Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Количественная оценка груминг-поведения Drosophila melanogaster для оценки чрезмерных фенотипов груминга

1.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/67708

⸱

21 марта 2025 г.

 , 
1Simmons University

В этой статье

Краткое содержание

Представленный здесь метод включает в себя ручное аннотирование отснятого материала Drosophila melanogaster на предмет специфического поведения груминга. Это позволяет количественно оценить как количество сеансов груминга, так и общее время, затраченное на груминг, для оценки атипичных фенотипов самогруминга.

Аннотация

Наблюдаемые изменения в стереотипном груминге применяются трансляционно в модельных организмах. Эти изменения являются типичными для патологий, вызывающих аналогичные отклонения в поведении человека; Например, чрезмерный груминг выступает в качестве индикатора обсессивного и компульсивного поведения, присутствующего при таких состояниях, как синдром Туретта или обсессивно-компульсивное расстройство. Представленный анализ груминга позволяет оценить аномальные фенотипы самогруминга у Drosophila melanogaster. Мухи регистрируются в течение 10 минут, и эти записи наблюдаются и аннотируются вслепую для ранее определенного поведения груминга. Количественные показатели как частоты груминга, так и времени, затраченного на самогруминг, можно получить, вручную аннотируя отснятый материал. Анализ относительно недорогой, требует небольшого количества материалов, которые еще не доступны в лабораторных условиях, и легко адаптируется к конкретным потребностям любого конкретного исследования, направленного на наблюдение за грумингом. Кроме того, низкий уровень навыков, необходимых для выполнения анализа, по сравнению с автоматизированными методами, основанными на информатике, делает протокол хорошо подходящим для небольших лабораторий и студентов. Мы подробно обсуждаем шаги, необходимые для проведения этого анализа, и его существующие ограничения.

Введение

Drosophila melanogaster является хорошо зарекомендовавшим себя модельным организмом в поведенческих и нейробиологических исследованиях, позволяющим понять механизмы, управляющие аналогичным поведением человека. Самоуход в этом организме представляет собой строго регламентированное и четко определенное поведение, следующее стереотипным шаблонам, которые легко отличить другот друга. Раздельное груминговое поведение, демонстрируемое мухой, в целом можно классифицировать по анатомической области2, которую проще всего определить как заднюю или переднюю. Груминг дрозофил первоначально будет сосредоточен на передней области, а затем перейдет к заднему концу3. В типичных условиях мухи проявляют поведение по уходу за собой для поддержания чистоты (например, удаляя пыль) и реагируют на воздействие потенциально вредных внешних раздражителей, таких как патогенные микробы4.

Аномалии в груминг-поведении, в частности, спонтанный навязчивый груминг, использовались в различных модельных системах в качестве индикатора обсессивного и/или компульсивного поведения. Трансляционные результаты, наблюдающие за навязчивым поведением груминга у таких организмов, как грызуны, птицы и собаки, дали представление об условиях, вызывающих подобное компульсивное поведениеу людей. К ним относятся такие состояния, как трихотилломания, обсессивно-компульсивное расстройство и синдром Туретта6. Чрезмерное груминговое поведение также использовалось в качестве ориентира при оценке поведенческих фенотипов в моделях аналогичных состояний развития нервной системы у Drosophila melanogaster. Навязчивое груминговое поведение наблюдалось у моделей мух с синдромом ломкой X (FSX) и связанным с ним расстройством аутистического спектра (РАС). Избыточный спонтанный груминг происходит при мутациях dfmr1, ортолога к ASD и ассоциированному с FSX гену FMR17. Кроме того, у этихмутантов наблюдается заметное изменение в распределении груминга между задним и передним концами 8. Эти изменения интерпретируются как отражение обсессивного и компульсивного поведения, ориентированного на тело, демонстрируемого некоторыми пациентами с этими состояниями. Используя описанный здесь анализ груминга, мы наблюдали поведение груминга у мух после РНК-опосредованного нокдауна гена дрозофилы Atg8a, продуцируемого коммерчески доступными драйверами GAL4 и линиями UAS-RNAi9.

Этот метод включает в себя ручное аннотирование отснятого материала с мухами для определения определенного поведения при уходе. Предыдущие исследования, направленные на оценку груминг-поведения, например, с использованием косвенных методов, таких как красители, хотя и эффективны для количественной оценки эффективности груминга, не позволяют измерить продолжительностьили частоту груминга. Этот анализ, однако, позволяет количественно оценить частоту и продолжительность груминга дрозофил, как в целом, так и по анатомическим областям. Метод, описанный здесь, имеет некоторые преимущества по сравнению с существующими автоматизированными методами, поскольку он легко модифицируется и может быть использован людьми, не имеющими вычислительного опыта. Благодаря необходимому оборудованию, которое легко доступно в большинстве лабораторий, мы представляем экономически эффективный способ оценки наличия чрезмерного фенотипа самоухода (см. Таблицу материалов). Это делает метод легко доступным в первую очередь для учебных заведений бакалавриата и легко адаптируемым к учебной среде или учебным лабораториям.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Обзор протокола представлен на рисунке 1.

1. Подготовка к съемкам

  1. Поставьте четыре трехлуночные тарелки рядом на белую поверхность, накрыв каждую предметным стеклом.
  2. Расположите камеру (в данном случае это система Raspberry Pi, но достаточно любой камеры, способной снимать видео высокой четкости) над посудой.
    1. Убедитесь, что все блюда находятся в кадре и в фокусе.
    2. Убедитесь, что на предметных стеклах нет бликов, которые ограничат видимость мух в блюде. Устраните блики, отрегулировав положение пластины или приглушив свет в пространстве записи.
    3. Используйте высокое разрешение (минимум 1920 x 1080 пикселей) для точной визуализации конечностей мухи.
  3. Отметьте положение посуды и камеры на скамейке, где происходит запись.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это ограничит время, затраченное на шаг 2 при использовании устройства в будущем. Выполнение анализов в одно и то же время и в одном и том же пространстве ограничит вариативность поведения, основанную на факторах, выходящих за рамки предполагаемых манипуляций.
  4. Слегка обезболите 4-9-дневных мух холодом на ледяной глыбе, накрытой парапленкой и бумажным полотенцем (обезболиваниеСО2 окажет существенное влияние на поведение).
    1. Постучите мух по блоку, а после обезболивания, как можно быстрее переместите мух в камеры наблюдения с помощью кисти.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот перенос должен произойти как можно быстрее, так как чрезмерное воздействие анестезии любого рода может негативно повлиять на мух.
  5. Поместите по одной мухе в каждую лунку.
  6. Дайте файлам акклиматизироваться к новой среде в течение 30 минут после анестезии. После этого момента не прикасайтесь к колодцам, содержащим мух, и не тревожьте их, так как дополнительные стрессоры повлияют на поведение.

2. Учет мух

  1. После 30-минутной акклиматизации запишите мух с помощью фотоаппарата.
  2. Используйте камеру Raspberry Pi, проработанную через PiSpy11 для сбора поведенческих данных.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение является бесплатным и доступно на GitHub (https://github.com/gpask/PiSpy), а система Pi может быть легко настроена менее чем за 300 долларов. Другие камеры, если они уже доступны, также достаточны для записи отснятого материала
  3. Запустите запись с помощью Pi с помощью следующей последовательности команд.
    1. Откройте терминал и введите cd PiSpy. Затем введите python3 PiSpy.py, введите желаемую длину записи и введите желаемую частоту кадров. Выберите нужное разрешение и нажмите «Быстрый захват».
    2. Используйте функцию «Камера предварительного просмотра », чтобы убедиться, что мухи сфокусированы и достаточно заметны.
  4. Запишите полеты в течение 10 минут с рекомендуемой частотой кадров 24 кадра в секунду и сохраните файл (PiSpy автоматически сохранит его в папку с видео).

3. Анализ видео (Рисунок 2)

  1. Для анализа видео импортируйте файл в программное обеспечение Elan 6.812.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это программное обеспечение, хотя и изначально разработано для психолингвистических троллей для детального аннотирования видео и глубокого анализа грумингового поведения
  2. Назначьте каждую строку, как показано ниже, чтобы вручную аннотировать видеоряд отдельных людей.
    1. Сделайте это с помощью следующего потока команд: Уровень > Добавить новый уровень > Тип Расположение в блюде в поле Имя уровня > Добавить.
  3. В зависимости от потребностей исследования, отметьте и количественно оцените различные конкретные модели поведения (передний и задний груминг, ходьба, сон и стояние).
    1. Сделайте аннотации, выполнив следующие действия.
      1. Дважды щелкните уровень, который нужно добавить примечания. Щелкните правой кнопкой мыши и перетащите курсор вдоль выбранного уровня в течение периода, в течение которого проводится один поединок по грумингу. Щелкните левой кнопкой мыши, выберите «Новая аннотация » и дважды щелкните только что выделенный период времени. Введите аббревиатуру для поведения, проявляемого в этот момент времени.
    2. Медленно просматривайте видео, прокручивайте их мышкой и добавляйте примечания. Увеличивайте масштаб одной ячейки полета во время аннотации, чтобы предотвратить ложную идентификацию поведения. Они могут включать в себя постукивание мухой по краю стакана или перекладывание ног, что поначалу может выглядеть как груминг.
  4. После того, как видео будет полностью аннотировано, получите разбивку каждого поведения. Убедитесь, что во всех видео используется одна и та же аббревиатура или аннотация, чтобы использовать эту функцию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В Elan 6.8 будет указано, сколько раз повторяется поведение, общая продолжительность поведения и среднее время, затраченное на каждое поведение.
    1. Определите груминг-подходы как 2 секунды непрерывного груминга. Определите каждое наблюдаемое поведение следующим образом. Определите параметры анатомических областей до проведения анализа.
      1. Передний груминг: Определите груминг, выполняемый в передней области тела мухи, как передний груминг.
        Примечание: Это поведение почти всегда включает в себя растирающие движения на передней части, такой как голова или хоботок, двумя передними ногами мухи.
      2. Задний груминг: Идентифицируйте груминг, выполняемый на передне-заднем конце тела мухи, как задний груминг.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Кроме того, крылья были включены в заднюю область для простоты. Такое поведение почти всегда включает в себя растирающие движения центральной и самой задней парой ног на лету. Хорошим показателем того, что происходит уход за задней частью, будет то, что на первый взгляд муха может выглядеть так, как будто у нее отсутствуют самые задние ноги, как показано на рисунке 2D.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Этот анализ позволяет получить количественные данные, измеряющие время и частоту груминга по аннотированным кадрам. Репрезентативное изображение настройки и того, как определяются поведения, показано на рисунке 2. Учитывая субъективность, привнесенную анализом видео, все аннотации видео должны быть скрыты от исследователя, выполняющего анализ.

Этот метод был использован для оценки роли гена дрозофилы Atg8a в развитии грумингового поведения. A...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В целом, этот легко выполняемый и экономически эффективный анализ позволяет надежно охарактеризовать поведение Drosophila melanogaster по уходу. Этот метод дает представление о частоте, времени, затраченном на участие и анатомическом распределении большого количества ранее идентифицированных видов грумингового поведения. Хорошим показателем того, что груминг будет происходить или идет, являются изменения в постановке ног, в частности, поднятие любой из 6 ног. Внимательное отноше...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Благодарим Джона Янга за отзыв об экспериментальном дизайне, Эрика Люта за доработку рукописи и Мадлен Хэтфилд за помощь в разработке рисунка. Эта работа финансировалась Университетом Симмонса и факультетом биологии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
16 ГБ Micro SD картаAdafruit1294Для использования при внедрении ОС
Дисплей Adafruit3578Достаточно любого дисплея, который можно подключить с помощью HDMI или гибкого кабеля
Drosophila Atg8a-RNAi UAS lineBloomington Stock Center34340Линия, используемая в репрезентативных данных
Drosophila Ok6 DriverN/A/AЛиния, используемая в репрезентативных данных
Стеклянные слайдыFisher Scientific12-550-A3Удерживает мух в защитной оболочке
РадиаторыAdafruitПредотвращает перегрев компьютера
ОбъективAdafruit4563Используется только с HD камерой
PiCameraAdafruit4561Здесь использовалась HD версия, но стандартная камера может быть использована при ограниченном бюджете
Raspberry pi 4Adafruit4292Компьютер PiSpy работает на
кабеле Ribbion Adafruit1648Для использования в подключении компонентов камеры и дисплея
SB ЧехолAdafruit4301Защищает компьютер
Spot PlateFisher ScientificS99406Версии Pyrex уже были доступны для нашего использования, но достаточно тарелок для клеточных культур или пластиковых точечных пластин
Best Buy6355959Для подвешивания и позиционирования камеры, любого устройства, способного на это, достаточно
USB C Power SupplySupply Adafruit1995Подает питание на компьютер
N

Ссылки

  1. Mueller, J. M., Zhang, N., Carlson, J. M., Simpson, J. H. Variation and variability in Drosophila grooming behavior. Front Behav Neurosci. 15, 769372(2022).
  2. Szebenyi, A. L. Cleaning behaviour in Drosophila melanogaster. Anim Behav. 17 (4), 641-651 (1969).
  3. Seeds, A. M., et al. A suppression hierarchy among competing motor programs drives sequential grooming in Drosophila. Elife. 3, e02951(2014).
  4. Ringo, J. M. How do flies keep clean? Head grooming in Drosophila. J Ethol. 38, 167-172 (2020).
  5. Feusner, J. D., Hembacher, E., Phillips, K. A. The mouse who couldn't stop washing: pathologic grooming in animals and humans. CNS Spectr. 14 (9), 503-513 (2009).
  6. Berridge, K. C., et al. Sequential super-stereotypy of an instinctive fixed action pattern in hyper-dopaminergic mutant mice: a model of obsessive compulsive disorder and Tourette's. BMC Biol. 3, 4(2005).
  7. Russo, A., Diantonio, A. Wnd/DLK is a critical target of FMRP responsible for neurodevelopmental and behavior defects in the Drosophila model of Fragile X syndrome. Cell Rep. 28, 2581-2593.e5 (2019).
  8. Andrew, D. R., et al. Spontaneous motor-behavior abnormalities in two Drosophila models of neurodevelopmental disorders. J Neurogenet. 35 (1), 1-22 (2021).
  9. Tian, Y., et al. GABA- and acetylcholine-related gene expression in blood correlate with tic severity and microarray evidence for alternative splicing in Tourette syndrome: a pilot study. Brain Res. 1381, 228-236 (2011).
  10. Barradale, F., Sinha, K., Lebestky, T. Quantification of Drosophila grooming behavior. J Vis Exp. 125, e55231(2017).
  11. Morris, B. I., et al. PiSpy: an affordable, accessible, and flexible imaging platform for the automated observation of organismal biology and behavior. PLoS One. 17 (10), e0276652(2022).
  12. ELAN (Version 6.8) [Computer software]. Nijmegen: Max Planck Institute for Psycholinguistics, The Language Archive. , Nijmegen: Max Planck Institute for Psycholinguistics, The Language Archive. At https://archive.mpi.nl/tla/elan" (2024).
  13. Müller, N. Tourette's syndrome: clinical features, pathophysiology, and therapeutic approaches. Dialogues Clin Neurosci. 9 (2), 161-171 (2007).
  14. Southall, T. D., Elliott, D. A., Brand, A. H. The GAL4 system: a versatile toolkit for gene expression in Drosophila. Cold Spring Harb Protoc. 2008, (2008).
  15. Hatfield, T., Johnson, S. Knockdown of the GABARAP ortholog Atg8a elicits deficits in learning and promotes obsessive behaviors in Drosophila melanogaster. MicroPubl Biol. 2024, (2024).
  16. Bartholomew, N., et al. Impaired climbing and flight behaviour in Drosophila melanogaster following carbon dioxide anaesthesia. Sci Rep. 5, 15298(2015).
  17. Sindhurakar, A., Butensky, S. D., Carmel, J. B. Automated forelimb tasks for rodents: current advantages and limitations, and future promise. Neurorehabil Neural Repair. 33 (7), 503-512 (2019).
  18. Qiao, B., Li, C., Allen, V. W., Shirasu-Hiza, M., Syed, S. Automated analysis of long-term grooming behavior in Drosophila using a k-nearest neighbors classifier. Elife. 7, e34497(2018).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

груминг Drosophilaручная аннотацияколичественный анализ поведениянокдаун Atg8aнейроонтогенетические расстройствамодель синдрома Туреттапрограммное обеспечение ELANРНКи-мутанты
Количественная оценка груминг-поведения Drosophila melanogaster для оценки чрезмерных фенотипов груминга
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.