Методическая статья

На месте Выделение и культивирование стойких почвенных бактерий с помощью изоляционного чипа (iChip)

3.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/67692

⸱

6 августа 2025 г.

 ,  , ADSB-2024 Participant Cohort,  , 
1Department of Bioscience and Bioengineering, Indian Institute of Technology-Jodhpur, 2Department of Microbiology, Molecular Genetics, and Immunology, University of Kansas Medical Center

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

В этом протоколе описывается разработка и использование изолирующего чипа (iChip) для культивирования in situ стойких почвенных микробов в их естественной среде. В ней также описывается культивирование in situ почвенных бактерий, продуцирующих противомикробные препараты. Протокол может быть адаптирован для извлечения бактерий из различных ниш с другими желательными свойствами.

Аннотация

Экосистемы являются домом для миллионов микробов окружающей среды, некоторые из которых способны производить биотехнологически значимые продукты, такие как ферменты, витамины, аминокислоты, органические кислоты, антипаразитарные агенты и противомикробные агенты. Большинство из этих бактерий из окружающей среды считаются «непригодными для культивирования», поскольку лабораторные методы культивирования не удовлетворяют их требованиям к питанию и окружающей среде. Более того, поскольку они сосуществуют в природе, они также могут зависеть от питательного вещества/метаболита, производимого другим членом микробного сообщества. Привнесение «некультивируемого» микробного разнообразия в культуру даст возможность изучить широкий спектр биоактивных продуктов, которые они могут кодировать. В данной статье описывается реализация технологии iChip, многоканальной диффузионной камеры, разработанной для высокопроизводительного культивирования in situ «некультивируемых» бактерий. Учитывая глобальную угрозу устойчивости к противомикробным препаратам, в статье представлен подробный протокол культивирования in situ и извлечения изолятов из микробной «темной материи», способных продуцировать противомикробные агенты. В этом протоколе описываются необходимые этапы, начиная с этапа сбора проб почвы и заканчивая извлечением изолятов, и выделяются вероятные факторы, которые могут повлиять на успех изоляции. Использование этой технологии не только облегчает выделение «некультивируемых» бактерий для открытия антибиотиков, но и позволяет исследователям углубиться в сложную экологию почвы, которая затем может быть использована для множества других применений.

Введение

Богатые хранилища ранее неизученных микробов существуют в естественной среде, такой как почва, водоемы и экстремальные условия. Тем не менее, использовать это огромное биоразнообразие микробов непросто, поскольку большинство из них не поддаются легкому культивированию с использованием традиционных лабораторных сред и методов. Аномалия большого количества пластин описывает это явление, подчеркивая несогласованное количество микроорганизмов, которые можно наблюдать визуально, по сравнению с теми, которые растут в питательных средах1. Обход этого барьера и обеспечение доступа к некультивируемому разнообразию микробов и их продуктов может удовлетворить различные биотехнологические потребности.

Например, развитие устойчивости к противомикробным препаратам стало угрозой для глобального общественного здравоохранения. Крупные фармацевтические корпорации неохотно занимаются открытием новых противомикробных препаратов, в результате чего темпы открытий снижаются по сравнению с темпами возникновения устойчивости к существующимантибиотикам. Таким образом, существует острая потребность в открытии новых противомикробных препаратов4. Поскольку микробные сообщества развивались вместеили в конкурентной борьбе, они развили потенциал для производства новых химических соединений, которые повышают их шансы на выживание. Огромное разнообразие микробов окружающей среды и продуктов их переработки до конца не изучено, поскольку традиционные лабораторные методы, основанные на культурах, часто приводят к выделению похожих, известных микробов. Это связано с тем, что традиционные питательные среды и методы смещены в сторону выращивания микробов, имеющих отношение к человеку, и не могут имитировать естественную среду. Разработка питательных сред для культивирования микробов окружающей среды является сложной задачей, поскольку для роста некоторых видов могут потребоваться различные питательные вещества, часто производимые другими микробами поблизости, а также особые условия окружающей среды.

Для решения этой проблемы и культивирования микробов из окружающей среды in situ были впервые разработаны диффузионные камеры6. Диффузионная камера представляет собой уплотнительное кольцо из нержавеющей стали. Пространство внутри кольца заполняется агаром, засеянным соответствующим разведением образца. Верхняя и нижняя части кольца затем герметизируются поликарбонатными мембранами, которые обеспечивают диффузию питательных веществ и метаболитов, полученных из почвы, предотвращая проникновение других микробов в камеру6. После посева пластину помещают в среду, из которой собирается образец, чтобы обеспечить выращивание культуры на месте. Диффузионная камера была очень эффективной и привела к выращиванию многочисленных ранее некультивируемых микробов. Тем не менее, конструкция уплотнительного кольца с агаром стала трудоемкой и малопроизводительной, что оставило открытым проблемное пространство для дальнейших инноваций6. Вскоре после этогобыл разработан изолирующий чип (iChip), способный культивировать in situ и одновременно с высокой пропускной способностью восстанавливать чистые культуры. Эта конструкция концептуально аналогична диффузионной камере, но состоит из нескольких каналов, где каждый канал действует как независимая диффузионная камера, что позволяет потенциально извлекать одну микроколонию из каждой камеры8. Переосмысление конструкции диффузионной камеры значительно повысило производительность технологии и позволило выделить и выращивать большее биоразнообразие таксонов из почвы, морской воды9, горячих источников10 и т. д. Тейксобактин, недавно описанный антибиотик, был открыт с помощью технологии, описанной выше11. Он продемонстрировал новый механизм антимикробного действия и был признан смертельным в отношении патогенов, вызывающих инвазивные инфекции, демонстрируя, что высокопроизводительное выделение микробов из микробной «темной материи» может быть эффективно оптимизировано для открытия биотехнологически значимых природных продуктов с использованиемэтой технологии.

Данная статья служит методическим руководством по эффективному внедрению этой высокопроизводительной технологии для культивирования in situ и восстановления противомикробных неподатливых бактерий из почвенного микробного «темного вещества». В протоколе описывается конструкция изолирующего чипа, сбор образцов, подготовка образцов, посев, инкубация и восстановление. Несмотря на то, что представленный протокол демонстрирует культивирование микробов in situ из почвы, он может быть легко адаптирован для культивирования микробов in situ из любой среды. Высокая пропускная способность этой технологии может увеличить вероятность открытия новых микробов и использования их биосинтетического потенциала для различных биотехнологических приложений.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Дизайн и 3D-печать

  1. Выберите конструкцию и размер в зависимости от типа образца, объема на диффузионную камеру, размеров используемой мембраны и требуемой пропускной способности (количества диффузионных камер).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Толщина средней пластины и диаметр каждого канала определяют объем каждой цилиндрической диффузионной камеры. Размер зависит от количества отдельных диффузионных камер, которые должны быть размещены, а размеры мембраны напрямую зависят от количества охватываемых диффузионных камер (рис. 1).
  2. Используйте опцию вставки фигур в любой презентационной программе, чтобы вставить круги необходимых размеров, которые будут использоваться в качестве iChip. Вставьте внутрь круги меньшего размера, чтобы представить каналы. Расположите меньшие круги в нужном порядке, чтобы подготовить предварительный дизайн верхней/нижней и средней тарелок. Выберите дизайн и используйте контекстное меню, чтобы сохранить предварительный проект в виде изображения.
  3. Используя предварительный проект в качестве шаблона, начните создание двухмерного (2D) проекта с использованием программного обеспечения системы автоматизированного проектирования (САПР).
    1. В меню эскиза вставьте предварительно определенные формы, преимущественно круги, чтобы создать базовый дизайн пластин и массива каналов.
    2. Используйте параметр размер, чтобы задать фактические размеры пластин и каналов. Нажмите OK, чтобы завершить дизайн, а затем используйте функцию выдавливания, чтобы преобразовать 2D-дизайн в 3D-модель нужной толщины.
    3. Наконец, используйте меню «Сохранить », чтобы сохранить копию 3D-модели в формате стереолитографии (STL), совместимом с 3D-печатью.
  4. Выбирайте материал для печати в зависимости от желаемого применения, учитывая такие факторы, как предпочтительный метод стерилизации и место посадки. Например, выбирайте термостойкий материал, если для стерилизации будет использоваться автоклавирование или если они будут посажены на участке с высокой температурой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: 3D-печать для этого эксперимента была выполнена с использованием керамического материала, который может выдерживать высокие температуры до 268 °C и, следовательно, является автоклавируемым.
  5. Выберите подходящий метод 3D-печати, в зависимости от размеров (детализации и разрешения) и используемого материала.
    ПРИМЕЧАНИЕ: 3D-печать с использованием стереолитографии, метода аддитивного производства, позволяет создавать сложные структуры путем отверждения термореактивной смолы с помощью ультрафиолетового (УФ) лазера. Стереолитография может использоваться с различными материалами и обеспечивает превосходную обработку поверхности и высокое разрешение деталей.

2. Сбор образцов почвы

  1. Загрузите и установите мобильное приложение для геокодирования, которое позволяет идентифицировать объекты размером 3 х 3 м по всему миру, предоставляя уникальный адрес из 3 слов для сайта из любого магазина мобильных приложений. Определите место для сбора проб почвы. Затем откройте мобильное приложение геокодирования, чтобы определить интересующий вас сайт и его уникальный адрес из трех слов.
  2. Запишите уникальный адрес из трех слов, дату, время, глубину, на которой будет собран образец, погодные условия, растительный и животный мир поблизости, экспозицию участка и температуру участка (поверхность и подповерхность на желаемой глубине).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Почва может содержать болезнетворные бактерии. Поэтому используйте соответствующие средства индивидуальной защиты (перчатки, лабораторные халаты и т. д.) и следуйте протоколам, соответствующим уровню биобезопасности 2. Сведите к минимуму контакт для предотвращения загрязнения и воздействия пробы. Дезинфицируйте рабочую поверхность до и после работы с образцами почвы.
  3. Обеззаражьте лопату, распылив на нее 70% этанол и протерев ее. Обеззаражьте полистирольный ящик, в котором будет собираться почва, распылив в него 70% этанола и протерев начисто. Дайте остаткам этанола полностью высохнуть, прежде чем двигаться дальше.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Несмотря на то, что в этом протоколе для сбора образца и проведения инкубации используется полистирольная коробка, при желании также могут быть использованы альтернативы, такие как стеклянные и металлические контейнеры.
  4. Удалите с поверхности любой растительный материал, опавшие листья и/или камни, чтобы обнажить верхний слой почвы. Снова обеззарайте лопату, как и раньше, очистите верхний слой почвы и оцените почву на глубине 3-6 дюймов под поверхностью. С помощью линейки измерьте глубину от поверхности. С помощью стерилизованной лопаты соберите 4-5 кг грунта с нужной глубины в полистирольный ящик.
  5. Закупорьте коробку крышкой. Если необходимо собрать более одной пробы, обеззараживайте лопату между двумя участками отбора проб, чтобы избежать перекрестного загрязнения. После того, как все образцы будут собраны, немедленно перевезите их обратно в лабораторию.

3. Подготовка образцов к посеву

  1. Из собранного образца почвы взвесьте 1 г почвы, свободной от мусора, камней и опавших листьев, в стерильную центрифужную пробирку объемом 50 мл, содержащую 10 мл стерильного физиологического раствора.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сохраните часть образца почвы в виде запасов глицерина13,14 при -80 °C, чтобы сохранить местную микробную популяцию для будущих потребностей.
  2. Смешайте почву с солевым раствором, вортексируя в течение примерно 10 с, чтобы создать почвенную суспензию. Оставьте трубку центрифуги в неподвижном положении на 5 минут, чтобы крупные частицы почвы в трубке остыли. Затем осторожно переложите надосадочную суспензию почвы в свежую пробирку с маркировкой «S».
  3. Используя почвенную суспензию в качестве неразбавленного образца, выполняют серийное разведение, перекладывая 1 мл образца в 9 мл стерильного физиологического раствора в свежей пробирке. Готовят разведения от 10-1 до 10-5.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подсчет разбавленных почвенных суспензий на неселективных средах может дать некоторое представление о плотности бактерий в образце, которое может быть использовано для выбора подходящего разбавления для посева. Однако обратите внимание, что это только оценка культивируемых бактерий, присутствующих в образце.

4. Посев и сборка

  1. Внутри шкафа биобезопасности обеззаражьте верхнюю пластину, нижнюю пластину и среднюю пластину, замочив в 70% этаноле на 10 минут. Смойте излишки этанола, промыв пластины стерильной деионизированной водой, и дайте им высохнуть на воздухе в стерильной чашке Петри.
  2. Поместите среднюю тарелку в стерильную чашку Петри, готовую к посеву. Затем растопите среду SMS-агара в микроволновой печи, дайте ей остыть и перелейте 22,5 мл SMS-агара при 45 °C в центрифужную пробирку объемом 50 мл.
  3. К этому добавляют 2,5 мл соответствующего разбавления образца почвы и хорошо перемешивают путем щадящей инверсии, не допуская при этом внесения пузырьков воздуха.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите подходящее разведение для посева. Для достижения конечной плотности посева как при разведении 10-4 выбирайте суспензию 10-3 , так как образец будет дополнительно разбавлен в 10 раз в среде, используемой для посева.
    1. Выберите разведение посева, чтобы обездвижить 1 клетку в камере, которая затем может развиться в колонию in situ.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Дистиллированная вода также может быть использована вместо среды SMS для имитации почвенной среды и обеспечения роста микроорганизмов, которые растут только в таких условиях. По желанию противогрибковые средства, такие как циклогексимид, также могут быть добавлены в среду для предотвращения роста грибков.
  4. Медленно насыпьте 3-4 мл засеянной среды СМС агар на среднюю пластину, покрывая всю поверхность. Затем дайте среде СМС агар застыть примерно на 5-10 минут. Проверьте, установлен ли носитель СМС агар. Затем стерильным бритвенным лезвием соскребите излишки СМС-агара с поверхности пластины, оставив агаровые пробки в отдельных диффузионных камерах.
  5. Сняв защитный лист с одного из поликарбонатных мембранных фильтров размером 0,03 мкм, осторожно поместите его на внутреннюю сторону верхней пластины с помощью стерильных щипцов. Затем поместите еще один мембранный фильтр из поликарбоната 0,03 мкм на открытую сторону средней пластины с помощью стерильных щипцов.
  6. Поместите верхнюю и нижнюю пластины, сэндвич со средней пластиной и поликарбонатными мембранами, стараясь выровнять отверстия для винтов во всех пластинах, чтобы завершить сборку (Рисунок 1B). Затяните гайки и болты для фиксации узла.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Хорошей практикой является параллельная сборка контрольного чипа iChip только из стерильного SMS-агара, без посева, и посадка его в почву вместе с засеянным для проверки герметичности. Это исключило бы возможное попадание микробов из окружающей среды и выступило бы в качестве негативного контроля.

5. Культивирование и восстановление in situ

  1. Создайте углубление большего размера, чем iChip, в почве, собранной в полистирольный ящик, с помощью стерильной лопаты. Установите сборку вертикально в углублении и плотно присыпьте почвой, убедившись, что все поверхности полностью покрыты. Затем разрешите выращиванию на месте в течение желаемого периода от 2-4 недель. Во время инкубации используйте стерильную дистиллированную воду для периодического увлажнения почвы, чтобы предотвратить высыхание засеянных пробок агара SMS в диффузионных камерах.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Размещение сборки в вертикальном положении предотвращает непрерывное просачивание воды через диффузионные камеры во время регулярного увлажнения почвы, что может произойти при горизонтальной посадке.
  2. После желаемой инкубации аккуратно вытесните почву вокруг посаженного чипа, чтобы восстановить его. Затем промойте его стерильным физиологическим раствором, чтобы удалить прилипшие частицы почвы, и перенесите в шкаф биобезопасности для дальнейшей обработки.
  3. Открутите гайки и болты от узла. Затем аккуратно разберите его. С помощью стерильных щипцов снимите поликарбонатные мембраны и перенесите среднюю пластину в подготовленную чашку Петри.
  4. Используйте стерильные деревянные аппликаторы для извлечения отдельных агаровых пробок в каждой диффузионной камере. Внесите пробки агара в соответствующие среды, такие как агар SMS или агар 0,1x триптический соевый бульон, чтобы попытаться культивировать в лаборатории.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Культивируемые изоляты затем могут быть проверены на антимикробную продукцию обычными методами, такими как наложение агара15.
  5. В качестве альтернативы можно окрашивать и визуализировать восстановленные агаровые пробки, содержащие in situ культивируемые неподатливые почвенные бактерии, чтобы подтвердить рост микроколоний в условиях in situ .
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для повышения чувствительности обнаружения измельченную агаровую пробку также можно окрашивать флуоресцентными красителями, которые могут окрашивать бактерии, с последующей флуоресцентной микроскопией.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Чип iChip, используемый в этом протоколе, был спроектирован, напечатан на 3D-принтере и собран, как показано на рисунке 1. Обзор описанного протокола показан на рисунке 2. Образец почвы, использованный для эксперимента, был собран в кампусе IIT Jodhpur в Раджастхане, Индия. Уникальный адрес местоположения, состоящий из трех слов, был «communicate.supervising.recurrence». Выбранное место представляло собой полузасушливую зону с температурой 40 °C в день отбора пр...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Многочисленные уникальные места обитания на Земле являются домом для различных микробных сообществ, которые представляют собой огромное разнообразие. Это остается неизученным из-за ограничений в обеспечении соответствующих условий выращивания, необходимых для их выращивания. Выживание некоторых бактерий зависит от метаболитов, выделяемых другими, и поэтому они не могут выжить самостоятельно в лабораторных условиях. Кроме того, бактерии также играют решающую роль в организации биогеохимич...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не раскрывают конфликта интересов.

Благодарности

Проект A.V. был поддержан программой исследовательских стипендий премьер-министра (PMRF) правительства Индии. Программа V.V. была поддержана программой Innovation in Science Pursuit for Inspired Research Fellowship (INSPIRE) Департамента науки и технологий правительства Индии. Визит И.Б. был частично профинансирован стипендией Фулбрайта APE от USIEF. Авторы благодарят Департамент бионауки и биоинженерии и Индийский технологический институт Джодхпура за логистическую поддержку и предоставление инфраструктуры для этой работы. Выражаем благодарность за техническую помощь д-ру Сударшне Неги, г-же Астхе Капур, г-ну Тамалу Дею, г-ну Бхарату Парику, г-ну Аджиту Сингху и другим сотрудникам Лаборатории микробной физиологии ИИТ Джодхпура.

Когорта участников ADSB-2024

Когорта участников краткого курса «Открытие антибиотиков в почвенных бактериях» (ADSB) 2024, организованного на факультете бионауки и биоинженерии Индийского технологического института в Джодхпуре (имена перечислены в алфавитном порядке):

Абинаш Кумар Джена, Банишри Джали, Бхарат Гурнани, Бхарат Парик, Дипро Мукерджи, Гарима Канвар Шекхават, Г.Т. Вишну, Джайита Саркар, Кришна Сахаран, Крити Сингхал, Лекх Радж, Митта Биндусри, Пхулен Сарма, Приянка Кумари, Рачана Динеш, Сатьендра Сингх и Свати Суджит

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
3D-принтерProtolabs, США1631-833Поставщик услуг 3D-печати
Agarose Himedia, ИндияMB002Медиа компонент
Casamino AcidsSisco, Индия68806Медиа компонент
Казеин Digest ASES, ИндияC5890Медиакомпонент
Поликарбонатная мембранаSterlitech, СШАPCT00347100Расходные материалы
Картофельный крахмалHimedia, ИндияGM403Медиакомпонент
PowerPointMicrosoft, СШАн/дИспользуется для создания компонентов iChip Предварительное проектирование
PTC CreoPTC, СШАн/дИспользуется для 3D компьютерных систем моделирование компонентов iChip
Tryptic Soy BrothHimedia, IndiaM011Лабораторная среда
What3WordsWhat3Words, UKN/AИспользуется для записи координат места отбора проб

Ссылки

  1. Ekkers, D. M., Cretoiu, M. S., Kielak, A. M., Van Elsas, J. D. The great screen anomaly-a new frontier in product discovery through functional metagenomics. Appl Microbiol Biotechnol. 93 (3), 1005-1020 (2012).
  2. da Cunha, B. R., Fonseca, L. P., Calado, C. R. C. Antibiotic discovery: Where have we come from, where do we go. Antibiotics. 8 (2), 8020045(2019).
  3. Rafiq, M., et al. Challenges and approaches of culturing the unculturable archaea. Biology. 12 (12), 1499(2023).
  4. Miethke, M., et al. Towards the sustainable discovery and development of new antibiotics. Nat Rev Chem. 5 (10), 726-749 (2021).
  5. Liu, X., Wang, M., Nie, Y., Wu, X. L. Isolation chip increases culturable bacterial diversity and reduces cultivation bias. Curr Microbiol. 78 (5), 2025-2032 (2021).
  6. Bollmann, A., Lewis, K., Epstein, S. S. Incubation of environmental samples in a diffusion chamber increases the diversity of recovered isolates. Appl Environ Microbiol. 73 (20), 6386-6390 (2007).
  7. Nichols, D., et al. Use of iChip for high-throughput in situ cultivation of "uncultivable" microbial species. Appl Environ Microbiol. 76 (8), 2445-2450 (2010).
  8. Polrot, A., Kirby, J. R., Olorunniji, F. J., Birkett, J. W., Sharples, G. P. iChip increases the success of cultivation of TBT-resistant and TBT-degrading bacteria from estuarine sediment. World J Microbiol Biotechnol. 38 (10), (2022).
  9. Jung, D., Liu, L., He, S. Application of in situ cultivation in marine microbial resource mining. Mar Life Sci Technol. 3 (2), 148-161 (2021).
  10. Zhao, J., Shakir, Y., Deng, Y., Zhang, Y. Use of modified iChip for the cultivation of thermo-tolerant microorganisms from the hot spring. BMC Microbiol. 23 (1), (2023).
  11. Piddock, L. J. V. Teixobactin, the first of a new class of antibiotics discovered by ichip technology. J Antimicrob Chemother. 70 (10), 2679-2680 (2015).
  12. Lodhi, A. F., Zhang, Y., Adil, M., Deng, Y. Antibiotic discovery: combining isolation chip (iChip) technology and co-culture technique. Appl Microbiol Biotechnol. 102 (17), 7333-7341 (2018).
  13. Sessitsch, A., Gyamfi, S., Stralis-Pavese, N., Weilharter, A., Pfeifer, U. RNA isolation from soil for bacterial community and functional analysis: evaluation of different extraction and soil conservation protocols. J Microbiol Methods. 51 (2), 171-179 (2002).
  14. Enright, D. J., Quaal, R., Verabeehu, A., Nguyen, A., Maddox, J., Glassman, S. I. Evaluating Best Practices for Isolating Pyrophilous Bacteria and Fungi from Burned Soil. bioRxiv. , (2024).
  15. Nkanga, E. J., Hagedorn, C. Detection of antibiotic-producing Streptomyces inhabiting forest soils. Antimicrob Agents Chemother. 14, 51-59 (1978).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

in situ

Похожие статьи