Методическая статья

Разделение и фракционирование белков клеточной стенки и клеточных мембран из Mycobacterium tuberculosis для последующего анализа белков

DOI:

10.3791/67680

⸱

26 сентября 2025 г.

 ,  ,  , 
1Department of Immunology, National Institute for Research in Tuberculosis, 2Faculty of Medical Research, Academy of Scientific and Innovative Research (AcSIR)

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол разделяет нерастворимые белки клеточной стенки и мембраны на простые фракции (1-5 белков) с помощью препаративной изоэлектрической фокусировки (ИЭФ) на основе изоэлектрической точки с последующим разделением по молекулярной массе. Полученные фракции могут быть использованы непосредственно для иммунологического и протеомного анализа без дополнительной очистки.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Белки клеточной стенки и мембраны микобактерий, которые играют центральную роль в патогенезе туберкулеза, были успешно разделены с помощью препаративной изоэлектрической фокусировки (ИЭФ) и препаративного электрофореза в виде геля додецилсульфата натрия и полиакриламида (SDS-PAGE). Затем следует элюирование гелем, преодоление ограничений в традиционных методах разделения гидрофобных белков. В этой процедуре колонии M. tuberculosis переносили из наклонов Ловенштейна-Йенсена в 2 мл бульона 7H9, диспергировали стеклянными шариками и инкубировали при 37 °C в течение 2 недель. Затем культуру масштабировали до 200 мл и выращивали в шейкере в течение 4 недель. Затем его увеличили до 1 л с 500 мл бульона 7H9 и выращивали еще 4 недели. Выращенные микобактерии гранулировали центрифугированием при 1741 × г в течение 30 мин. На каждые 2 г гранулы добавляли 1 мл буфера для разрушения, и образец подвергали ультразвуковой обработке. Лизат центрифугировали при 3436 × г в течение 15 мин для удаления неповрежденных клеток, а надосадочную жидкость концентрировали. Этот надосадочный агент (лизат целой клетки) центрифугировали при 13751 × г в течение 30 мин для гранулирования белков клеточной стенки. Оставшуюся надосадочную жидкость ультрацентрифугировали при 100 000 × г в течение 4 ч для разделения клеточной мембраны и цитозоля. Выделенные белки клеточной стенки и мембраны загружали в жидкую препаративную систему IEF при 4 °C и разделяли при 12 Вт до стабилизации напряжения на уровне 1400 В, что разделяет 20 фракций. Эти фракции IEF дополнительно разделяли препаративным SDS-PAGE, а белки элюировали с помощью цельного геля элютера при 250 мА, в результате чего получалось 30 фракций. С помощью этого протокола мы смогли идентифицировать новые клеточные стенки M. tuberculosis и мембраноспецифические биомаркеры, а также продемонстрировать потенциал для характеристики подобных белков у других патогенов.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Иммунологические исследования показали, что помимо растворимых белков, которые легко поддаются очистке, иммунный ответ человека на таких возбудителей, как M. tuberculosis, также направлен на гидрофобный белок, присутствующий в клеточной стенке1 и белках клеточной мембраны 2 Mycobacterium tuberculosis. Эти белки клеточной стенки и мембраны играют решающую роль в иммунологическом контроле против многих патогенов, включая туберкулез. Некоторые из этих белков считаются иммунодоминантными антигенами, которые вызывают ответ Т- и В-клеток. В отличие от этого, другие белки идентифицируются как молекулярные сигнатуры патогенов, которые, как известно, инициируют врожденный иммунный ответ, такой как патоген-ассоциированные молекулярные паттерны (PAMP) иммунными клетками, тем самым инициируя иммунный ответ. Например, липопротеины микобактерий, такие как LprG, LpqH, LprA и PhoS1, распознаются Toll-подобным рецептором 23.

Гидрофобная природа белков клеточной стенки и мембраны представляет собой значительные технические проблемы с точки зрения их солюбилизации и разделения. Исследования показали, что мембранные белки составляют примерно от 20% до 30% кодирующих областей всех организмов, в том числе и микобактерий 4,5. Из-за своей внутренней природы и технических сложностей белки клеточной стенки и мембраны сложнее растворить и изолировать по сравнению с растворимыми белками. В результате, было зарегистрировано только 2% мембранных белковых структур6. Несколько факторов способствуют трудности выделения этих белков. Основной проблемой является их низкая распространенность в клетке, что затрудняет выделение отдельных белков для дальнейшей характеристики7. Кроме того, эти белки имеют тенденцию агрегировать, что еще больше усложняет их растворимость. Эту проблему можно решить, добавив моющие средства для облегчения солюбилизации. Тем не менее, некоторые белки могут образовывать агрегаты даже в присутствии детергентов, и в этом случае для улучшения растворимости можно использовать хаотропные агенты и восстановители.

Использование моющих средств для солюбилизации может помешать последующим методам сепарации. Например, заряженные моющие средства нельзя использовать с ионообменной хроматографией, а все моющие средства могут нарушить гидрофобное взаимодействие хроматографии8. Поэтому выбор моющего средства, совместимого с выбранным методом сепарации, имеет решающее значение. Еще одним важным этапом выделения белков клеточной стенки и мембраны является удаление детергентов, используемых для солюбилизации, поскольку они могут мешать последующему функциональному анализу белков.

Мы разработали надежную методологию, которая позволяет преодолеть многие проблемы, связанные с анализом мембранных белков, в частности гидрофобных белков клеточной стенки и клеточной мембраны. Ключевой проблемой в изучении этих белков является их солюбилизация, поскольку их гидрофобная природа затрудняет их извлечение и анализ. В описанной здесь методике используется специально разработанный изоэлектрический фокусирующий буфер (ИЭФ), который эффективно солюбилизирует белки клеточной стенки и клеточных мембран. Этот этап солюбилизации имеет решающее значение, поскольку он позволяет провести последующий анализ этих гидрофобных белков.

Дополнительным преимуществом этого метода является его способность снижать сложность белковой смеси. Используя два взаимодополняющих метода разделения, основанных на изоэлектрической точке (pI) и молекулярной массе белков, эта методология эффективно разделяет белки клеточной стенки и клеточной мембраны на упрощенные фракции. Каждая фракция обычно содержит только от одного до трех белков, что значительно повышает разрешение и облегчает определение характеристик на последующих этапах.

Эта методология, разработанная с использованием белков клеточной стенки и клеточных мембран Mycobacterium tuberculosis в качестве модельной системы, эффективно решает проблемы, связанные с выделением и анализом гидрофобных белков. Он обеспечивает надежный подход к выделению, разделению и характеристике этих сложных белковых фракций, расширяя возможности их детального изучения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование соответствовало соответствующим правительственным рекомендациям и было одобрено Институциональным научным консультативным комитетом и Этическим комитетом. Информированное согласие было получено от исследуемой популяции до того, как были взяты образцы.

1. Культивирование M. tuberculosis

  1. Перенесите примерно 10 колоний M. tuberculosis из косых Lowenstein-Jensen в 2 мл среды для бульона 7H9 (суспензируйте 2,35 г основания бульона Middlebrook 7H9 в 400 мл дистиллированной воды, 50 мл добавки олеинового альбумина декстрозы каталазы [OADC], 0,5 г Tween 80 и приготовьте до 500 мл)
    ПРИМЕЧАНИЕ: M. tuberculosis относится к 3 группе риска; с ним следует обращаться в шкафу биологической безопасности (БСК) на предприятии BSL3. Необходимо использовать соответствующие средства индивидуальной защиты (СИЗ).
  2. Диспергируйте клетки с помощью стеклянных шариков в стерильных условиях в шейкере для бутылок при 15 об/мин в течение 1 минуты.
  3. Перенесите бактериальную суспензию в 10 мл бульонной среды 7H9 в бутылку McCartney и инкубируйте при 37 °C в течение 2 недель в шейкерном инкубаторе при 30 об/мин.
  4. Увеличьте масштаб логарифмической культуры до 200 мл бульонной среды 7H9 и выращивайте в шейкерной культуре в течение 4 недель при 30 об/мин.
  5. Далее масштабируйте культуру в колбе объемом 1 л, содержащей 500 мл бульонной среды 7H9, и выращивайте в качестве шейкера при 30 об/мин в течение 4 недель при 37 °C.
  6. Соберите микобактерии центрифугированием при 1741 г в течение 30 минут.

2. Получение белков лизата цельных клеток

  1. Подвергнуть выделенную бактериальную гранулу ультразвуковой обработке в соответствии со стандартным протоколом.
  2. Приготовьте буфер для разрыва со следующим составом: 20 мМ Трис с 8,5% (8,5 г на 100 мл) NaCl.
  3. Отрегулируйте окончательный pH до 7,4 с помощью концентрированной HCl.
  4. Добавьте в буфер для разрушения свежеприготовленные ингибиторы протеазы в следующих концентрациях (подробная информация об ингибиторах протеазы, которые должны быть добавлены, приведена в дополнительной таблице 1)
  5. Обработайте бациллами M. tuberculosis (100 мл в упаковке и весе) на каждые 2 г бактериальной клеточной гранулы, добавьте 1 мл разрушающего буфера с лизоцимом (1 мг/5 мл клеточной суспензии) и инкубируйте в течение 15 мин при 37 °C при осторожном перемешивании.
  6. Суспендируйте бациллы в удвоенном объеме разрывного буфера.
  7. Добавьте в буфер 0,04% (масс./об.) азида натрия и 0,05% Tween 80.
  8. Разрушайте бактериальные клетки в буфере разрыва с помощью ультразвуковой аппарата с циклом 9 с включением и 9 с выключением в течение 30 мин при амплитуде 40%, удерживая суспензию на льду для предотвращения денатурации белка.
  9. Приготовленный лизат центрифугируют при 3438 г в течение 15 мин при 4 °C для удаления неповрежденных клеток.
  10. Концентрировать надосадочную жидкость с помощью центробежных концентраторов (отсечка 3 кДа - 5 мл).
  11. Определите концентрацию белка в надосадочной жидкости с помощью количественного анализа белка бицинхониновой кислоты (BCA) с использованием белка BSA в качестве стандарта.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При анализе SDS-PAGE загрузите 50 мкг белка для анализа.

3. Выделение белков клеточной стенки и клеточных мембран методом ультрацентрифугирования

  1. Выделите клеточную стенку, клеточную мембрану и цитозольные белки из лизата всей клетки в соответствии с протоколом Raja et al.9. как описано ниже.
  2. Центрифугируйте весь лизат клеток при 13751 × г при 4 °C в течение 30 минут, разделяя белки клеточной стенки в виде гранул.
  3. Надосадочную жидкость подвергают ультрацентрифугированию при 100 000 × г при 4 °C в течение 4 ч с использованием ультрацентрифуги, разделяя белки клеточной мембраны в виде гранул и оставляя цитозольные белки в надосадочной жидкости.
  4. Оцените концентрацию белка во фракциях клеточной стенки и клеточной мембраны с помощью анализа белка БЦА.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При анализе SDS-PAGE загрузите 50 мкг белка для анализа. Отделенная клеточная стенка и клеточная мембрана хранятся в морозильной камере при температуре -80 °C до дальнейшего анализа.

4. Препаративная жидкофазная изоэлектрическая фокусировка (Rotofor [аппарат IEF])

  1. Солюбилизируйте белки клеточной стенки и клеточной мембраны, выделенные ультрацентрифугированием, в буфере IEF, содержащем 8 М мочевины, 1 мМ DTT, 5% глицерина, 2% дигитонина.
  2. Добавьте 2% амфолитов (pH от 3,0 до 10,0 и pH от 4,0 до 6,0 в соотношении 1:4)
  3. Фракционируйте солюбилизированные белки с помощью жидкой системы IEF, поддерживаемой при температуре 4 °C с помощью охлаждающей водяной бани.
  4. Проводите разделение ВЭФ в соответствии с инструкциями производителя, применяя постоянную мощность 12 Вт до стабилизации напряжения (между 1300 В и 1600 В).
  5. Продолжайте работу ИЭФ еще в течение 30 минут после стабилизации напряжения, общее время работы составляет примерно 5-6 часов.
  6. Соберите отдельные фракции IEF с помощью вакуумного насоса и определите их значения pH.
  7. Подвергните отделенные фракции (50 мкг) воздействию SDS-PAGE и визуализируйте белки с помощью окрашивания Coomassie Brilliant Blue (CBB) или серебра. Храните отделенные фракции ИЭФ в морозильной камере при температуре -80 °C до дальнейшего анализа.

5. Препаративное вымывание SDS-PAGE и цельным гелем

  1. Смешайте фракции клеточной стенки и клеточной мембраны, разделенные IEF, с 6-кратным буфером для образцов SDS-PAGE и нагрейте до 95 °C в течение 5 минут перед анализом SDS-PAGE.
  2. Разделите белковые фракции во втором измерении с помощью полиакриламидных гелей диаметром 16 см 20 см, состоящих из 12,5% растворяющего геля и 4% укладывающего геля.
  3. Для загрузки образца используйте одну лунку для образца длиной 13 см.
  4. Проводите электрофорез при постоянном токе 50 мА/гель до тех пор, пока фронт красителя не достигнет дна геля.
  5. Уравновесьте гель в элюирующем буфере (60 мМ Трис, pH 9,4; 40 мМ 3-(Cyclohexylamino)-1-пропансульфоновая кислота [CAPS]) в течение 10 мин после проведения электрофореза.
  6. Перенесите гель в цельный аппарат для элютера геля, как описано производителем инструмента.
  7. Вымывайте белки из геля, запуская элютер при постоянном токе 250 мА в течение 1 ч.
  8. Соберите примерно 30 белковых фракций, каждая объемом 3 мл, из каждого геля с помощью вакуумного насоса.
  9. Количественно оцените концентрацию белка в элюированных фракциях с помощью анализа белка BCA.
  10. Подвергнуть 10 мкг элюированных фракций анализу SDS-PAGE и визуализировать окрашивание бриллиантовым синим цветом (CBB) от Coomassie.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Отделенные цельные фракции, покрытые гелевым покрытием, хранились в морозильной камере при температуре -80 °C до дальнейшего анализа.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Выделение белков клеточной стенки и клеточных мембран с помощью высокоскоростного ультрацентрифугирования
Белки клеточной стенки и мембраны были выделены из цельных клеточных лизатов с помощью ультрацентрифугирования, как описано в протоколе. Анализ SDS-PAGE разделенных субклеточных фракций — клеточной стенки, клеточной мембраны и белков цитозоля M. tuberculosis показан на рисунке 1.

Разделение белков клеточной стенки препарати...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Гидрофобная природа белков клеточной стенки и мембраны представляет значительные экспериментальные проблемы в их солюбилизации и разделении. В вышеупомянутом протоколе мы описали новый метод разделения на основе двумерного электрофореза для эффективной изоляции этих гидрофобных белков. В этом протоколе мы первоначально разделили белки мембраны и клеточной стенки на основе их изоэлектрических точек с помощью жидкой системы IEF. Для решения проблемы солюбилизации мы использовали высокую ко...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа полностью поддерживается грантом DST SERB доктора К. Р. Ума Деви. Д-р Б. Рамалингам был профинансирован стипендией DBT-Ramalingaswamy.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
7H9 бульон Himedia М198
40% био-лит 3/10 амфолита БИО-РАД1631113
Анализ белка БЦА МЕРКВСА1
Био-Лит 5/7 АмфолитБИО-РАД1631152
центробежные концентраторы 3 кДаМЕРКZ629456
Дигитонин.МЕРКД141
ДнасеМЕРК11284932001
ДТТМЕРКD9779
ЭДТАМЕРКЕ9884
ЭГТАМЕРКЕ3889
ГлицеринМЕРКГ5516
ЛойпептинМЕРКЕ18
Пепстатин АМЕРКП5318
ПМСФМЕРК78830
РнасеМЕРК10109134001
Rotofor БИО-РАД170-2986  аппарат изоэлектрической фокусировки (ИЭФ)
Ультразвуковой аппаратVibra-Cell, SonicsВК 750
ТЛСКМЕРКТ7254
ТПКМЕРК4376
мочевинаМЕРКУ5378
Цельный гель Eluter аппарат БИО-РАД1651250

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Seshadri, C., Turner, M. T., Lewinsohn, D. M., Moody, D. B., Van Rhijn, I. Lipoproteins are major targets of the polyclonal human T cell response to Mycobacterium tuberculosis. J Immunol. 190 (1), 278-284 (2013).
  2. Kunnath-Velayudhan, S., et al. Dynamic antibody responses to the Mycobacterium tuberculosis proteome. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (33), 14703-14708 (2010).
  3. Drage, M. G., et al. TLR2 and its co-receptors determine responses of macrophages and dendritic cells to lipoproteins of Mycobacterium tuberculosis. Cell Immunol. 258 (1), 29-37 (2009).
  4. Wallin, E., von Heijne, G. Genome-wide analysis of integral membrane proteins from eubacterial, archaean, and eukaryotic organisms. Protein Sci. 7, 1029-1038 (1998).
  5. Almeida, J. G., Preto, A. J., Koukos, P. I., Bonvin, A. M. J. J., Moreira, I. S. Membrane proteins structures: A review on computational modeling tools. Biochim Biophys Acta Biomembr. 1859 (10), 2021-2039 (2017).
  6. Finkelstein, J. Structures of membrane proteins. Nature. 511 ((Suppl 7509)), 21(2014).
  7. Smith, S. M. Strategies for the purification of membrane proteins. Methods Mol Biol. 1485, 389-400 (2017).
  8. Von Jagow, G., Link, T., Schager, H. Purification Strategies for Membrane Proteins. A Practical Guide to Membrane Protein Purification. , Academic Press. San Diego, CA. (1994).
  9. Raja, A., Uma Devi, K. R., Ramalingam, B., Brennan, P. J. Immunoglobulin G, A, and M responses in serum and circulating immune complexes elicited by the 16-kilodalton antigen of Mycobacterium tuberculosis. Clin Diagn Lab Immunol. 9 (2), 308-312 (2002).
  10. Covert, B. A., Spencer, J. S., Orme, I. M., Belisle, J. T. The application of proteomics in defining the T cell antigens of Mycobacterium tuberculosis. Proteomics. 1 (4), 574-586 (2001).
  11. Deenadayalan, A., et al. Immunoproteomic identification of human T cell antigens of Mycobacterium tuberculosis that differentiate healthy contacts from tuberculosis patients. Mol Cell Proteomics. 9 (3), 538-549 (2010).
  12. Sinha, S., et al. Immunogenic membrane-associated proteins of Mycobacterium tuberculosis revealed by proteomics. Microbiology. 151 (7), 2411-2419 (2005).
  13. Deenadayalan, A., et al. An Integrated approach for proteomic and immunological analysis of cell wall and cell membrane proteins of Mycobacterium tuberculosis. Med Res Arch. 11 (11), (2023).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

SDS PAGE

Похожие статьи