Методическая статья

Трехмерный протокол дифференцировки клеток нервного гребня черепа in vitro для мультиплексного анализа

DOI:

10.3791/67695

⸱

14 февраля 2025 г.

 ,  , 
1Université Paris Cité, CNRS, Inserm, Institut Cochin

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы представляем трехмерный (3D) протокол дифференцировки in vitro , генерирующий нейросферы воспроизводимого размера для производства клеток черепного нервного гребня из эмбриональных стволовых клеток мыши. Мы показываем, что эта методология снижает вариабельность по сравнению с предыдущими протоколами и как она может быть использована для мультиплексного анализа для изучения развития клеток черепного нервного гребня.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Обладая замечательной способностью генерировать как эктодермальные, так и мезенхимальные производные, клетки черепного нервного гребня (CNCC) привлекли большой интерес к изучению механизмов, регулирующих решения о судьбе и пластичность клеток. Возникнув в дорсальном нейроэпителии, эта клеточная популяция является преходящей и относительно редкой в развивающемся эмбрионе, что затрудняет проведение функциональных тестов, геномных скринингов и биохимических анализов in vivo. Чтобы преодолеть эти ограничения, было разработано несколько методов моделирования развития CNCC in vitro. Методы культивирования, основанные на нейросфере (NS), обеспечивают сложное микроокружение, которое повторяет развивающийся передний нейроэпителий в 3D. Эти системы позволяют выращивать много NS в одной и той же пластине для получения большого количества CNCC, но полученные NS имеют высокую вариабельность формы, размера и количества образующихся CNCC, что затрудняет проведение количественных анализов. В этом протоколе описан воспроизводимый метод получения NS из эмбриональных стволовых клеток мыши (mESC) в формате 96 лунок. НС, генерируемые в 96-луночных планшетах, производят клетки черепного нервного гребня (CNCC), которые могут быть дополнительно культивированы. Контролируя количество исходных ячеек, этот подход уменьшает вариабельность размера и формы между NS и повышает воспроизводимость в экспериментах. Наконец, эта система культивирования может быть адаптирована к нескольким приложениям и обеспечивает более высокую степень гибкости, что делает ее легко настраиваемой и пригодной для экспериментальных условий мультиплексирования.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Клетки нервного гребня черепа (CNCC) представляют собой популяцию стволовых клеток, которая возникает в самой передней части развивающегося эмбриона, на границе между нервной пластинкой и поверхностной эктодермой1. Затем CNCC подвергаются эпителиально-мезенхимальному переходу (EMT), отделяются от нейроэпителия и мигрируют дорсовентрально к различным местам эмбриона, где они дифференцируются в широкий спектр типов клеток2. Изучение этой клеточной популяции представляет большой интерес, поскольку она обладает замечательной пластичностью3 и уникальной способностью дифференцироваться как в эктодермальные, так и в мезенхимальные производные, такие как черепно-лицевые кости и хрящи4. Несмотря на то, что CNCC относительно доступны в эмбрионах, они представляют собой транзиторную популяцию с низким количеством клеток, что затрудняет проведение системных механистических исследований in vivo. В последние несколько лет клеточные линии CNCC были выделены и охарактеризованы для преодоления этих ограничений. В частности, клеточная линия O9-1 CNCC является отличным инструментом для изучения мигрирующего и постмиграционного развития нервного гребня 5,6; Однако эта клеточная линия не позволяет изучать ранние события, предшествующие миграции, что приводит к индукции и спецификации нервного гребня. В связи с этим были достигнуты значительные успехи в разработке протоколов дифференцировки in vitro для дифференцировки CNCC в чашке с использованием 3D-структур, напоминающих развивающийся нейроэпителий, называемый нейросферами (NS)7,8-, полученными после дифференцировки колоний эмбриональных стволовых клеток (ЭСК). Эти 3D-протоколы надежно производят большое количество CNCC, что позволяет проводить биохимические и геномные механистические исследования 9,10. NS культивируют на пластинах с низким прикреплением в среде с добавками N2B27 вместе с фактором роста фибробластов (FGF) и эпидермальным фактором роста (EGF)10,11 для стимуляции пролиферации клеток. Эти протоколы проводят в чашках Петри, культивируя многочисленные НС в одной и той же тарелке. В растущем НС клетки агрегируются и продолжают делиться, достигая при созревании диаметра 100-200 мкм. При созревании (примерно на 5-й день) NS прикрепляются к субстрату и дифференцируются в CNCC, напоминая их in vivo аналоги 9,12. Затем эти ЧПУ проходят ЭМП и расслаиваются на поверхности пластины. Морфологические различия могут наблюдаться в зависимости от размера NS, так как более крупные сферы будут казаться темнее в ядре из-за меньшей доступности питательных веществ и кислорода, что приведет к апоптозуклеток 13. Несмотря на то, что этот тип процедуры генерирует большое количество CNCC в конечной точке дифференцировки, он имеет ряд ограничений, что делает изучение различной молекулярной динамики, происходящей в процессе дифференцировки, практически невозможным. Во-первых, использование колоний ЭСК, которые различаются по размеру, затрудняет контроль начального количества клеток для каждого эксперимента. Это приводит к образованию НС различной формы и диаметра, которые развиваются по-разному за счет активации специфических сигнальных путей, что приводит к изменению дифференцировки клеток и, таким образом, не образует однородную выборку в данный момент времени. Во-вторых, культивирование нескольких NS в одной пластине часто приводит к тому, что они сливаютсявместе и потенциально высвобождают сигнальные молекулы, которые влияют на микроокружение их соседей и, таким образом, на их развитие. В целом, эти процедуры порождают большую вариативность между образцами и экспериментами.

В данной статье мы представляем стратегию преодоления этих трудностей, которая позволяет создавать одиночные НСЗ, способные производить CNCC, путем агрегации мышиного ESC (mESC) в 96-луночных планшетах с U-образным дном, не обработанных TC. Начиная с mESC позволяет изучить процесс спецификации и ранние стадии развития CNCC по сравнению с началом работы с уже созданными линиями клеток нервного гребня. Этот протокол начинается с дезагрегации колоний mESC для получения суспензии одиночных клеток, за которым следует посев определенного количества mESC в каждую лунку 96-луночного планшета с U-образным дном, не обработанным TC. Ячейки оставляют для агрегатирования в течение двух дней, а затем перемещают в 96-луночный планшет с плоским дном, не обработанный ТС, в котором NS сможет прикрепиться к дну планшета. Контролируя количество исходных клеток и микроокружение каждой NS в процессе дифференцировки, этот протокол снижает вариабельность образца, что повышает воспроизводимость эксперимента. Мы считаем, что это будет удобная платформа для разработки мультиплексных экспериментов, таких как тестирование влияния различных условий культивирования или проведение скрининга генных возмущений.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Получение суспензии одиночных клеток из колоний ESC мышей

Примечание: Данный протокол адаптирован к использованию CK35 mESC (линия mESC, отвечающая за передачу зародышевой линии, чтобы затем иметь возможность разработки in vivo модели15), выращенной на инактивированных питателях в покрытом желатином 6-луночном планшете, обработанном TC. Одна скважина из 6-луночной пластины, обработанной ТС, должна давать примерно 1,5 × 106 мЭСК, что достаточно для остальной части протокола. При необходимости его можно масштабировать. Отрегулируйте начальные шаги в соответствии с выбранным штаммом ESC и методом поддерживающей культуры, а также с подходящей питательной средой. Этот протокол должен выполняться в стерильных условиях. Подробные сведения обо всех материалах, реагентах и оборудовании, используемых в этом протоколе, см. в Таблице материалов .

  1. Начните с mESC при 70%-80% конфлюенции, выращенной в культуральной среде mESC. В таблице 1 приведен состав питательной среды mESC, использованный в данном исследовании.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не позволяйте mESC разрастаться более чем на 80% слиянию, так как они начнут дифференцироваться, и это повлияет на процесс агрегации. Колонии должны быть компактными и иметь здоровую морфологию (без трещин и волн, отчетливый ядерно-цитоплазменный контраст).
  2. Приготовьте среду для дифференцировки ЧПУ. В таблице 1 приведен состав среды для дифференцировки CNCC.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После добавления факторов роста среду можно хранить до 3 недель при температуре 4 °C. Убедитесь, что среда защищена от света.
  3. Приготовьте свежий раствор коллагеназы в концентрации 2 мг/мл в среде DMEM-Knockout.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Использование коллагеназы гарантирует, что отделятся только колонии, а не питающиеся, так как их присутствие на следующих этапах будет мешать агрегации НС. Перед применением отфильтровать раствор коллагеназы с помощью фильтра 0,22 мкм.
  4. Аспирируйте среду ESC из mESC.
  5. Аккуратно добавьте 1 мл PBS на стенку лунки. Осторожно покачивайте пластину, чтобы обеспечить равномерное мытье.
  6. Удалите PBS и замените 2 мл раствора коллагеназы. Выдерживать при температуре 37 °C в течение 30-45 минут.
    1. Проверяйте пластину под световым микроскопом при 10-кратном увеличении после первых 20 минут, а затем каждые 5 минут.
    2. Когда колонии обнаружат загнутые края, энергично постучите по стороне пластины, и колонии отделятся.
  7. С помощью серологической пипетки объемом 5 мл соберите колонии и перенесите их в коническую пробирку объемом 15 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Проверьте планшет под световым микроскопом на наличие остатков колоний. Их можно собрать с помощью промывки PBS.
  8. Центрифугируйте колонии при 16 × г в течение 3 мин при комнатной температуре (RT).
  9. Отсасывайте как можно больше среды из конической трубки, стараясь не потревожить колонии на дне трубки.
  10. Добавьте 1 мл 0,05% раствора трипсина и инкубируйте пробирку при 37 °C в течение 5 минут.
  11. Диссоциируйте колонии в пробирке путем энергичного пипетирования вверх и вниз, сначала с помощью микропипетки p1000, а затем с помощью микропипетки p200.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это обеспечивает удержание одноклеточной суспензии.
  12. Добавьте 2 мл питательной среды mESC для блокирования трипсина и центрифугируйте при 160 × г в течение 3 мин при RT. Удалите надосадочную жидкость и добавьте 1 мл среды для дифференцировки CNCC.
  13. Подсчитайте ячейки с помощью автоматизированного устройства подсчета клеток или стандартизированной системы под микроскопом, следуя инструкциям производителя.
  14. После подсчета разбавляют достаточным количеством дифференцировочной среды CNCC для получения концентрации 3000 живых клеток на 50 мкл.
  15. С помощью микропипетки p200 засейте 50 мкл клеточной суспензии в каждую лунку 96-луночного планшета, не обработанного ТЦ, затем долейте до 200 мкл среду для дифференцировки CNCC.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При заполнении планшета время от времени ресуспендируйте суспензию одиночных клеток с помощью микропипетки p1000 для получения однородной концентрации.
  16. Инкубировать в течение ночи в инкубаторе при температуре 37 °C, 5%CO2.

2. Перенос в 96-луночный планшет с плоским дном для дифференциации CNCC

  1. На следующий день (день 1) понаблюдайте за пластиной под световым микроскопом. Убедитесь, что на дне каждой лунки виден один небольшой кластер ячеек с четкими границами. Поставьте тарелку обратно в инкубатор на ночь.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вокруг основного агрегата могут быть какие-то клетки, какие-то мертвые. Это не помешает агрегации NS.
  2. На 2-й день медленно удалите по 100 мкл среды из каждой лунки.
    1. При аспирации среды будьте осторожны, чтобы не удалить NS. Чтобы избежать этого, расположите наконечник пипетки близко к поверхности и вдали от дна.
  3. Отрежьте кончик микропипетки p200 примерно на 3-4 мм от кончика. Используйте это для аспирации NS с оставшейся средой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы облегчить захват NS, осторожно проводите пипеткой вверх и вниз пару раз перед аспирацией.
  4. Перенесите NS и оставшуюся среду в 96-луночный планшет с плоским дном, не обработанным ТС, и проверьте перенос под световым микроскопом, затем добавьте в каждую новую лунку 100 мкл предварительно подогретой среды для дифференцировки CNCC. Оставьте NS в инкубаторе при температуре 37 °C, 5%CO2, до 4 дня.
  5. На 4-й день удалите по 100 мкл среды из каждой лунки и замените ее 100 мкл предварительно подогретой среды для дифференцировки CNCC.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы не нарушить прикрепление NS в нижней части планшета, медленно отсасывайте и заменяйте среду.
  6. На 5 и 6 день проверьте насадку NS под световым микроскопом. Убедитесь, что более светлые элементы - расслаивающиеся из NS -начинают окружать основной корпус NS.
  7. На 7 день смените среду, как описано в пункте 2.5. Меняйте среду с помощью одной и той же процедуры каждые 2 дня до конечной точки исследования.

3. Приемка и техническое обслуживание CNCC

ПРИМЕЧАНИЕ: Пассирование CNCC может быть выполнено, как только вокруг NS будет видно достаточное количество клеток. Это может произойти уже на 7-й день, так как более ранние временные точки не обеспечивают достаточного количества CNCC.

  1. Подготовьте среду для технического обслуживания CNCC. В таблице 1 приведен состав среды для технического обслуживания CNCC.
    1. Перед добавлением его в среду отфильтруйте БСА после солюбилизации через фильтр 0,22 мкм. После добавления факторов роста храните среду до 3 недель при температуре 4 °C. Убедитесь, что среда защищена от света.
  2. Готовят фибронектин в концентрации 7,5 мкг/мл в PBS. Энергично перемешайте.
  3. Покройте лунки 96-луночного планшета, обработанного без ТС, добавив 100 мкл раствора фибронектина на лунку. Оставьте пальто под капюшон на 30 минут при температуре RT.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если CNCC предназначены для иммунофлуоресцентного окрашивания, поместите стерильный стеклянный покровный стеклоподъемник на дно лунки перед нанесением покрытия. Следите за тем, чтобы предметное стекло оставалось на дне лунки и не плавало, чтобы избежать покрытия противоположной стороны от той, которая будет использоваться. Следуйте инструкциям в разделе 5 по фиксации и монтажу CNCC.
  4. В то же время, в 96-луночном планшете с плоским дном, обработанным без ТЦ, отасканируйте как можно больше дифференцировочной среды CNCC из лунок и замените ее 50 мкл аккутазы. Выдерживать при температуре 37 °C в течение 5 минут.
  5. После инкубации добавьте 100 мкл поддерживающей среды CNCC в лунку, чтобы погасить аккутазу. Удалите фибронектин из лунок принимающей 96-луночной пластины с плоским дном, не обработанной ТС. Отфильтруйте отделенные постмиграционные ХНК, пропустив их через фильтр 40 мкм в верхней части лунки принимающей 96-луночной пластины с плоским дном, не обработанным ТС.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это позволит отфильтровать скопления клеток или оставшиеся НС, которые ранее не были удалены. CNCC, выращенный в одинаковых условиях, может быть объединен в одну пробирку объемом 50 мл, а затем засеян в ту же лунку, что и 6-луночный планшет, обработанный TC. В этом случае покройте лунку 1 мл фибронектина и используйте 1 мл поддерживающей среды CNCC для гашения аккутазы.
  6. Дайте постмиграционному CNCC прикрепиться в течение 15-30 минут при температуре 37 °C. Выбросьте среду и замените ее 100 μл технической среды CNCC. Меняйте среду каждые 2 дня.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Осторожно добавляйте среду, так как быстрый поток вызывает дифференцировку CNCC в нейронные производные. При работе в 6-луночном формате используйте 1 мл поддерживающей среды CNCC.

4. Фиксация и крепление NS для иммунофлюоресценции

  1. В нужный момент времени перенесите NS из 96-луночного планшета с плоским дном, не обработанным TC, в пробирку с низким связыванием ДНК объемом 2 мл, разрезав кончик микропипетки p200, и осторожно пипетируйте вверх и вниз, чтобы собрать NS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В более поздние моменты времени (день 7 и далее) NS будет достаточно большим, чтобы его можно было увидеть глазом, но его также будет труднее отделить.
  2. Дайте NS отстояться в пробирке в течение 3 минут при RT, удалите как можно больше среды и промойте 1 мл холодной PBS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При переносе малых NS из ранних временных точек (до 3-4 дней) вращайтесь со скоростью 16 × g в течение 3 минут, чтобы убедиться, что NS оседают на дно.
  3. Снимите PBS и в химическом колпаке замените 2 мл 4% PFA в PBS. Инкубировать в течение 20 минут при RT.
    1. Медленно переверните трубку после добавления 4% раствора PFA и дайте ей отдохнуть во время фиксации на боку. Цель состоит в том, чтобы немного раздвинуть НС, чтобы они не слипались на этом этапе.
  4. Удалите 4% раствор PFA (в химической вытяжке) и промойте NS 1 мл холодного PBS/0,5% Tween20. Дайте ему отстояться при RT в течение 3 минут. Повторите это всего 3 раза.
    ПРИМЕЧАНИЕ: NS осядет на дне.
  5. Удалите PBS/0,5% Tween20 и добавьте 2 мл PBS/0,1% Triton X-100. Переверните трубку и дайте ей откоситься сбоку. Инкубировать в течение 1 ч при РТ.
  6. Промойте NS 3 раза в холодном PBS/0,5% Tween20, как указано в шаге 4.4.
  7. Удалите PBS/0,5% Tween20 и заблокируйте 2% BSA в PBS при 4 °C минимум на 1 час, желательно на ночь.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы могут храниться в 2% BSA/PBS до 1 недели при температуре 4 °C. Беречь от света.
  8. Приготовьте раствор первичного антитела путем добавления правильного разведения первичного антитела до 2% БСА/ПБС в конечном объеме 500 мкл. Первичная смесь антител, использованная в этом исследовании, приведена в таблице 2.
  9. Удалите как можно больше блокирующего раствора и перенесите NS в пробирку объемом 0,5 мл, разрезав кончик микропипетки p200.
  10. Добавьте первичный раствор антитела и медленно пипетка вверх и вниз, чтобы ресуспендировать NS. Инкубировать в течение ночи на ротаторе при температуре 4 °C.
  11. Промойте NS 3 раза в холодном PBS в течение 5 минут при RT.
  12. Приготовьте раствор вторичного антитела, разбавив вторичные антитела по выбору в 2% BSA/PBS и добавив 1/1000 DAPI. Вторичная смесь антител, использованная в этом исследовании, приведена в таблице 2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Держите трубки в защищенном от света месте.
  13. Замените PBS 500 мкл раствора вторичного антитела и оберните пробирку алюминиевой фольгой, чтобы защитить ее от света. Инкубировать в течение 1 ч на ротаторе при РТ.
  14. Промойте NS 3 раза в холодном PBS, как указано в пункте 4.11.
  15. Удалите как можно больше PBS без аспирации NS, замените 50 мкл очищающего агента и следуйте инструкциям производителя.
  16. Инкубировать в течение ночи в RT, защищенном от света месте.
  17. Подготовьте монтажные камеры.
    1. На предметное стекло микроскопа положите три слоя двустороннего скотча. Используйте прозрачную ленту без волокон, чтобы избежать остатков в монтажной камере.
    2. С помощью бритвы вырежьте в двойной ленте окошко диаметром от 3 мм × 8 мм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Размеры камеры зависят от точки времени выборки. Этот пример подходит для размещения 50 μL монтажной среды, что оптимально для 10-20 одиночных NS в более поздние временные точки (дни 7-9).
  18. Под стереоскопом осторожно перенесите NS в очищающем агенте в монтажную камеру, разрезав наконечник микропипетки p200 с низкой адгезией. Используйте увеличение от 2x до 4x, чтобы обеспечить поле зрения всей камеры и достаточное увеличение для идентификации NS. Если стереоскоп оснащен для флуоресцентной визуализации, работа с синим флуоресцентным фильтром облегчит идентификацию НС, так как окрашивание DAPI выделит прозрачную НС.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что среда образует небольшой выпуклый мениск над камерой. Это обеспечит отсутствие пузырьков в камере.
  19. Положите покровное стекло на поверхность и слегка надавите на его боковые стороны, чтобы он прилипал. Выполните этот шаг под стереоскопом и убедитесь, что NS не выталкиваются за пределы камеры.
  20. Хранить при температуре 4 °C в защищенном от света месте до момента визуализации.

5. Фиксация и крепление CNCC для иммунофлюоресценции

  1. Удалите техническую среду CNCC из лунок и промойте их PBS. Аккуратно добавьте PBS с помощью пипетки на боковой стороне лунки.
  2. Продолжайте фиксировать, пермеабилизацию и окрашивание, как описано в шагах 4.3-4.14.
  3. Закрепите покровные стекла на предметном стекле для микроскопии, добавив монтажный материал на предметное стекло, захватив и повернув покровное стекло с помощью пинцета так, чтобы постмиграционный CNCC был обращен к стеклянному предметному стеклу, и поместив его на каплю.
    1. Дополнительно: Запечатайте покровное стекло лаком для ногтей или другими широко используемыми уплотнительными системами.
  4. Хранить при температуре 4 °C в защищенном от света месте до момента визуализации.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В соответствии с протоколом колонии mESC были диссоциированы, и 3000 клеток были засеяны в 96-луночные планшеты, не обработанные TC. На 2-й день агрегированные NS были перенесены в 96-луночные планшеты с плоским дном, не обработанные TC, чтобы их можно было прикрепить. Упрощенная визуализация протокола агрегации NS представлена на рисунке 1A. НС культивировали до 9-го дня, а затем обрабатывали для иммунофлуоресцентного окрашивания. Клетки, которые мигрировали из NS на планшет, переносили в п...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Модели 3D-дифференцировки in vitro позволяют анализировать сложные клеточные взаимодействия, которые могут быть затруднены или не могут наблюдаться в двухмерных культурах клеток. Было разработано несколько моделей для изучения развития CNCC in vitro. Как правило, они получают непосредственно из колоний ЭСК 7,21 или тканевых эксплантов22,23. Несмотря на т...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим доктора Реми Ксавье Коу за советы по разработке праймеров и опыт в области клеточных культур. Эта работа была поддержана Европейским исследовательским советом (ERC Starting Grant 101039995 - REGENECREST) и Fondation pour la Recherche Médicale (Amorçage - AJE202205015403).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,22 μ м шприцевые фильтрыClearLine146560
15 мл Прозрачная полипропиленовая коническая трубкаFalcon352096
200 &; L ClearLine Plus Фильтрующие наконечники с низким связываниемDutscher713263
40 &микро; m фильтрыFalcon352340
5 мл Серологическая пипеткаStarstedt86.1253.001
50 мл Высокопросветная полипропиленовая коническая трубкаFalcon352070
AccutaseMerck-SigmaA6964
Alexa Fluor 488 осел анти кролик IgG (H+L)Thermofisher ScientificA21206
Alexa Fluor 594 осел анти мышь IgG (H+L)Thermofisher ScientificA21203
Alexa Fluor 647 осел антикозий IgG (H+L)Thermofisher ScientificA31571
Антибиотик-антимикотический раствор Merck-SigmaA5955
B27 PLUS добавкаThermofisher Scientific17504044
Бычий сывороточный альбумин (БСА)Merck-SigmaA9418
ХлороформCarlo Erba438601
коллагеназой типа IVThermofisher Scientific, Gibco17104019
Costar 6 хорошо прозрачных многолуночных планшетовCorning3516
Защитные стекла, круглыеVWR  630-2113 
DMEM KnockOutThermofisher Scientific10829018
DMEM/F12+GlutamaxThermofisher Scientific10565018
DMEM с высоким содержанием глюкозыMerck-SigmaD0822
DNA LoBind  Пробирки, 2 млEppendorf30108078
дистиллированной воде без ДНКазы/РНКазыThermofisher Scientific10977-035
Dulbecco' s Фосфатно-солевой буфер (PBS)Thermofisher Scientific14190144
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 0,5 млEppendorf30121023
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 2 млEppendorf30120094
ESGRO mLIF Средняя добавкаMerck-SigmaESG1107
этанол 70%Carlo Erba528170
Fetal Бычья сывороткаMerck-SigmaF7524
ФибронектинMerck-SigmaF085-2MG
Fluoromount-GInvitrogen00-4958-02
Желатиновый растворMerck-SigmaES-006-B
GlutaMAXThermofisher Scientific35050061
человека EGFPeprotechAF-100-15-500UG
Человеческий FGF-basicPeprotech100-18B
Антитела человека к SOX9R& DsystemsAF3075
Инсулин из поджелудочной железы крупного рогатого скотаMerck-SigmaI6634
iScript набор для синтеза кДНКBiorad1708891
мыши Антитело человека AP-2 альфа моноклональное антитело, неконъюгированноеDSHB3B5
Мышиное антитело против человека PAX7 Моноклональное антитело, неконъюгированная
N2Thermofisher Scientific17502048
Нейробазальная средаThermofisher Scientific21103049
Планшет с нетканевыми культурами, 96 лунок, ПлоскодонныйFalcon351172
Планшет с нетканевыми культурами, 96 лунок, U-образное дноFalcon351177
Параформальдегид 16% раствор, em gradeЭлектронная микроскопия Sciences15710
Propan-2-olCarlo Erba415154
Очищенный антитубулин β 3 (TUJ1) АнтителоBiolegendMMS-435P
RapiClear 1.47Sunjin LabRC147001
RapiClear 1.52Sunjin LabRC152001
Скотч двусторонний 12,7 мм × 22,8 мПрозрачный двухсторонний скотч без волокон
SensiFAST SYBR No-ROX KitMeridian BioscienceBIO-98020
Стерильные одноразовые хирургические скальпелиSwann-Morton05XX
Superfrost Plus Адгезионный микроскоп слайдыEprediaJ1800AMNZ
Triton X-100Thermofisher ScientificA16046.
TRIzol РеагентFisherScientific15596026
трипсин-ЭДТА (0,05%)Thermofisher Scientific25300054
Tween-20Fisher Scientific10113103
TWIST1 Rabbit mAb (IF Formulated)Технология клеточной сигнализацииE7E2G
&бета;-меркаптоэтанолThermofisher Scientific
добавка DSHB PAX7 AP31350010

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rothstein, M., Bhattacharya, D., Simoes-Costa, M. The molecular basis of neural crest axial identity. Dev Biol. 444, S170-S180 (2018).
  2. Smeriglio, P., Zalc, A. Cranial neural crest cells contribution to craniofacial bone development and regeneration. Curr Osteoporos Rep. 21 (5), 624-630 (2023).
  3. Zalc, A., et al. Reactivation of the pluripotency program precedes formation of the cranial neural crest. Science. 371 (6529), eabb4776(2021).
  4. Perera, S. N., Kerosuo, L. On the road again: Establishment and maintenance of stemness in the neural crest from embryo to adulthood. Stem Cells. 39 (1), 7-25 (2021).
  5. Nguyen, B. H., Ishii, M., Maxson, R. E., Wang, J. Culturing and manipulation of O9-1 neural crest cells. J Vis Exp. (140), e58346(2018).
  6. Ishii, M., Arias, A. C., Liu, L., Chen, Y. B., Bronner, M. E., Maxson, R. E. A stable cranial neural crest cell line from mouse. Stem Cells Dev. 21 (17), 3069-3080 (2012).
  7. Rada-Iglesias, A., Bajpai, R., Prescott, S., Brugmann, S. A., Swigut, T., Wysocka, J. Epigenomic annotation of enhancers predicts transcriptional regulators of human neural crest. Cell Stem Cell. 11 (5), 633-648 (2012).
  8. Cederquist, G. Y., et al. Specification of positional identity in forebrain organoids. Nat Biotechnol. 37 (4), 436-444 (2011).
  9. Rada-Iglesias, A., Bajpai, R., Swigut, T., Brugmann, S. A., Flynn, R. A., Wysocka, J. A unique chromatin signature uncovers early developmental enhancers in humans. Nature. 470 (7333), 279-283 (2011).
  10. Prescott, S. L., et al. Enhancer divergence and cis-regulatory evolution in the human and chimp neural crest. Cell. 163 (1), 68-83 (2015).
  11. Chaddah, R., Arntfield, M., Runciman, S., Clarke, L., van der Kooy, D. Clonal neural stem cells from human embryonic stem cell colonies. J Neurosci. 32 (23), 7771-7781 (2012).
  12. Bajpai, R., et al. CHD7 cooperates with PBAF to control multipotent neural crest formation. Nature. 463 (7283), 958-962 (2010).
  13. Sipahi, R., Zupanc, G. K. Stochastic cellular automata model of neurosphere growth: Roles of proliferative potential, contact inhibition, cell death, and phagocytosis. J Theor Biol. 445, 151-165 (2018).
  14. Mori, H., et al. Effect of neurosphere size on the growth rate of human neural stem/progenitor cells. J Neurosci Res. 84 (8), 1682-1691 (2006).
  15. Kress, C., Vandormael-Pournin, S., Baldacci, P., Cohen-Tannoudji, M., Babinet, C. Nonpermissiveness for mouse embryonic stem (ES) cell derivation circumvented by a single backcross to 129/Sv strain: establishment of ES cell lines bearing the Omd conditional lethal mutation. Mamm Genome. 9 (12), 998-1001 (1998).
  16. Simões-Costa, M., Bronner, M. E. Establishing neural crest identity: a gene regulatory recipe. Development. 142 (2), 242-257 (2015).
  17. Memberg, S. P., Hall, A. K. Dividing neuron precursors express neuron-specific tubulin. J Neurobiol. 27 (1), 26-43 (1995).
  18. Kim, C. N., Shin, D., Wang, A., Nowakowski, T. J. Spatiotemporal molecular dynamics of the developing human thalamus. Science. 382, eadf9941(2023).
  19. Grimaldi, A., Comai, G., Mella, S., Tajbakhsh, S. Identification of bipotent progenitors that give rise to myogenic and connective tissues in mouse. ELife. 11, e70235(2022).
  20. To, K., et al. A multiomic atlas of human early skeletal development. Nature. 635 (8039), 657-667 (2024).
  21. Bajpai, R., et al. Molecular stages of rapid and uniform neuralization of human embryonic stem cells. Cell Death Differ. 16 (6), 807-825 (2009).
  22. Kerosuo, L., Nie, S., Bajpai, R., Bronner, M. E. Crestospheres, Long-term maintenance of multipotent, premigratory neural crest stem cells. Stem Cell Reports. 5 (4), 499-507 (2015).
  23. Abe, S., Yamaguchi, S., Sato, Y., Harada, K. Sphere-derived multipotent progenitor cells obtained from human oral mucosa are enriched in neural crest cells. Stem Cells Transl Med. 5 (1), 117-128 (2016).
  24. Jensen, J. B., Parmar, M. Strengths and limitations of the neurosphere culture system. Mol Neurobiol. 34 (3), 153-161 (2006).
  25. Ziegler, L., Grigoryan, S., Yang, I. H., Thakor, N. V., Goldstein, R. S. Efficient generation of Schwann cells from human embryonic stem cell-derived neurospheres. Stem Cell Rev Rep. 7 (2), 394-403 (2011).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

96

Похожие статьи