки.
  5. Заготовка белков фильтрата культуры (СЛТ)
    1. Соберите урожай методом центрифугирования при давлении 1000-1500 х г в течение 30 минут при комнатной температуре.
    2. Отфильтруйте надосадочную жидкость через вакуумную фильтрационную систему 0,45 мкм.
    3. Концентрируйте фильтрат, содержащий CFP, с помощью системы фильтрации тангенциального потока с отсечкой 10 кДа.
  6. Хранение собранного СЛТ
    1. Оцените содержание белка с помощью коммерчески доступного набора для анализа BCA.
    2. Аликвотируйте белки, добавьте азид натрия до конечной концентрации 0,2% и храните при -80 °C.

2. Препаративная жидкофазная изоэлектрическая фокусировка (ИЭФ)

  1. Подготовка пробы белка
    1. Солюбилизируйте Mycobacterium tuberculosis CFP в 60 мл разделительного буфера IEF, содержащего 8 М мочевины, 1 мМ дитиотреитола (DTT), 5% глицерина, 2% дигитонина, 2% амфолитов (pH 3,0-10,0 и pH 4,0-6,0 в соотношении 1:4).
  2. Настройка системы IEF
    1. Заполните анодную камеру 0,1 М фосфорной кислотой, а катодную камеру 0,1 М гидроксидом натрия.
    2. Соберите препаративную ячейку ВЭФ в соответствии с инструкциями производителя (см. Таблицу материалов).
  3. Проведение IEF
    1. Загрузите до 350 мг белка в систему IEF.
    2. Сфокусируйте белки при температуре 4 °C с помощью охлаждающей системы циркуляции воды.
    3. Подайте постоянную мощность 12 Вт, пока напряжение не стабилизируется на уровне примерно 1400 В, затем продолжайте еще 30 минут.
  4. Сбор и анализ дробей
    1. Сбор фракций ВЭФ и определение их pH.
    2. Проанализируйте каждую аликвоту с помощью SDS-PAGE и визуализируйте белки с помощью окрашивания серебром.

3. Препаративное SDS-PAGE и цельногелевое элюирование

  1. Подготовка образцов для SDS-PAGE
    1. Смешивайте фракции IEF с коммерчески доступным буфером для образцов из 6x SDS-PAGE.
    2. Нагрейте смесь до 95 °C в течение 5 минут.
  2. Запуск препаративного SDS-PAGE
    1. Загрузите до 10 мг белка в полиакриламидный гель диаметром 16 см × 20 см с 4% укладывающим гелем и 12,5% растворяющим гелем.
    2. Запустите электрофорез при постоянном токе 50 мА до тех пор, пока фронт красителя не окажется в 2 см от дна.
  3. Выведение белков из геля
    1. Уравновесить гель в элюирующем буфере (60 мМ Tris, 40 мМ CAPS, pH 9,4) в течение 10 мин.
    2. Перенесите гель на цельный гелеобразовательный элютерный инструмент.
    3. Элюирование белков путем подачи постоянного тока 250 мА в течение 1 ч.
  4. Сбор и анализ дробей
    1. Разделите разделенные белки на 30 отдельных фракций, каждая объемом 2,5 мл.
    2. Определяйте концентрацию белка с помощью метода оценки белка ВСА, следуя инструкциям производителя.
    3. Проанализируйте 10 г белка из каждой фракции с помощью SDS-PAGE и визуализируйте с помощью окрашивания серебром.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

На рисунке 1 показана сложность приготовленных культуральных фильтроватных белков (CFP). Первоначально 100 мкг CFP подвергали двухстраничному анализу для оценки его сложности. Этот анализ выявил наличие почти 100 различных белковых пятен в CFP (рис. 1).

20 фракций, собранных при каждом прогоне, были проанализированы с помощью SDS-PAGE. Из них три репрезентативные дроби из трех разных прогонов показаны на рисунке 2...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Белки фильтрата культуры (СЛТ) Mycobacterium tuberculosis представляют собой сложную смесь разнообразных белковых компонентов, присутствующих в различных концентрациях. Протеомные исследования выявили до 1314 белков в CFP 4,5. Многочисленные исследования подчеркнули решающую роль CFP в модуляции иммунных реакций. В частности, CFP играют незаменимую роль как в клеточно-опосредованном иммунитете, характеризующемся

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Ä Система фильтрации тангенциального потока KTA ЦИТИВА29038437
Амфолиты (pH от 3,0 до 10,0 )БИО-РАД1632094
Амфолиты (pH от 4,0 до 6,0 )БИО-РАД1631143
Анализ белка БЦА МЕРК71285-М
Прописные буквыМЕРКС2632
Гидролизат казеинаМЕРК65072-00-6
Лимонная кислотаМЕРКС0759
ДигитонинМЕРК300410
ДТТМЕРКD9779
Сульфат железа и аммонияХИМЕДИАGRM10944
ГлицеринМЕРКГ5516
Глицерин МЕРК252859
Наклон Ловенштейна-Йенсена ХИМЕДИАСЛ001
Сульфат магнияМЕРКМ7506
Быстросъемная вакуумная система фильтрации Millipore StericupМЕРКS2HVU11RE
Фосфорная кислота МЕРК695017
Дигидроортофосфат калияМЕРКП0662
Гидроксид калия МЕРК484016
Препаративная ячейка IEF (Rotofor) БИО-РАД170-2986 
Азид натрия МЕРКС2002
Глутамат натрияМЕРК49621
Гидроксид натрияХИМЕДИАМБ095
ТрисМЕРК252859
МочевинаМЕРКУ5128
Цельный гель Eluter аппарат БИО-РАД1651250

Ссылки

  1. Gomez, M., Johnson, S., Gennaro, M. L. Identification of secreted proteins of Mycobacterium tuberculosis by a bioinformatic approach. Infect Immun. 68 (4), 2323-2327 (2000).
  2. de Souza, G. A., et al. High-accuracy mass spectrometry analysis as a tool to verify and improve gene annotation using Mycobacterium tuberculosis as an example. BMC Genomics. 9, 316(2008).
  3. Lim, J. H., et al. Identification of the new T-cell-stimulating antigens from Mycobacterium tuberculosis culture filtrate. FEMS Microbiol Lett. 232 (1), 51-59 (2004).
  4. Covert, B. A., Spencer, J. S., Orme, I. M., Belisle, J. T. The application of proteomics in defining the T cell antigens of Mycobacterium tuberculosis. Proteomics. 1 (5), 574-586 (2001).
  5. Tucci, P., et al. Integrative proteomic and glycoproteomic profiling of Mycobacterium tuberculosis culture filtrate. PLoS One. 15 (3), e0221837(2020).
  6. Deenadayalan, A., et al. Immunoproteomic identification of human T cell antigens of Mycobacterium tuberculosis that differentiate healthy contacts from tuberculosis patients. Mol Cell Proteomics. 9 (3), 538-549 (2010).
  7. Yasuda, I., et al. Evaluation of cytokine profiles related to Mycobacterium tuberculosis latent antigens using a whole-blood assay in the Philippines. Front Immunol. 15, 1330796(2024).
  8. Målen, H., Søfteland, T., Wiker, H. G. Antigen analysis of Mycobacterium tuberculosis H37Rv culture filtrate proteins. Scand J Immunol. 67 (3), 245-252 (2008).
  9. Bekmurzayeva, A., Sypabekova, M., Kanayeva, D. Tuberculosis diagnosis using immunodominant, secreted antigens of Mycobacterium tuberculosis. Tuberculosis (Edinb). 93 (4), 381-388 (2013).
  10. Rodríguez-Hernández, E., et al. Application of antigenic biomarkers for Mycobacterium tuberculosis. J Zhejiang Univ Sci B. 21 (11), 856-870 (2020).
  11. Mustafa, A. S. Chemical and biological characterization of Mycobacterium tuberculosis-specific ESAT6-like proteins and their potentials in the prevention of tuberculosis and asthma. Med Princ Pract. 32 (4-5), 217-224 (2023).
  12. Rosenkrands, I., et al. Towards the proteome of Mycobacterium tuberculosis. Electrophoresis. 21 (17), 3740-3756 (2000).
  13. Jungblut, P. R., et al. Comparative proteome analysis of Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium bovis BCG strains: Towards functional genomics of microbial pathogens. Mol Microbiol. 33 (6), 1103-1117 (1999).
  14. Lim, J. H., et al. Identification of the new T-cell-stimulating antigens from Mycobacterium tuberculosis culture filtrate. FEMS Microbiol Lett. 232 (1), 51-59 (2004).
  15. Rodríguez-Hernández, E., et al. Application of antigenic biomarkers for Mycobacterium tuberculosis. J Zhejiang Univ Sci B. 21 (11), 856-870 (2020).
  16. Deenadayalan, A., Sundaramurthi, J. C., Raja, A. Immunological and proteomic analysis of preparative isoelectric-focusing separated culture filtrate antigens of Mycobacterium tuberculosis. Exp Mol Pathol. 88 (1), 156-162 (2010).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Фракционирование белковизоэлектрическое фокусированиеЭлектрофорез в ПААГ с SDSбелковые биомаркерыиммунологическое профилированиетангенциальная поточная фильтрацияпротеомный анализантигены Т-клеток
Разделение и фракционирование культуральных фильтратных белков (СЛТ) из микобактерий туберкулеза
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.