Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Эффективная и безопасная доставка генов в почку мыши путем медленной ретроградной инъекции векторов аденоассоциированного вируса в почечную лоханку

2.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/67716

⸱

1 августа 2025 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular and Medical Genetics, Oregon Health & Science University, 2Department of Molecular Microbiology and Immunology, Oregon Health & Science University, 3Division of Neuroscience, Oregon National Primate Research Center

В этой статье

Краткое содержание

В этом отчете подробно описан локализованный метод инъекции векторов AAV через почечную лоханку для эффективного и безопасного переноса генов в почку мыши.

Аннотация

Разработка эффективных in vivo инструментов и методов доставки генов в почки имеет решающее значение для продвижения фундаментальных исследований почек и генной терапии заболеваний почек. Кроме того, растущая осведомленность о моногенных заболеваниях почек, обусловленная передовым генетическим тестированием, подчеркивает потенциал генной терапии для лечения и даже излечения трудно поддающихся лечению генетических заболеваний почек. В связи с этим векторы аденоассоциированных вирусов (AAV) привлекают все большее внимание в качестве надежной платформы для доставки генов in vivo ; однако наиболее эффективный и безопасный метод доставки вектор-опосредованных AAV генов к каждому терапевтически значимому типу клеток в почках еще не полностью установлен. В данной работе подробно описан метод медленной ретроградной инъекции векторов AAV в почечную лоханку (РП) и продемонстрирован его высокий потенциал для трансдукции почек мыши при использовании с правильно подобранными капсидами AAV. Более того, этот метод показал свою эффективность не только со стандартными векторами AAV, очищенными ультрацентрифугированием хлорида цезия (CsCl AAV), но и с центробежно ультрафильтруемыми векторными минипрепами AAV (CU AAV), которые могут быть быстро и просто приготовлены с использованием методов, не требующих специальных знаний в области векторов AAV. В качестве примера можно привести данное исследование, демонстрирующее, что медленная инъекция RP векторов CsCl и CU AAV-KP3 приводит к надежной трансдукции проксимальных канальцев в почке мыши без видимого повреждения тканей, в отличие от ранее описанных гидродинамических подходов, которые неизбежно приводят к повреждению тканей. Таким образом, данное исследование подчеркивает, что медленная ретроградная инъекция RP отдельных векторов, полученных из капсида AAV, является эффективным и безопасным методом доставки генов в почки. Этот метод будет применим к широкому спектру исследований почек, включая исследования в области генной терапии. Использование векторных минипрепов CU AAV значительно увеличит пропускную способность и улучшит временную и экономическую эффективность, необходимые для получения предварительных данных и получения критически важных выводов.

Введение

Эффективные и безопасные методы доставки генов в почку у мелких и крупных экспериментальных животных открывают важнейшие возможности для продвижения фундаментальных исследований почек и изучения инновационных терапевтических подходов. Создание таких методов особенно актуально для генной терапии различных заболеваний почек. Последние достижения в области клинического генетического тестирования выявили более высокую распространенность моногенных заболеваний почек, чем предполагалось ранее, и затрагивают примерно 30% пациентов с хроническими заболеваниями почек (ХБП)1. ХБП характеризуется прогрессирующим повреждением почек, что в конечном итоге приводит к почечной недостаточности без по-настоящему эффективных болезнь-модифицирующих методов лечения. Гемодиализ и трансплантация почек в настоящее время являются доступными методами лечения; однако они имеют ограничения, которые значительно ухудшают качество жизни пациентов с ХБП2. Таким образом, генная терапия, клинически доказанный эффективный подход к лечению генетических заболеваний, привлекла значительное внимание в последние годы как новый способ эффективного лечения генетических заболеваний почек, приводящих к ХБП 3,4,5,6. Этот подход может напрямую устранить коренные причины заболеваний и потенциально предложить излечение.

Несмотря на неуклонный прогресс в этой области, доставка генов в почку остается серьезной проблемой как в исследовательских, так и в терапевтических условиях. Эффективное нацеливание на клетки почек с помощью терапевтических генов затруднено из-за сложной структуры органа и уникальных физиологических барьеров, включая клубочковый фильтрационный барьер, который состоит из клубочковых эндотелиальных клеток, клубочковую базальную мембрану и подоцитарные отростки стопы. Были изучены различные стратегии доставки генов, нацеленных на почки, включая прямую инъекцию в кору почек (РК) 7,8, инъекцию в почечную артерию (РА) 9,10,11, инъекцию в почечную вену (ПЖ) 12,13,14, инъекцию в почечную лоханку (РП) 15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25 и внутривенное (в/в) введение 19,26,27,28,29,30 вирусных или невирусных векторов доставки генов, а также ультразвуковая и микропузырьковая доставка нуклеиновых кислот 31,32. Эти подходы продемонстрировали переменную эффективность трансдукции или функциональные исходы, часто приводя к противоречивым результатам, которые трудно согласовать (рассмотрено в ссылках 3,33,34,35). Доставка генов в почку все еще недостаточно развита, что затрудняет прямое сравнение векторных систем и методологий. Тем не менее, локализованные методы доставки, которые облегчают введение высококонцентрированных препаратов непосредственно в почку, как правило, достигают лучших результатов, чем системное внутривенное введение. Кроме того, векторы аденоассоциированных вирусов (AAV) с их надежными профилями безопасности и доказанным клиническим переводом36,37 являются наиболее изученными и считаются ведущим выбором для переноса генов почек.

Распространенные серотипы AAV и сконструированные капсиды продемонстрировали эффективную трансдукцию мезангиальных и мезенхимальных клеток в почку после внутривенного введения у мышей 28,30,38. Примечательно, что недавние исследования показали, что внутривенное введение AAV9 может эффективно трансдуцировать подоциты в мышиных моделях нефротического синдрома и синдрома Альпорта, хотя этот эффект не наблюдается в здоровых почках38,39, и что внутривенное введение сконструированного капсида AAV2 может быть нацелено исключительно на клубочковые эндотелиальные клетки как в здоровых, так и в воспаленных почках умышей. Исторически сложилось так, что почечные канальцы было сложно трансдуцировать внутривенным путем. Тем не менее, недавно было обнаружено, что RP-инжекция отдельных капсидов AAV, таких как AAV-KP141, может обеспечить трансдукцию проксимальных канальцев на уровнях, более чем на порядок превышающих те, которые достигаются с помощью эталонного капсидаAAV9 38. Несмотря на необходимость дальнейших улучшений, эти достижения открывают новые возможности для фундаментальных исследований почек и генной терапии, предлагая возможности, которые ранее были недостижимы.

В настоящей статье медленная ретроградная инъекция векторов AAV подробно описана как эффективный и безопасный метод доставки генов в почку мыши38. В качестве репрезентативного примера этой методики AAV-KP3 был выбран в качестве примерного капсида на основании того, что он является одним из шести капсидов (т.е. AAV-KP1, AAV-KP2, AAV-KP341, AAV-DJ42, AAV2G943 и AAV2.7m844), которые показали улучшенную почечную трансдукцию по сравнению с AAV9 после инъекции RP мышам38. Примечательно, что медленные ретроградные почечные ткани, введенные с помощью РП, не показали видимых повреждений тканей, в отличие от тех, кто лечился гидродинамическими подходами, о которых сообщалось ранее23,24. Кроме того, мини-векторы45 AAV, грубо очищенные быстрой и простой центробежной ультрафильтрацией (т.е. векторы CU AAV), достигали уровней почечной трансдукции, примерно 70% от тех, которые достигаются препаратами векторов AAV, очищенными стандартным градиентным ультрацентрифугированием хлорида цезия (CsCl) (т.е. векторами CsCl AAV) при введении в том же титре генома вектора. Таким образом, представленные здесь методы и наблюдения представляют собой ценный и практический ресурс для исследователей, стремящихся улучшить доставку генов в почку у мышей и потенциально более крупных животных.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все описанные здесь эксперименты на животных были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию в Орегонском университете здоровья и науки (OHSU) и проводились в соответствии с рекомендациями по уходу за животными в OHSU. В этом исследовании использовались восьминедельные самцы мышей C57BL/6J. Реагенты и оборудование, использованные в данном исследовании, перечислены в Таблице материалов.

1. Получение вектора AAV путем трансфекции плазмид без аденовирусов

  1. Культивировали 293 клетки эмбриональной почки человека (HEK) в модифицированной среде Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) с высоким содержанием глюкозы (4,5 г/л) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 1% смеси пенициллина и стрептомицина и 1 мМ L-глутамина в инкубаторе при температуре 37 °C с 5% углекислым газом (CO2).
  2. На день -2 (за 48 ч до трансфекции) наносят 4 x 106 HEK 293 клетки в колбу T225 в 40 мл питательной среды, как описано на шаге 1.1. Это достигает ~95% слияния в день 0.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Масштаб культивирования может быть скорректирован в зависимости от области применения. Для мини-подготовки AAV (шаг 2) подготовьте соответствующее количество колб в зависимости от целевого титра и концентрации вектора, учитывая, что процесс очистки обычно приводит к потере материала примерно на 50%. Для получения >6 x 1012 vg/мл векторов AAV9 и AAV-KP3 для инъекции RP мышам в дозе 3 x10 11 vg/мышь в векторном растворе объемом 50 μл рекомендуется использовать не менее 2 колб. Для более масштабного производства векторов AAV, например, для векторов AAV, очищенных от градиента плотности CsCl (CsCl AAV), обычно используется 25 или более колб.
  3. День 0: Трансфекция плазмидной ДНК
    1. Подготовка к трансфекции
      1. Убедитесь, что клетки достигли ~95% конфлюенции.
      2. Разогрейте DMEM с добавлением 1% пенициллина и стрептомицина и 1 мМ L-глютамина, но без FBS (т.е. бессывороточной среды) на водяной бане при температуре 37 °C.
      3. Дайте раствору линейного полиэтиленимина (ПЭИ) нагреться до комнатной температуры.
    2. Приготовление смеси плазмидной ДНК
      1. Смешайте плазмиды (по 15 г pAAV-CAG-tdTomato, pRepCap и pHelper) в 1 мл фосфатно-солевого буфера (PBS) без CaCl2 или MgCl2 в стерильных микроцентрифужных пробирках объемом 1,5 мл. Общее количество ДНК составляет 45 мкг/колба.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Объемы раствора плазмидной ДНК можно не учитывать, если они минимальны. Тем не менее, рекомендуется корректировка объема, если общий объем раствора составляет ≥225 μл. Последовательности плазмид, использованных в этом исследовании, доступны в Дополнительном файле 1.
    3. Трансфекция ПЭИ
      1. Добавьте 90 мкл раствора PEI (1 мг/мл) к 1 мл PBS и смешайте со смесью PBS-плазмидной ДНК (приготовленной, как описано выше) в полипропиленовой пробирке объемом 50 мл. Конечный объем составляет примерно 2 мл (5% объема питательной среды).
      2. Сделайте пробирки вихревыми в течение 5 с и кратковременно раскрутите пробирки с помощью центрифуги, чтобы собрать жидкость на дно пробирок.
    4. Выдержать при комнатной температуре 15 мин для образования плазмидных комплексов ДНК-ПЭИ.
    5. После завершения 15-минутной инкубации добавьте 40 мл предварительно подогретой бессывороточной среды, приготовленной на шаге 1.3.1.2, в комплексы плазмидной ДНК-ПЭИ. Объем составляет примерно 42 мл.
    6. Замените питательную среду колбы Т225 плазмидными комплексами ДНК-ПЭИ, содержащими бессывороточную среду, описанную в шаге 1.3.4.
    7. Сохраняйте клетки в этой среде для трансфекции до сбора урожая на 5-й день (смена среды не требуется).
    8. На 2-й день наблюдайте за клетками, трансфицированными плазмидой, экспрессирующими флуоресцентные белки (например, pAAV-CAG-tdTomato) под инвертированным флуоресцентным микроскопом, чтобы оценить эффективность трансфекции плазмид.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Описанные выше условия обычно приводят к тому, что эффективность трансфекции превышает 70%. Могут наблюдаться некоторые морфологические изменения (например, удлинение клеток), вероятно, из-за среды, свободной от сыворотки.
    9. С 3 по 5 день продолжайте культивировать трансфицированные клетки в инкубаторе при температуре 37 °C с 5%CO2.
    10. На 5-й день соберите клетки и вирусосодержащую среду в полипропиленовую пробирку объемом 50 мл.
    11. Храните образцы при температуре -80 °C до использования.

2. Центробежная ультрафильтрация (CU) очистки векторов AAV (AAV miniprep)

  1. Разморозьте замороженный образец с шага 1.3.11 на водяной бане при температуре 37 °C.
  2. Оставьте 1 мл сырого лизата в стороне для анализа ДНК на точечный блоттинг (используется как фракция 1).
  3. Добавьте 80 мкл 1М хлорида магния (MgCl2, конечная концентрация 2 мМ), 160 мкл 0,1М гидроксида натрия (NaOH, конечная концентрация 0,4 мМ) и 16 мкл эндонуклеазы Serratia marcescens (конечная концентрация 100 ЕД/мл) в пробирку объемом 50 мкл. Выдерживать при 37 °C в течение 1 ч. Перегоняйте образец каждые 15 минут в течение инкубации.
  4. Соберите образец, обработанный эндонуклеазой Serratia marcescens, в центрифугу объемом 250 мл и центрифугируйте при температуре 10 000 x g при 4 °C в течение 30 минут.
  5. Перенесите надосадочную жидкость в полипропиленовую пробирку объемом 50 мл с помощью серологической пипетки объемом 50 мл.
  6. Отфильтруйте надосадочную жидкость для удаления мусора с помощью шприцевого фильтра PVDF 0,45 мкм. Оставьте 1 мл отфильтрованного образца 0,45 мкм для анализа ДНК-блоттинга (используется как фракция 2).
  7. Добавьте 10 мл молекулярной воды в центробежную ультрафильтрационную трубку с молекулярной массой 100 кДа (MWCO) и центрифугируйте при температуре 2 000 x g при 4 °C в течение 10 минут. Снимите проточный поток.
  8. Добавьте 15 мл 5% сорбита в PBS в центробежную ультрафильтрационную трубку и центрифугируйте при 2000 x g при 4 °C в течение 10 минут. Снимите проточный поток.
  9. Добавьте до 15 мл отфильтрованного образца размером 0,45 мкм, как описано на шаге 2.6, и центрифугируйте при 2000 x g при 4 °C в течение 15 минут для концентрирования до достижения целевого объема приблизительно 500 μл. Оставьте 1 мл проточного раствора в стороне для анализа ДНК на точечный блоттинг (используется как фракция 3).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Перед каждым центрифугированием ресуспендируйте ретентат с помощью пипетки, чтобы нарушить градиент концентрации. Не прикасайтесь к мембране наконечником пипетки. Если целевой объем не достигнут после 15-минутного центрифугирования, при необходимости продлите центрифугирование, регулируя продолжительность в зависимости от оставшегося объема в пробирке.
  10. Повторяйте шаг 2.9 до тех пор, пока весь образец не будет отфильтрован, достигнув целевого объема примерно 500 μл. Оставьте 1 мл проточного потока из первой и второй итераций шага 2.10 в стороне для анализа DNA dot blot (используется как фракция 4 и фракция 5).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Одна центробежная ультрафильтрационная трубка может использоваться для обработки образцов, полученных из двух или более колб.
  11. Добавьте 15 мл 5% сорбита в PBS и центрифугируйте при 2000 x g при 4°C в течение 15 мин до достижения целевого объема около 500 μл. Оставьте 1 мл проточного раствора в стороне для анализа ДНК на точечный блоттинг (используется как фракция 6).
  12. Повторите шаг 2.11 (используется как Фракция 7).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если для последующих экспериментов требуются более высокие титры AAV, конечный целевой объем может быть дополнительно уменьшен до 150 μл.
  13. Перенесите ультрафильтрованный вектор AAV в пробирку с завинчивающейся крышкой объемом 2 мл с уплотнительным кольцом. Оставьте 10 мкл ультрафильтрованного вектора AAV в стороне для анализа ДНК-точечного блоттинга (используется как фракция 8).
  14. Определение титров AAV с помощью анализа DNA dot blots, как описано ранее46.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Очищенные от Cu векторы (CU AAV) содержат более высокие уровни загрязнения пустыми капсидами и примесями, полученными из клеток хозяина, по сравнению с CsCl-очищенными векторами (CsCl AAV). Эти факторы могут влиять на эффективность трансдукции и иммунные реакции, что требует тщательного рассмотрения при интерпретации данных.

3. Плотностно-градиентная очистка векторов AAV CsCl

  1. Разморозьте замороженный образец с шага 1.3.11 на водяной бане при температуре 37 °C.
  2. Центрифугируйте при давлении 10 000 x g при 4 °C в течение 30 минут, чтобы удалить клеточный мусор.
  3. Соберите надосадочную жидкость и осаждайте векторы AAV в надосадочной жидкости, добавив полиэтиленгликоль 8000 (ПЭГ, конечная концентрация 8%) и хлорид натрия (конечная концентрация 500 мМ).
  4. Выдерживать на льду в течение 3 ч.
  5. Центрифугируйте при 10 000 x g при 4 °C в течение 30 минут для получения гранул, содержащих AAV.
  6. Удалите надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулы 10 мл саркосилсодержащего ресуспензионного буфера (50 мМ HEPES, 150 мМ NaCl, 1% саркозил, pH 8,0).
  7. Переложите суспензию гранул в полипропиленовую трубку объемом 15 мл и выдержите ее при температуре 4 °C в течение ночи.
  8. На следующий день обработайте суспензию гранул эндонуклеазой Serratia marcescens (конечная концентрация 200 ЕД/мл) и MgCl2 (конечная концентрация 2 мМ).
  9. Инкубировать при 37 °C в течение 1 часа.
  10. Центрифуга при 10 000 x g при 4 °C в течение 30 минут.
  11. Соберите надосадочную жидкость и добавьте хлорид цезия (CsCl, конечная концентрация показателя преломления (RI) = 1,3710 +/- 0,0005) и ЭДТА (конечная концентрация 20 мМ).
  12. Загрузите образец в ультрацентрифужную пробирку объемом 29,9 мл и добавьте раствор топпинга (50 мМ HEPES, 150 мМ NaCl, 20 мМ ЭДТА, CsCl (RI = 1,3710 +/- 0,0005), pH 8,0) до полного заполнения.
  13. Центрифуга при давлении 41 000 x g при 12 °C в течение 22 часов.
  14. Пробейте отверстия в дне и боковой части ультрацентрифужной пробирки, чтобы собрать в общей сложности 15 фракций по 2 мл каждая.
  15. Используйте по 10 мкл каждой фракции для проверки RI и выполните анализ DNA dot blot46.
  16. На основе результатов анализа RI и DNA dot blots определите 5 лучших фракций, которые содержат векторы AAV.
  17. Соедините лучшие 5 фракций (всего около 10 мл) и отрегулируйте RI до 1,3710 +/- 0,0005.
  18. Загрузите образец в ультрацентрифужную пробирку объемом 11,2 мл и добавьте раствор для топпинга до полного заполнения.
  19. Центрифуга при 65 000 x g при 12 °C в течение 12 часов.
  20. Пробейте отверстия в дне и боковой части ультрацентрифужной пробирки объемом 11,2 мл, чтобы собрать в общей сложности 18 фракций по 0,5 мл каждая.
  21. Используйте по 10 мкл каждой фракции для проверки RI и выполните анализ DNA dot blot46.
  22. На основании результатов анализа RI и DNA dot blots определите 6 лучших фракций, которые содержат векторы AAV.
  23. Соедините лучшие 6 фракций (всего около 3 мл) и загрузите их в диализную кассету.
  24. Поместите диализную кассету в 1,3 л диализного буфера (PBS буфер с добавлением 0,001% неионогенного поверхностно-активного вещества) с помощью мешалки в течение 2 часов для удаления CsCl.
  25. Повторите шаг 3.24 два раза (всего 6 часов диализа).
  26. Перенесите в кассету 500 мл 5% сорбита в буфер PBS с добавлением 0,001% поверхностно-активного вещества на 2 ч для замены буфера.
  27. Соберите образец из диализной кассеты с помощью шприца и отфильтруйте собранный образец с помощью шприцевого фильтра PVDF размером 0,22 мкм.
  28. Определены титры AAV с помощью количественного анализа точечного блоттинга46.

4. Оценка качества векторных препаратов AAV с помощью SDS-PAGE с последующим окрашиванием серебром

  1. Смешайте векторные препараты, 1 x 10vg для векторов CsCl AAV и 1 x 109 и 1 x10 vg для векторов CU AAV, с 6x буфером Laemmli в общей сложности 18 μL (векторный препарат: 6x Laemmli = 15:3) и нагрейте их при 100 °C в течение 5 минут.
  2. Загрузите термически обработанные векторные препараты AAV на 7,5% гель SDS-PAGE и электрофорируйте образцы при давлении 20 мА с использованием проточного буфера для геля Tris-glycine-SDS.
  3. Извлеките гель из гелевой кассеты, промойте ее сверхчистой водой и испачкайте с помощью набора для окрашивания серебром в соответствии с инструкцией производителя.
  4. Гель, загруженный векторами CsCl AAV, инкубируют в растворе проявителя в течение 7 минут, тогда как гель, загруженный векторами CU AAV, инкубируют в течение 2 минут, чтобы избежать насыщения сигнала.
    Примечание: векторные препараты Cu AAV содержат более высокие уровни белковых примесей по сравнению с векторами CsCl AAV. Поэтому гели, загруженные векторами CsCl AAV и CU AAV, отделялись после растекания геля и окрашивались серебром отдельно, чтобы предотвратить насыщение сигнала из-за высокой чувствительности метода окрашивания.

5. Идентификация белков AAV VP в векторных препаратах CU AAV методом вестерн-блоттинга

  1. Смешайте 1 x 109 vg векторных препаратов CU AAV с 6x буфером Laemmli в общей сумме 18 μL (векторный препарат: 6x Laemmli = 15:3) и нагрейте их при 100 °C в течение 5 минут.
  2. Загрузите термически обработанные векторные препараты AAV на 7,5% гель SDS-PAGE и электрофорируйте образцы при давлении 20 мА с использованием проточного буфера для геля Tris-glycine-SDS.
  3. Электроперенос белков в геле на мембрану из поливинилидендифторида (PVDF), активированную в метаноле, с помощью полусухой системы переноса.
  4. Закройте мембрану 5% обезжиренным молоком в 1x Трис-буферном физрастворе с Tween 20 (TBST) при комнатной температуре в течение 1 часа.
  5. Инкубируйте заблокированную мембрану с первичным раствором антитела (кроличье поликлональное антитело против VP, разбавленное до 1:1000 5% обезжиренным молоком в 1x TBST) при 4 °C в течение ночи.
  6. Промойте мембрану 1x TBST в течение 10 минут, 3 раза.
  7. Инкубировать мембрану с раствором вторичного антитела (козье антитело IgG против кролика, конъюгированное с пероксидазой хрена, разведенное до 1:5000 с 5% обезжиренным молоком в 1х TBST) при комнатной температуре в течение 1 ч.
  8. Промойте мембрану 1x TBST в течение 10 минут, 3 раза.
  9. Визуализируйте сигналы на мембране с помощью системы визуализации вестерн-блоттинга.

6. Инъекция в почечную лоханку (РП)

  1. Предоперационная подготовка и анестезия
    1. Измерьте массу тела каждой мыши в пластиковом стакане на весах с точностью до 0,1 г.
    2. Вводите мелоксикам (5 мг/кг) подкожно в зависимости от массы тела для обеспечения предоперационной анальгезии.
    3. Разбавьте векторный раствор AAV до концентрации 6,0 x10 12 vg/мл 5% сорбитом в PBS и держите его на льду.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте на 40 мкл больше раствора AAV, чем общий объем инъекции (50 мкл x количество мышей, которые должны быть введены инъекции), чтобы учесть мертвое пространство в газонепроницаемом стеклянном шприце и полиэтиленовой трубке PE-10.
    4. Согните и отломайте только кончик иглы от иглы 30 G с помощью иглодержателя.
    5. Подсоедините под стереомикроскопом наконечник иглы 30 G, 15 см трубки PE-10, иглу 30 G и шприц из газонепроницаемого стекла в указанном порядке от наконечника (рис. 1D).
    6. Установите подключенный газонепроницаемый стеклянный шприц на насос для инфузионного шприца.
    7. Аспирируйте 90 мкл векторного раствора AAV, приготовленного на шаге 6.1.3, в газонепроницаемый стеклянный шприц с помощью инфузионного шприцевого насоса.
    8. Установите режим инфузии шприцевого насоса следующим образом: целевой объем 50 мкл и расход 50 мкл/мин.
    9. Поместите мышь в пластиковую камеру, наполненную 4% изофлураном, доставляемым в 100% кислороде со скоростью потока от 1,5 до 3,0 л/мин до полного обезболивания.
    10. Поместите морду мыши в носовой конус с потоком изофлурана от 1,5% до 3,0%. Контролируйте глубину анестезии с помощью рефлекса сжатия пальцев ног на протяжении всей хирургической процедуры.
    11. Нанесите на глаза офтальмологическую мазь с помощью аппликатора с ватным наконечником, чтобы предотвратить высыхание роговицы.
    12. Снимите шерсть с левой задней стороны мыши с помощью депилятора с помощью аппликатора с ватным наконечником.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Крем для депиляции необходимо полностью удалить путем смывания, чтобы предотвратить раздражение кожи.
    13. Поместите мышь в боковом положении на грелку с замкнутым контуром, подключенную к насосу для термотерапии, чтобы поддерживать температуру тела на уровне 37 °C (не нужно закреплять ее клейкой лентой).
    14. Продезинфицируйте выбритый участок с помощью трех чередующихся применений повидон-йода и 70% этанола с помощью аппликатора с ватным наконечником круговыми движениями, начиная с места разреза.
    15. Накройте мышь стерильной хирургической простыней.
  2. Инъекция РП в левую почку
    1. Перещипните кожу тканевыми щипцами и хирургическими ножницами сделайте разрез примерно 1 см до слоя кожи на уровне реберно-вертебрального угла в месте расположения левой почки.
    2. Сделав надрез кожи, разрежьте мышечный слой на ту же длину.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если длина разреза слишком короткая, почка не может быть обнажена, и вместо этого селезенка, которая меньше по размеру, может быть случайно обнажена. С другой стороны, если длина разреза слишком длинная, почка не будет удерживаться на месте за счет самого разреза и будет постоянно соскальзывать обратно в брюшную полость через разрез.
    3. Аккуратно надавите на живот пальцами, не касаясь непосредственно почки, так, чтобы почка обнажилась через место разреза (рисунок 1А).
    4. Минимально удалите окружающий жир так, чтобы почечная лоханка была видна в виде небольшого белого участка.
    5. Сначала зажмите мочеточник с помощью зажима для микрососудов прямого типа, а затем почечную артерию и почечную вену вместе с зажимом для микрососудов изогнутого типа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Цвет почек становится темно-красным, что подтверждает успешную блокаду притока крови в почку и из нее (Рисунок 1B).
    6. С помощью изогнутых щипцов введите иглу 30 G, соединенную со шприцевым насосом, примерно на 3 мм в полость таза и начните инъекцию 50 мкл векторного раствора AAV с помощью инфузионного шприцевого насоса со скоростью потока 50 мкл/мин в течение 1 мин (рис. 1C).
    7. Держите иглу и зажим в течение 5 минут, чтобы увеличить воздействие вектора AAV на введенную почку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подходящее время обитания может варьироваться и зависеть от капсидов AAV. Было показано, что время пребывания в течение 5 минут является достаточным для трансдукции с помощью вектора AAV-KP1 или AAV-KP3.
    8. После завершения 5-минутной инкубации снимите зажимы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Цвет почек сразу меняется с темно-красного на кроваво-красный, подтверждая восстановление кровотока в почках.
    9. Осторожно и медленно извлекайте иглу для инъекций, одновременно надавливая на место инъекции аппликатор с ватным наконечником. Следите за тем, чтобы из места инъекции не вытекала кровь. Наложение кровоостанавливающего пластыря не требуется.
    10. Аккуратно поместите почку обратно в брюшную полость.
    11. Сшить мышечный слой рассасывающимся швом 6-0 и кожу монофиламентным швом 5-0.
    12. Введите 1 мл физиологического раствора подкожно в спину мышей для поддержки жидкости.
    13. Замените использованный наконечник иглы 30 G на вновь подготовленный, выбросьте использованную иглу 30 G в соответствии с рекомендациями учреждения по обращению с опасными химическими отходами и загрузите 50 μL векторного раствора AAV с помощью насоса для инфузионного шприца для введения следующей мыши.
    14. Повторите шаги 6.2.12-6.2.13 для всех мышей в группе, кроме последней, для которых шаг 6.2.13 не требуется.
    15. После завершения всех запланированных инъекций выбросьте загрязненные иглы и полиэтиленовые пробирки в соответствии с инструкциями учреждения по обращению с опасными химическими отходами.
  3. Послеоперационный мониторинг и уход
    1. Введение мелоксикама (5 мг/кг) подкожно в спину мышам для послеоперационной анальгезии через 24 ч и 48 ч после инъекции RP.
    2. Введите 1 мл физиологического раствора подкожно в спину мышей для поддержки жидкости через 24 ч после инъекции RP.
    3. Контролируйте массу тела и общий внешний вид введенных мышей ежедневно в течение 1 недели после операции. Если происходит потеря массы тела на 10%, вводите 1 мл физиологического раствора подкожно в спину мышей три раза в неделю в течение недели. Если улучшения не наблюдается, пораженных мышей усыпляют.

7. Забор тканей и криосекция

  1. Приготовление фиксирующего и криозащитного раствора.
    1. 0,2 М фосфатный буфер (всего 1 л)
      1. Приготовьте 800 мл сверхчистой воды в стакане объемом 1 л.
      2. Добавьте в раствор 6,4 г натрия фосфата одноосновного (2PO4) и 21,8 г натрия фосфата двухосновного (Na2HPO4).
      3. Отрегулируйте pH до 7,4 с помощью соляной кислоты.
      4. Залейте ультрачистой водой до 1 л.
      5. Хранить при температуре 4 °C до использования.
    2. 4% раствор параформальдегида (PFA) (всего 40 мл)
      1. Смешайте 10 мл 16% PFA, 20 мл 0,2М фосфатного буфера, приготовленного на шаге 7.1.1, и 10 мл сверхчистой воды.
      2. Аликвота 10 мл в полипропиленовую пробирку объемом 15 мл.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте 4% раствор PFA непосредственно перед использованием для фиксации перфузии.
    3. 30% раствор сахарозы (всего 40 мл).
      1. Смешайте 30 мл PBS с 12 г сахарозы.
      2. После полного растворения заполните PBS до 40 мл.
  2. Перфузионная фиксация и забор тканей.
    ВНИМАНИЕ: Перфузионную фиксацию следует проводить в вытяжном шкафу, так как 4% раствор PFA является мощным вредным химическим веществом при вдыхании.
    1. Обезболите мышь изофлураном, расположите ее в лежачем положении, и подтвердите полное отсутствие реакции, аккуратно пощипнув конечности.
    2. После того, как мышь будет обезболена, сделайте разрез хирургическими ножницами от каудальной части живота до мечевидной кости. Затем сделайте два боковых разреза по обе стороны грудины и втяните грудную стенку спереди, чтобы обнажить сердце и крупные сосуды.
    3. Откройте правое предсердие с помощью резкого рассечения, чтобы декомпрессировать кровеносную систему. Введите иглу-бабочку 25 г в левый желудочек и введите 50 мл PBS со скоростью примерно 10 мл/мин, направляя поток к восходящей аорте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обескровливание важно для получения высококачественных иммунофлуоресцентных изображений (ИФ), поскольку кровь проявляет аутофлуоресценцию. Чтобы обеспечить полное удаление крови, в этом исследовании использовали 50 мл PBS, хотя обычно используется 20-30 мл.
    4. Влейте 20 мл 4% раствора PFA, приготовленного на шаге 7.1.2, с той же скоростью, следя за тем, чтобы во время переключения растворов не подавался воздух.
    5. Соберите ткани и храните их при температуре 4 °C в течение ночи в полипропиленовой пробирке объемом 15 мл, заполненной 4% раствором PFA для последующей фиксации. Когда в собранной ткани экспрессируется флуоресцентный белок, накройте трубку алюминиевой фольгой, чтобы защитить ее от света.
  3. Криовстраивание
    1. Перенесите ткань в полипропиленовую трубку объемом 15 мл, заполненную 30% раствором сахарозы, приготовленным на шаге 7.1.3 для криопротекции.
    2. Поддерживайте при температуре 4 °C до тех пор, пока ткани полностью не опустятся на дно пробирок.
    3. Перенесите ткань в пластический криомолд с помощью щипцов стандартного образца.
    4. Поместите ОКТ-соединение на ткань, убедившись, что ткань правильно ориентирована и находится на одном уровне с дном криоформы.
    5. Заполните сверху составом OCT. Удалите пузыри с помощью наконечника для дозатора.
    6. Поместите пластиковый криомольд в криогенную ванну, содержащую 2-метилбутан, охлажденный толченым сухим льдом в ведре со льдом, до полного замерзания ОКТ-соединения (ОКТ-соединение станет белым).
    7. Храните тканевые блоки при температуре -80 °C до использования.
  4. Криосекция
    1. Перенесите замороженные тканевые блоки в микротом криостата при температуре -20 °C перед срезом и дайте температуре замороженных тканевых блоков уравновеситься.
    2. Разрежьте каждый блок замороженной ткани до желаемой толщины (обычно 5 мкм) с помощью микротома криостата. Поместите срезы тканей на предметное стекло микроскопа для иммунофлюоресцентного окрашивания.
    3. Секции можно хранить при температуре -80 °C для последующего использования.

8. Иммунофлюоресцентное окрашивание

  1. Замороженные предметные стекла высушить при комнатной температуре в течение 30 минут.
  2. Изолируйте секцию с помощью блокатора жидкости и высушите при комнатной температуре в течение 5 минут.
  3. Регидратируйте срезы 150 мкл PBS в течение 10 мин.
  4. Поместите предметные стекла на плоскую поверхность и добавьте 150 μл 1% бычьего сывороточного альбумина (BSA), разведенного PBS, на срез. Инкубировать при комнатной температуре в течение 45 минут для блокировки.
  5. Добавьте 150 мкл раствора первичного антитела (антитело против опухоли Вильмса 1 (WT1), разбавленное до 1:100 1% БСА; антитело против котранспортера 2 Na-K-2Cl (NKCC2), разбавленное до 1:100 1% БСА; или антитело против аквапорина 2 (AQP2), разбавленное до 1:100 с 1% БСА) и инкубируйте при 4 °C в течение ночи под влажной камерой.
  6. Промыть срезы PBS при комнатной температуре в течение 5 мин, 3 раза.
  7. Добавьте 150 мкл вторичного антитела (антитело против кролика IgG Alexa Fluor 647, разбавленное до 1:500 1% BSA) и Lotus tetragonolobus lectin (LTL)-флуоресцеин (разбавленный до 1:200 с 1% BSA) и инкубируйте при комнатной температуре в течение 60 минут.
  8. Промыть секции PBS при комнатной температуре в течение 5 минут.
  9. Поместите предметные стекла на плоскую поверхность и добавьте 150 μL Hoechst 33342 (разбавленного до 1:10 000 PBS) для ядерного окрашивания. Выдерживать при комнатной температуре в течение 10 минут, защищенном от света.
  10. Промыть секции PBS при комнатной температуре в течение 5 минут.
  11. Установите слайды с помощью 20 μл монтажного носителя и защитного стекла. Держите предметные стекла в темноте при температуре 4 °C до тех пор, пока не будет выполнена визуализация.

9. Экстракция ДНК из ткани

  1. Экстракция ДНК из тканей с помощью коммерчески доступного набора (см. Таблицу материалов).
    1. Перенесите ткань в трубку с керамическими шариками и добавьте 400 мкл буфера для экстракции ДНК (100 мМ NaCl, 20 мМ ЭДТА, 1% SDS и 50 мМ Tris-HCl, pH 8,0).
    2. Гомогенизировать ткань со скоростью 5 м/с в течение 20 с в 3 циклах с помощью гомогенизатора.
    3. Центрифуга при плотности 2 000 x g при комнатной температуре в течение 2 мин.
    4. Соберите 200 мкл надосадочной жидкости с помощью пипетки P200 и добавьте 10 мкл раствора протеиназы К (конечная концентрация 1 мг/мл).
    5. Перемешать путем вортекса в течение 15 с и инкубировать при 55 °C в течение 1 ч.
    6. Добавьте 200 мкл буфера для лизиса из набора для экстракции ДНК.
    7. Перемешать путем вортекса в течение 15 с и инкубировать при 55 °C в течение 15 минут.
    8. Добавьте 250 мкл 100% этанола.
    9. Перемешать вортексированием в течение 15 с и инкубировать при комнатной температуре в течение 5 минут.
    10. Нанесите лизат на спиновую колонку для экстракции ДНК.
    11. Центрифуга при 6 000 x g при комнатной температуре в течение 1 мин.
    12. Поместите спиновую колонку в новую пробирку для сбора объемом 2 мл. Добавьте 500 мкл первого промывочного буфера из набора для экстракции ДНК.
    13. Центрифуга при 6 000 x g при комнатной температуре в течение 1 мин.
    14. Поместите спиновую колонку в новую пробирку для сбора. Добавьте 500 мкл второго промывочного буфера из набора для экстракции ДНК.
    15. Центрифуга при 6 000 x g при комнатной температуре в течение 1 мин.
    16. Поместите спиновую колонку в новую пробирку для сбора объемом 2 мл. Добавьте 500 мкл 100% этанола.
    17. Центрифуга при 6 000 x g при комнатной температуре в течение 1 мин.
    18. Поместите спиновую колонку в новую сборную пробирку объемом 2 мл и центрифугируйте при температуре 20 000 x g при комнатной температуре в течение 3 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап обеспечивает полное высыхание мембраны спиновой колонны, так как перенос этанола в элюат может помешать последующему применению.
    19. Поместите спиновую колонку в новую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл. Добавьте в спиновую колонку 35 мкл элюирующего буфера из набора для экстракции ДНК.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Объем восстановленного элюата обычно примерно на 5 мкл меньше, чем объем элюирующего буфера, первоначально нанесенного на колонку.
    20. Выдерживать при комнатной температуре в течение 5 минут.
    21. Центрифуга при плотности 20 000 x g при комнатной температуре в течение 1 мин.
    22. Измерьте концентрацию ДНК.
  2. Количественное определение числа копий векторного генома с помощью количественной ПЦР (кПЦР)
    1. Экстрагированную ДНК, полученную на стадии 9.1, разбавляют до концентрации 25 нг/мкл с молекулярной водой.
    2. Разработка праймерной пары кПЦР для количественного определения векторного генома (в данном исследовании использовался tdTomato) и праймерной пары кПЦР для референсного гена мыши, которые будут использоваться для количественного определения диплоидных геномов в экстрагированных образцах ДНК (в данном исследовании использовался ген агути мыши).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Последовательности праймеров, использованные в этом исследовании, следующие;
      tdТомат нападающий: 5'-TATGAACGGCGAGGGGAG-3'
      tdTomato задний ход: 5'-TTCCACTAGACCCTGAGCCG-3'
      мышь агути вперед: 5'-GGCGTGGTCAGTGGTTGTG-3'
      мышиный агути: 5'-TTTAGCTTCCACTAGGTTTCCTAGAAA-3'
    3. Для реакции количественной ПЦР объемом 25 мкл смешать 4 мкл разбавленного образца ДНК на стадии 9.2.1 (всего 100 нг ДНК в реакционной смеси объемом 25 мкл), 12,5 мкл 2x реакционного буфера для количественной ПЦР, 0,5 мкл прямых и обратных праймов по 20 мкМ, полученных на стадии 9.2.2 (конечная концентрация 400 нМ каждого праймера), и 7,5 мкл молекулярной воды.
    4. Измерьте концентрацию ДНК стандартов плазмид для количественной ПЦР четыре раза и определите среднее значение концентрации ДНК.
      Примечание: В данном исследовании для количественного определения и нормализации векторного генома были использованы суперспиральная кольцевая плазмида pAAV-CAG-tdTomato и суперспиральная кольцевая плазмида, содержащая целевую последовательность ПЦР, полученную из гена агути мыши, соответственно.
    5. Приготовьте серию серийных разведений стандартов плазмидной ДНК в соотношении 1:10, охватывающих динамический диапазон 10:6.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый образец и стандарт должны быть проанализированы как минимум в двух экземплярах.
    6. Выполните кПЦР с использованием следующих условий термоциклирования: начальная стадия активации нагрева при 95 °C в течение 10 мин, за которой следуют 35 циклов денатурации при 95 °C в течение 15 с и отжиг/удлинение при 60 °C в течение 30 с.
    7. После завершения реакции количественной ПЦР и получения значений числа двухцепочечных (ds) копий векторных геномов и референсного гена мыши в образцах определить количество копий ds векторного генома на диплоидный геномный эквивалент (ds-vg/dge) путем нормализации числа копий генома ds vector до числа копий референсного гена в каждом образце на основе стандартных кривых, полученных из известных концентраций как векторного генома, так и референсного гена.
      Ds-vg/dge может быть определен на основании следующего приближения, согласно которому 100 нг геномной ДНК мыши представляют 16 900 диплоидных (2N) мышиных клеток (т.е. 5,92 пг ДНК на диплоидную клетку мыши).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

В недавнем исследовании было выявлено небольшое подмножество капсидов AAV, которое демонстрирует значительное улучшение почечной трансдукции по сравнению с AAV9 после инъекции RP38. Идентифицированное подмножество включает AAV-KP3, химерный капсид AAV, полученный путем перетасовки ДНК41. Таким образом, в данном исследовании для инъекции RP был выбран AAV-KP3, а в качестве эталона — AAV9. Вектор AAV9-CAG-tdTomato (AAV9) и вектор AAV-KP3-CAG-...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В этом отчете подробно описана медленная ретроградная инъекция векторов AAV в качестве метода местного введения для доставки генов в почку мыши. Одним из важнейших шагов для безопасного выполнения инъекции РП является корректировка скорости инъекции векторов AAV, чтобы избежать повреждения паренхиматозы инъекционных почек. В предыдущем отчете о гидродинамической инъекции в почечную лоханку 100 мкл раствора плазмидной ДНК вводили в почку мыши всего за 3 с24 секунды...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

H.N. получает роялти за технологии, связанные с AAV, по лицензии Takara Bio Inc. и Capsigen Inc., выступает в качестве консультанта для биотехнологических компаний, является соучредителем Capsigen Inc. и владеет акциями Capsigen Inc. и Sphere Gene Therapeutics.

Благодарности

Мы благодарим Гуанпина Гао и Джеймса М. Уилсона за предоставление нам вспомогательной плазмиды AAV9, а также Катю Пекрун и Марка А. Кея за вспомогательную плазмиду AAV-KP3.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0.45 μm PVDF шприцевый фильтрMilliporeSigmaSLHVR33RS
Микроцентрифугальная пробирка на 1,5 мл Fisher Scientific05-408-129
Полипропиленовая пробирка на 15 млCorning352097
16% параформальдегид (ПФА)Electron Microscopy Sciences15710
Центрифугальная бутылка на 250 млFisher Scientific055641S24
2F Силовая рукавSai Infusion TechnologiesSIL-2-50 
Бабочка 25GMedex Supply26708
2-метилбутанMilliporeSigmaMX0760
2x буфер реакции qPCRFisher Scientific43-676-59Power SYBR Green PCR Master Mix
Игла 30GBecton-Dickinson & Co305106
Полипропиленовая пробирка на 50 млCorning430291
5-0 монофиламентная шовEthiconY463G
5 М NaClLonza51202
6-0 абсорбируемая шовEthiconJ489G
7.5% Mini-PROTEAN TGX предварительно заливной
белковые гели, 10-барельные, 30 µL		Bio-Rad4561023
Amersham ImageQuant 800 Western
система визуализации блотов (Cytiva)		Cytiva29459405
Amicon 100 kDa MWCO, 15 мл пробиркаMillipore SigmaUFC910024
Анти-аквапорин 2 (AQP2) антителоAbcamab199975Маркер для клеток собирательных протоков
Анти-Na-K-2Cl-котранспортер 2
(NKCC2) антитело		StressMarq BiosciencesSPC-401Маркер для клеток толстого восходящего отдела
канальца
Анти-IgG кролика Alexa Fluor 647
антитело		Jackson ImmunoResearch111-605-144
Анти-Wilms-ова опухоль 1 (WT1) антителоAbcamab89901Маркер для подоцитов
Beckman Coulter OptiSeal трубка,
полипропилен, 29,9 мл		Fisher ScientificNC9691210
Beckman Coulter OPTISEAL трубкиFisher ScientificNC9611575
BenzonaseSigma-Aldrich1016970001
Белок сыворотки быка (БСБ)Sigma-Aldrich5470
Центрифужная ультрафильтрационная трубкаMilliporeSigmaUFC9100Amicon 100 kDa MWCO, 15 мл
Трубка с керамическими шарикамиFisher Scientific15-340-154
Хлорид цезияSigma-AldrichC3032-1KG
Зажим для прикладывания силыFine Science Tools00071-14
Закрытая петля тепловой подушкиStryker Medical8002-062-012
Наконечник с ватной палочкойPuritan806-WC
Крышка стеклаFisher Scientific12-541B
Криостатный микротомTanner ScientificTN50
Изогнутые щипцыFine Science Tools11052-10
Криволинейный микрососудистый клипKleinert-Kutz65145Зажим для почечной артерии и почечной
вены
Кассета для диализаFisher ScientificPIA52976
Комплект для извлечения ДНКQiagen57704QIAamp MinElute Virus Spin Kit
D-сорбитолSigma-AldrichS6021-1KG
Модифицированная среда Дульбекко с питанием орла-
высокий уровень глюкозы		Corning15-013-CVDMEM-высокий уровень глюкозы (4,5 г/л)
ЭДТАFisher Scientific15-575-020
ЭтанолDecon Laboratories2716GEA
Фета́льная сыворотка быка (ФСБ)VWR89510-186
Газостойкий стеклянный шприцHamilton1710 TLL
Раство́р глутаральдегидаSigma-AldrichG6257
Теплотерапевтический насосKent ScientificHTP-1500
HEPESSigma AldrichH4034-100G
Hoechst 33342InvitrogenH3570
ГомогенизаторFisher Scientific15-340-163
Клетки человека эмбриональной почки (НЭК) 293
Agilent240073
Ледяная ведроFisher Scientific07-210-104
Шприц-насос для введенияHarvard Apparatus70-4507
ИзофлуранPiramal Critical CareNDC 66794-017-10
L-глутаминFisher Scientific25030-081
Ручка для блокировки жидкостиTed Pella22309
Лекция лотоса tetragonolobus (LTL)-
флуоресцеин		Vector Laboratories

Ссылки

  1. Groopman, E. E., et al. Diagnostic utility of exome sequencing for kidney disease. N Engl J Med. 380 (2), 142-151 (2019).
  2. Hussien, H., Apetrii, M., Covic, A. Health-related quality of life in patients with chronic kidney disease. Expert Rev Pharmacoecon Outcomes Res. 21 (1), 43-54 (2021).
  3. Peek, J. L., Wilson, M. H. Cell and gene therapy for kidney disease. Nat Rev Nephrol. 19 (7), 451-462 (2023).
  4. Khare, V., Cherqui, S. Targeted gene therapy for rare genetic kidney diseases. Kidney Int. 106 (6), 1051-1061 (2024).
  5. Medaer, L., Veys, K., Gijsbers, R. Current status and prospects of viral vector-based gene therapy to treat kidney diseases. Hum Gene Ther. 35 (5-6), 139-150 (2024).
  6. Tavakolidakhrabadi, N., Ding, W. Y., Saleem, M. A., Welsh, G. I., May, C. Gene therapy and kidney diseases. Mol Ther Methods Clin Dev. 32 (4), 101333(2024).
  7. Miyazaki, M., Yamashita, T., Miyazaki, T., Taira, H., Suzuki, A. Gene delivery to renal tubular epithelial cells using adeno-associated virus vector in domestic cats. Res Vet Sci. 87 (3), 408-412 (2009).
  8. Qi, Y. F., et al. Comparison of the transduction efficiency of tyrosine-mutant adeno-associated virus serotype vectors in kidney. Clin Exp Pharmacol Physiol. 40 (1), 53-55 (2013).
  9. Takeda, S., et al. Successful gene transfer using adeno-associated virus vectors into the kidney: Comparison among adeno-associated virus serotype 1-5 vectors in vitro and in vivo. Nephron Exp Nephrol. 96 (4), e119-e126 (2004).
  10. Zhong, F., et al. Protein S Protects against Podocyte Injury in Diabetic Nephropathy. J Am Soc Nephrol. 29 (5), 1397-1410 (2018).
  11. Chen, S., et al. Gene delivery in renal tubular epithelial cells using recombinant adeno-associated viral vectors. J Am Soc Nephrol. 14 (4), 947-958 (2003).
  12. Rocca, C. J., Ur, S. N., Harrison, F., Cherqui, S. rAAV9 combined with renal vein injection is optimal for kidney-targeted gene delivery: Conclusion of a comparative study. Gene Ther. 21 (6), 618-628 (2014).
  13. Wang, P., et al. Long noncoding RNA lnc-TSI inhibits renal fibrogenesis by negatively regulating the TGF-β/Smad3 pathway. Sci Transl Med. 10 (462), eaat2039(2018).
  14. Haddad, G., et al. Renal AAV2-mediated overexpression of long non-coding RNA H19 attenuates ischemic acute kidney injury through sponging of microRNA-30a-5p. J Am Soc Nephrol. 32 (2), 323-341 (2021).
  15. Asico, L. D., et al. Nephron segment-specific gene expression using AAV vectors. Biochem Biophys Res Commun. 497 (1), 19-24 (2018).
  16. Chung, D. C., et al. Adeno-associated virus-mediated gene transfer to renal tubule cells via a retrograde ureteral approach. Nephron Extra. 1 (1), 217-223 (2011).
  17. Ito, K., et al. Adeno-associated viral vector transduction of green fluorescent protein in kidney: Effect of unilateral ureteric obstruction. BJU Int. 101 (3), 376-381 (2008).
  18. Konkalmatt, P. R., et al. Renal rescue of dopamine D2 receptor function reverses renal injury and high blood pressure. JCI Insight. 1 (8), e85888(2016).
  19. Rubin, J. D., Nguyen, T. V., Allen, K. L., Ayasoufi, K., Barry, M. A. Comparison of gene delivery to the kidney by adenovirus, adeno-associated virus, and lentiviral vectors after intravenous and direct kidney injections. Hum Gene Ther. 30 (12), 1559-1571 (2019).
  20. Saito, S., et al. rAAV6-mediated miR-29b delivery suppresses renal fibrosis. Clin Exp Nephrol. 23 (12), 1345-1356 (2019).
  21. Shen, X., et al. Transparenchymal renal pelvis injection of recombinant adeno-associated virus serotype 9 vectors is a practical approach for gene delivery in the kidney. Hum Gene Ther Methods. 29 (6), 251-258 (2018).
  22. Wang, J. N., et al. Inhibition of METTL3 attenuates renal injury and inflammation by alleviating TAB3 m6A modifications via IGF2BP2-dependent mechanisms. Sci Transl Med. 14 (640), eabk2709(2022).
  23. Woodard, L. E., et al. Kidney-specific transposon-mediated gene transfer in vivo. Sci Rep. 7, 44904(2017).
  24. Woodard, L. E., et al. Hydrodynamic renal pelvis injection for non-viral expression of proteins in the kidney. J Vis Exp. (131), e56324(2018).
  25. Yadav, M. K., Yoo, K. W., Atala, A., Lu, B. Lentiviral vector mediated gene therapy for type Dent disease ameliorates Dent disease-like phenotypes for three months in CIC-5 null mice. Mol Ther Methods Clin Dev. 27, 149-166 (2022).
  26. Hillestad, M. L., Guenzel, A. J., Nath, K. A., Barry, M. A. A vector-host system to fingerprint virus tropism. Hum Gene Ther. 23 (10), 1116-1126 (2012).
  27. Zincarelli, C., Soltys, S., Rengo, G., Rabinowitz, J. E. Analysis of AAV serotypes 1-9 mediated gene expression and tropism in mice after systemic injection. Mol Ther. 16 (6), 1073-1080 (2008).
  28. Ikeda, Y., Sun, Z., Ru, X., Vandenberghe, L. H., Humphreys, B. D. Efficient gene transfer to kidney mesenchymal cells using a synthetic adeno-associated viral vector. J Am Soc Nephrol. 29 (9), 2287-2297 (2018).
  29. Williams, R. M., et al. Mesoscale nanoparticles selectively target the renal proximal tubule epithelium. Nano Lett. 15 (4), 2358-2364 (2015).
  30. Lang, J. F., Toulmin, S. A., Brida, K. L., Eisenlohr, L. C., Davidson, B. L. Standard screening methods underreport AAV-mediated transduction and gene editing. Nat Commun. 10 (1), 3415(2019).
  31. Koike, H., et al. An efficient gene transfer method mediated by ultrasound and microbubbles into the kidney. J Gene Med. 7 (1), 108-116 (2005).
  32. Ishida, R., et al. Kidney-specific sonoporation-mediated gene transfer. Mol Ther. 24 (1), 125-134 (2016).
  33. Davis, L., Park, F. Gene therapy research for kidney diseases. Physiol Genomics. 51 (9), 449-461 (2019).
  34. Rubin, J. D., Barry, M. A. Improving molecular therapy in the kidney. Mol Diagn Ther. 24 (4), 375-396 (2020).
  35. Huang, S., et al. Application of ultrasound-targeted microbubble destruction-mediated exogenous gene transfer in treating various renal diseases. Hum Gene Ther. 30 (2), 127-138 (2019).
  36. Wang, D., Tai, P. W. L., Gao, G. Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery. Nat Rev Drug Discov. 18 (5), 358-378 (2019).
  37. Wang, J. H., Gessler, D. J., Zhan, W., Gallagher, T. L., Gao, G. Adeno-associated virus as a delivery vector for gene therapy of human diseases. Signal Transduct Target Ther. 9 (1), 78(2024).
  38. Furusho, T., et al. Enhancing gene transfer to renal tubules and podocytes by context-dependent selection of AAV capsids. Nat Commun. 15 (1), 10728(2024).
  39. Ding, W. Y., et al. Adeno-associated virus gene therapy prevents progression of kidney disease in genetic models of nephrotic syndrome. Sci Transl Med. 15 (708), eabc8226(2023).
  40. Wu, G., et al. Adeno-associated virus-based gene therapy treats inflammatory kidney disease in mice. J Clin Invest. 134 (17), e174722(2024).
  41. Pekrun, K., et al. Using a barcoded AAV capsid library to select for clinically relevant gene therapy vectors. JCI Insight. 4 (22), e131610(2019).
  42. Grimm, D., et al. In vitro and in vivo gene therapy vector evolution via multispecies interbreeding and retargeting of adeno-associated viruses. J Virol. 82 (12), 5887-5911 (2008).
  43. Shen, S., et al. Engraftment of a galactose receptor footprint onto adeno-associated viral capsids improves transduction efficiency. J Biol Chem. 288 (40), 28814-28823 (2013).
  44. Dalkara, D., et al. In vivo-directed evolution of a new adeno-associated virus for therapeutic outer retinal gene delivery from the vitreous. Sci Transl Med. 5 (189), 189ra176(2013).
  45. Gomes, M. M., Wang, L., Jiang, H., Kahl, C. A., Brigande, J. V. A rapid, cost-effective method to prepare recombinant adeno-associated virus for efficient gene transfer to the developing mouse inner ear. Methods Mol Biol. 1427, 43-57 (2016).
  46. Powers, J. M., Chang, X. L., Song, Z., Nakai, H. A Quantitative dot blot assay for AAV titration and its use for functional assessment of the adeno-associated virus assembly-activating proteins. J Vis Exp. (136), e56766(2018).
  47. Adachi, K., Enoki, T., Kawano, Y., Veraz, M., Nakai, H. Drawing a high-resolution functional map of adeno-associated virus capsid by massively parallel sequencing. Nat Commun. 5, 3075(2014).
  48. Lu, Z. Y., et al. Constitutive and conditional gene knock-out mice for the study of intervertebral disc degeneration: Current status, decision considerations, and future possibilities. JOR Spine. 6 (1), e1242(2023).
  49. Kaspar, B. K., et al. Adeno-associated virus effectively mediates conditional gene modification in the brain. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (4), 2320-2325 (2002).
  50. Werfel, S., et al. Rapid and highly efficient inducible cardiac gene knock-out in adult mice using AAV-mediated expression of Cre recombinase. Cardiovasc Res. 104 (1), 15-23 (2014).
  51. Jinek, M., et al. A Programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  52. Wang, X., Huang, X., Fang, X., Zhang, Y., Wang, W. CRISPR-Cas9 system as a versatile tool for genome engineering in human cells. Mol Ther Nucleic Acids. 5 (11), e388(2016).
  53. Ueki, K., et al. Establishment of pancreatic -cell-specific gene knock-out system based on CRISPR-Cas9 technology with AAV8-mediated gRNA delivery. Diabetes. 72 (11), 1609-1620 (2023).
  54. Marichal-Gallardo, P., et al. Single-use capture purification of adeno-associated viral gene transfer vectors by membrane-based steric exclusion chromatography. Hum Gene Ther. 32 (17-18), 959-974 (2021).
  55. Guo, P., et al. Rapid and simplified purification of recombinant adeno-associated virus. J Virol Methods. 183 (2), 139-146 (2012).
  56. Chen, S. H., et al. A simple, two-step, small-scale purification of recombinant adeno-associated viruses. J Virol Methods. 281, 113863(2020).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Векторы AAVретроградная инъекция в почкигенная терапия почектрансдукция проксимальных канальцевAAV в CsClAAV в CUмодели заболеваний почектрансдукция in vivo
Эффективная и безопасная доставка генов в почку мыши путем медленной ретроградной инъекции векторов аденоассоциированного вируса в почечную лоханку
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.