Методическая статья

Определение четырех компонентов в системе доставки РНК липидных наночастиц с помощью жидкостной хроматографии в сочетании с детектором испарительного рассеяния света

DOI:

10.3791/67711

⸱

30 мая 2025 г.

 ,  ,  ,  , 
1Shimadzu (China) Co., Ltd., 2Medical College of Fudan University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В данной работе мы устанавливаем метод количественного анализа четырех компонентов в системе доставки РНК липидных наночастиц (LNP) с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с детектором испарительного рассеяния света (ELSD). Метод обладает хорошей сепарацией, высокой чувствительностью и высокой эффективностью.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В данной статье представлен метод анализа компонентов липидных наночастиц (ЛНП). ЛНП, служащая основным вектором для препаратов на основе РНК, в основном состоит из холестерина, ПЭГ с модификациями, ионизируемых липидов и липидов-хелперов. Эти компоненты демонстрируют слабую полярность, что приводит к сильному удержанию и трудностям в разделении с помощью обратной фазовой хроматографии, а также к отсутствию отчетливых характеристик ультрафиолетового поглощения. Чтобы решить эту проблему, система жидкостной хроматографии была объединена с испарительным светорассеивающим детектором (ELSD). Путем систематической корректировки типа хроматографической колонки и оптимизации программы градиентного элюирования подвижной фазы было достигнуто быстрое и полное базовое разделение четырех критических компонентов. Использование новейшей технологии ELSD значительно повысило чувствительность обнаружения и расширило линейный диапазон метода. Экспериментальные результаты показали, что в диапазоне концентраций от 5 мкг/мл до 250 мкг/мл четыре компонента LNP продемонстрировали превосходную линейность с коэффициентами корреляции более 0,999, а точность составила от 94,2% до 108,0%. В прецизионных экспериментах относительные стандартные отклонения как времени удержания, так и пиковой площади для стандартного раствора 10 мкг/мл были ниже 0,1% и 2% соответственно. При использовании этого метода для анализа различных образцов LNP все компоненты успешно разделяются, а их соответствующее содержание точно количественно определяется, что подчеркивает надежную адаптируемость этого аналитического подхода.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Липидные наночастицы (LNP) являются одной из самых совершенных невирусных систем доставки генов, в основном используемой для доставки препаратов нуклеиновых кислот, таких как антисмысловые олигонуклеотиды, малые интерферирующие нуклеотиды, мРНК и т.д. 1,2,3. LNP обычно состоит из четырех компонентов: ионизируемых липидов, модифицированных полиэтиленгликолем (ПЭГ) липидов, фосфолипидов и холестерина. Ключевым компонентом являются ионизируемые липиды, которые являются решающим фактором эффективности доставки лекарств нуклеиновыми кислотами. Остальные три компонента могут повышать стабильность LNP и снижать распознавание иммунной системой 4,5,6.

Различные соотношения четырех компонентов в LNP могут существенно влиять на процесс самосборки наночастиц, влияя на такие свойства, как эффективность инкапсуляции активного фармацевтического ингредиента (API), эффективность его доставки и скорость высвобождения in vivo 7,8,9. В связи с этим необходимо разработать метод количественного анализа компонентов LNP, тем самым способствуя синтезу оптимальной системы доставки LNP10,11.

Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) — это современный аналитический метод, широко используемый в фармацевтическом анализе и ценящийся за свою высокую эффективность, чувствительность и возможности автоматизации. ВЭЖХ включает в себя различные детекторы, включая обычные ультрафиолетовые (УФ) детекторы, а также детекторы общего назначения, такие как детекторы показателя преломления (RID), детекторы испарительного рассеяния света (ELSD), детекторы заряженного аэрозоля (CAD) и высокоселективные радиочастотные (РЧ) детекторыи другие.

В случае анализа четырех компонентов ЛНП, которые не имеют ярко выраженных групп, поглощающих УФ-излучение и, таким образом, не дают отклика в УФ-детекторах, рассматривалось использование детекторов общего назначения. Хотя RID является одним из таких вариантов, он не подходит для градиентного анализа и имеет относительно меньшую чувствительность по сравнению с двумя другими детекторами общего назначения; Следовательно, он не был выбран12. Кроме того, в то время как детекторы САПР обладают высокой чувствительностью, их непомерно высокая стоимость делает их менее привлекательными.

В связи с этим был выбран детектор ELSD. Этот детектор имеет отличительную опцию режима усиления - "широкий" режим, который позволяет одновременно анализировать как высококонцентрированные, так и следовые компоненты, повышая чувствительность и расширяя линейный диапазон.

В данной статье используется система ВЭЖХ в сочетании с ELSD, обеспечивающая эффективное разделение и количественный анализ четырех компонентов ЛНЧ за счет оптимизации хроматографических колонок, градиентного элюирования подвижных фаз и других условий13.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка инструмента

  1. Настройка прибора
    1. Настройте систему ВЭЖХ в сочетании с ELSD.
  2. Монтаж колонны
    1. Установите хроматографическую колонку (C4-300; 150 мм × внутренний диаметр 4,6 мм, 5 мкм), следуя направлению стрелки на колонке, одним концом которой следует подключить к выходному отверстию автосамплера, а другим — к входу ELSD.
  3. Мобильная подготовка фаз
    1. Приготовьте подвижные фазы: фазу А — водный раствор ТЭАА 10 мМ (рН = 7,0) и фазу В — раствор метанола ТЭАА 10 мМ (рН = 7,0).
    2. Чтобы приготовить фазу А, точно взвесьте 1,01 г триэтиламина, растворите его в 1000 мл воды, хорошо перемешайте и отрегулируйте pH до 7,0 с уксусной кислотой.
    3. Для приготовления фазы В растворите 1,01 г триэтиламина в 1000 мл метанола, перемешайте и доведите pH до 7,0 с уксусной кислотой.
  4. Редактирование метода
    1. Включите выключатели питания для каждого модуля LC-ELSD и запустите программное обеспечение LabSolutions . Затем откройте окно «Анализ в реальном времени ».
    2. Нажмите « Файл» и выберите «Создать », чтобы создать новый файл метода. Измените значение параметра Время остановки LC в методе на 15 и нажмите кнопку Применить ко всему времени сбора данных.
    3. Затем нажмите « Насос », чтобы изменить параметры насоса. Выберите режим анализа как Binary High-Pressure Gradient (B.GE) и установите скорость потока на 1,0 мл/мин.
    4. Затем установите начальную концентрацию B насоса (%B) на 80% и измените подвижный фазовый градиент: через 3 минуты %B составляет 80%, через 4 минуты %B составляет 85% от 5,5 минут до 12 минут, %B равен 100%, через 12,1 минуты %B возвращается к 80%.
    5. Далее нажмите на «Колонная духовка» и установите температуру духовки на 55 °C. Наконец, нажмите на кнопку ELSD , чтобы изменить температуру дрейфовой трубки до 40 °C. Сохраните метод.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сводка параметров приведена в таблице 1.
  5. Запустите и уравновесьте прибор.
    1. Нажмите « Загрузить и запустить », чтобы запустить и сбалансировать инструмент.

2. Приготовление стандартных растворов и образцов

  1. Приготовление стандартных растворов
    1. Точно взвесить 10,0 мг четырех стандартных компонентов ЛНП по отдельности, растворить в 1 мл метанола и вихревыми до полного растворения получить стоковые растворы с концентрацией 10 мг/мл для каждого компонента.
    2. С помощью пипетки точно переведите по 100 мкл каждого из четырех исходных растворов в пробирку с образцом, затем добавьте 600 мкл метанола. Тщательно перемешать для приготовления смешанного промежуточного раствора 1 с концентрацией 1000 мкг/мл.
    3. Аккуратно перелейте по 20 мкл каждого из четырех исходных растворов во флакон с образцом, затем добавьте 920 мкл метанола. Тщательно перемешать для приготовления смешанного промежуточного раствора 2 с концентрацией 200 мкг/мл.
    4. Затем готовят серию стандартных растворов в концентрациях 5 г/мл, 10 г/мл, 20 г/мл, 50 г/мл, 100 г/мл, 200 г/мл и 250 г/мл путем последовательного разведения в соответствии с таблицей 2.
  2. Подготовка образцов
    1. С помощью пипетки аккуратно перелейте 100 мкл образца во флакон с образцом, затем добавьте 900 мкл метанола и хорошо перемешайте. На этом этапе убедитесь, что концентрация LNP в образце разбавлена в 10 раз, а LNP диссоциирован от препарата нуклеиновой кислоты.

3. Сбор данных

  1. Поместите стандартные растворы и образцы растворов в автоподатчик жидкостного хроматографа.
  2. Нажмите на кнопку «Пакетная обработка в реальном времени » на панели инструментов помощника в окне «Анализ в реальном времени ». Затем нажмите кнопку Создать в меню Файл , чтобы создать новую пакетную таблицу.
  3. В таблице партий введите Vial#, Tray Name, файл Data и объем инъекции стандартных и образцовых растворов, а затем выберите файл метода, сохраненный на шаге 1.4. Нажмите «Сохранить пакетный файл » в меню «Файл », чтобы сохранить пакетный файл.
  4. Подождите, пока давление жидкостного хроматографа и базовый уровень хроматограммы не стабилизируются. Затем нажмите « Запустить пакетную обработку в реальном времени » на панели инструментов помощника, чтобы начать сбор данных.

4. Анализ данных

  1. Создание калибровочных кривых
    1. Откройте окно браузера программного обеспечения LabSolutions и перетащите данные стандартного решения в представление количественных результатов, чтобы построить кривую калибровки. Далее измените параметры обработки данных. Нажмите «Редактировать» в окне «Метод».
    2. В окне Параметры интеграции измените значение уклона на 10000. Затем в параметрах идентификации измените метод идентификации на Band и установите пропускную способность по умолчанию на 0.1 мин.
    3. После этого модифицируйте Количественные параметры. Измените Количественный метод на Внешний стандарт и установите # для параметра Уровень калибровки на 7. Выберите тип калибровочной кривой как Экспоненциально. Далее, измените Составное покрытие.
    4. Введите названия и стандартные концентрации растворов четырех компонентов LNP. Дважды щелкните по вершине пика, чтобы обновить время хранения. Наконец, нажмите кнопку Просмотр , чтобы завершить изменение параметров обработки данных.
    5. Измените тип выборки в виде количественных результатов на стандартный (точка расчета). В зависимости от концентраций установите уровни стандартного раствора от 1-7. После того, как калибровочные кривые будут установлены, нажмите «Файл» в строке меню и сохраните файл метода.
  2. Количественный анализ образцов
    1. Перетащите данные образцов в окно просмотра количественных результатов браузера, в котором отобразятся результаты концентрации четырех компонентов LNP в образцах.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Анализ стандартного решения LNP с использованием этого метода позволил получить степень разделения более 1,5 для четырех компонентов, реализуя базовое разделение. Кроме того, в стандартных растворах с высокой концентрацией не наблюдалось никаких остатков, как показано на рисунке 1. Калибровочная кривая была построена в диапазоне концентраций от 5 до 250 г/мл, с коэффициентами корреляции, превышающими 0,999, что указывает на широкий линейный диапазон и превосходную линейность. Калибровочная к...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все четыре компонента LNP демонстрируют относительно слабую полярность. При анализе с использованием колонки C18 целевые соединения демонстрируют сильную удерживаемость в колонке, что приводит к расширению пика фосфолипидов для сильно удерживаемых компонентов. Кроме того, после анализа высококонцентрированных растворов в верхней части колонки С18 накапливаются остатки, что может поставить под угрозу точность количественного определения. Хроматограмма представлена на ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Благодарим биофармацевтические компании за поставку образцов LNP для эксперимента, а также благодарим компанию Shimadzu (Shanghai) Global Laboratory Consumables Co., Ltd за предоставленную хроматографическую колонку.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Уксусная кислотаANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) Inc.CAEQ-4-000319-0050
BalanceShimadzu (Шанхай) Global Laboratory Consumables Co.,LtdAP135W
КолонкаShimadzu (Шанхай) Global Laboratory Consumables Co.,LtdShimNex WP C4(380-01235-74)
ELSDShimadzu (Китай) CO.,LTDELSD-LT III(228-65900-46)
LabSolutions SoftwareShimadzu (Китай) CO.,LTD
LCShimadzu (China) CO.,LTDLC40D XR
MethanolANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) Inc.CAEQ-4-003302-4000
Пипетка-100 и микро; LShimadzu (Shanghai) Global Laboratory Consumables Co., Ltd00-NAR-100
Pipette-1000 µ LShimadzu (Shanghai) Global Laboratory Consumables Co., Ltd00-NAR-1000
TEAANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) Inc.CAEQ-4-012190-0250
Система сверхчистой водыСмеситель миллипорZIQ7000T0C
вихревыхANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) Inc.ВМ-Б
смесителей

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zong, Y., Lin, Y., Wei, T., Cheng, Q. Lipid nanoparticle (LNP) enables mRNA delivery for cancer therapy. Adv Mater. 35 (51), e2303261(2023).
  2. Vlatko, I., et al. Non-immunotherapy application of LNP-mRNA: Maximizing efficacy and safety. Biomedicines. 9 (5), 530(2021).
  3. Eygeris, Y., et al. Chemistry of lipid nanoparticles for RNA delivery. Acc Chem Res. 55 (1), 2-12 (2021).
  4. Sun, D., Lu, Z. R. Structure and function of cationic and ionizable lipids for nucleic acid delivery. Pharm Res. 40 (1), 27-46 (2023).
  5. Rebecca, L., et al. Lipid nanoparticle formulations for enhanced co-delivery of siRNA and mRNA. Nano Lett. 18 (6), 3814-3822 (2018).
  6. Maugeri, M., Nawaz, M., Papadimitriou, A. Linkage between endosomal escape of LNP-mRNA and loading into EVs for transport to other cells. Nat Commun. 10, 4333(2019).
  7. Renee, C., et al. The effects of PEGylation on LNP based mRNA delivery to the eye. PLoS One. 15 (10), e0241006(2020).
  8. Benedicto, E., et al. Optimization of phospholipid chemistry for improved lipid nanoparticle (LNP) delivery of messenger RNA (mRNA). Biomater Sci. 10 (2), 549-559 (2022).
  9. Kamanzi, A., et al. Quantitative visualization of lipid nanoparticle fusion as a function of formulation and process parameters. ACS Nano. 18 (28), 18191-18201 (2024).
  10. Melissa, P., et al. Optimization of lipid nanoparticles for the delivery of nebulized therapeutic mRNA to the lungs. Nat Biomed Eng. 5 (9), 1059-1068 (2021).
  11. Packer, M., et al. A novel mechanism for the loss of mRNA activity in lipid nanoparticle delivery systems. Nat Commun. 12 (1), 6777(2021).
  12. Snyder, L. R., Kirkland, J. J., Dolan, J. W. Introduction to Modern Liquid Chromatography. , John Wiley & Sons. Hoboken, NJ. (2010).
  13. Zhang, L. Z., et al. Effect of mRNA-LNP components of two globally marketed COVID-19 vaccines on efficacy and stability. NPJ Vaccines. 8 (1), 156(2023).
  14. Zhang, Y., Wang, X. Performance comparison of different ELSD detectors in pharmaceutical analysis. Anal Methods. 7 (12), 4800-4807 (2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи