Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Обнаружение ядерного блеббинга и утечки ДНК в клетках млекопитающих с помощью иммунофлюоресценции

1.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/67719

⸱

17 января 2025 г.

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of South Carolina

В этой статье

Краткое содержание

Ламинопатические расстройства часто приводят к изменениям в ядерной оболочке, что может привести к образованию ядерного пузыря и утечке. В этом исследовании представлен иммунофлуоресцентный метод визуализации ядерной пластинки вместе с двухцепочечной ДНК (дцДНК), обеспечивающий средства для оценки ядерной структуры и целостности в клетках млекопитающих.

Аннотация

Ядерная пластинка представляет собой сеть нитей, лежащих в основе ядерной мембраны, состоящую из ламинов и белков, связанных с ними. Он играет важнейшую роль в ядерной архитектуре, позиционировании ядерных пор, регуляции экспрессии генов, организации хроматина, репликации ДНК и репарации ДНК. Мутации в генах, участвующих в экспрессии или посттрансляционной обработке белков ламина, приводят к генетическим нарушениям, известным как ламинопатии. В частности, мутации в генах LMNA или ZMPSTE24 могут привести к накоплению не полностью переработанных форм ламина А, которые сохраняют фарнезиловые и метильные группы, отсутствующие в полностью переработанном ламине А. Эти не полностью обработанные белки ламина А локализуются во внутренней ядерной мембране, а не в ядерной пластинке, где находится зрелый ламин А. Неправильно локализованные ламинные белки глубоко нарушают ядерную функцию и структуру, что часто приводит к ядерному блеббингу. В тяжелых случаях может произойти разрыв ядра, вызывающий потерю компартментализации и утечку геномной ДНК в цитозоль. Аномальная структура ядра и потеря компартментализации могут быть идентифицированы с помощью непрямой иммунофлюоресценции (ИФ) на фиксированных клетках. В этом исследовании описывается такой метод, использующий специфические антитела против белка ламина и двухцепочечной ДНК (дцДНК) для одновременной визуализации ядерной оболочки и ДНК. Такой подход позволяет быстро оценить структурную целостность ядра и потенциальную утечку ядерной ДНК в цитозоль.

Введение

Ядерная пластинка представляет собой сеть нитей, которая лежит в основе ядерной мембраны и состоит из белков, называемых ламинами. Ядерная пластинка играет важную роль в ядерной архитектуре, позиционировании ядерных пор, регуляции экспрессии генов, организации хроматина, репликации ДНК и репарации ДНК 1,2,3. Мутации в генах, которые играют роль в экспрессии белков ламина, приводят к генетическим нарушениям, называемым ламинопатиями.

Рестриктивная дермопатия (РД) — это тяжелое заболевание ламинопатии, вызванное преимущественно сложными гетерозиготными мутациями, которые создают преждевременные терминирующие кодоны в генеZMPSTE24 4, что приводит к отсутствию металлопротеазы ZMPSTE24. Эта ламинопатия характеризуется задержкой внутриутробного развития, плотной, жесткой кожей, маленьким размером рта, тонкими волосами и дефектами минерализации костей1. Пациенты с ПД обычно не доживают до первой недели жизни из-за легочной недостаточности1. Два других расстройства ламинопатии, известные как атипичный синдром прогерии Хатчинсона-Гилфорда (AT-HGPS) и мандибулоакральная дисплазия типа B (MAD-B), связаны со сниженной экспрессией ZMPSTE24 и связаны с уменьшением продолжительности жизни и демонстрируют сходство с расстройствами преждевременного старения5. Протеаза ZMPSTE24, которая воздействует при этих ламинопатиях, жизненно важна для посттрансляционной модификации ламины А, которая является критическим компонентом ядерной пластинки. ZMPSTE24 дефицит приводит к накоплению не полностью переработанной фарнезилированной формы ламина А, известной как преламинА2.

figure-introduction-1
Рисунок 1: Обработка ламина А в норме и . RD-клетки. Процессинговый путь ламина А в нормальных клетках (слева) и процессинг измененного ламина А в RD, или клетки с дефицитом ZMPSTE (справа). Указаны фарнезиловые (Fa) и метильные (Me) группы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Как видно на рисунке 1, при нормальном процессинге ламина А фарнезильная (липидная) группа присоединяется к остатку цистеина вблизи С-конца, после чего происходит протеолитическое расщепление трех С-концевых аминокислот 3,6. Затем остаток цистеина метилируется. Эти две модификации позволяют нацелить преламин А на внутреннюю ядерную мембрану2. Затем ZMPSTE24 проводит реакцию расщепления, в ходе которой последние 15 С-концевых аминокислот вместе с фарнезильными и метильными группами удаляются с образованием зрелого белка Ламина А, который доставляется в ядерную пластинку 6,7,8. В RD, AT-HGPS и MAD-B заключительная стадия процессинга не происходит эффективно, поскольку ZMPSTE24 металлопротеиназа отсутствует или неполностью функциональна. Это приводит к накоплению преламина А, который остается постоянно фарнезилированным и метилированным9. Эти последние группы приводят к тому, что преламин А прилипает к внутренней ядерной мембране вместо того, чтобы локализоваться в ядерной пластинке, где в конечном итоге должен находиться зрелый ламин А, как показано на рисунке 1. Таким образом, дефицит ZMPSTE оказывает глубокое воздействие на различные ядерные функции, наряду со структурой ядра 10,11,12,13,14,15. Эти изменения в структуре ядра могут включать в себя ядерное блеббинг и даже разрыв ядра, что может привести к утечке ДНК в цитозоль, а также к проникновению цитозоля в ядро. Ядра аберрантной формы действительно являются отличительной чертой ламинопатийных расстройств, наряду со многими другими фенотипами, которые вызваны дефектным процессингом преламина А16,17. Дефекты в ядерной пластинке приводят к множеству пагубных последствий, включая неправильную локализацию контроля качества ядерных белков и белков репарации ДНК в нуклеоплазме, что, в свою очередь, приводит к многочисленным дефектам в ядерной функции. Важно иметь простую методику, которая может помочь идентифицировать и контролировать эти признаки ламинопатий, чтобы облегчить исследования по разработке терапевтических подходов, направленных на улучшение фенотипов ламинопатии. Для мышей с ламинопатиями было показано, что элиминация ядерного блеббинга коррелирует с общей элиминацией фенотипов ламинопатии16. Метод, позволяющий осуществлять мониторинг ядерной целостности в клетках человека, может улучшить изучение потенциальных методов лечения для устранения или значительного улучшения фенотипов заболеваний.

Непрямая иммунофлуоресценция (ИФ) является чувствительным и широко используемым методом, в котором используется как первичное немеченое антитело, так и меченное флуорофором вторичное антитело, которое распознает первичное антитело для обнаружения интересующеймишени 19. Методы ПЧ могут предоставить мощные средства для визуализации конкретных внутриклеточных компонентов и структур. Также возможно, что более одной молекулы вторичного антитела могут взаимодействовать с первичным антителом, что приводит к усилению сигнала19. Непрямая ПЧ является универсальным методом, который также позволяет обнаруживать множественные первичные антитела с относительно небольшим набором вторичных антител, поскольку вторичные антитела поднимаются против Fc-домена первичного антитела, который консервативен в пределах вида19.

В данной статье описывается метод косвенного (ЕСЛИ) для оценки ядерного блеббинга и утечки ДНК в клетках с дефицитом ZMPSTE24 с использованием антител против двухцепочечной ДНК (дцДНК) и ламина B1 для обнаружения ДНК и ядерной пластинки соответственно. Чтобы продемонстрировать полезность этого подхода, процедура была применена к клеточной линии HeLa с нокаутированной экспрессией ZMPSTE24, а также к клеточной линии HeLa, экспрессирующей ZMPSTE24, и результаты для двух клеточных линий были сравнены.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Подробная информация об используемых реагентах и оборудовании приведена в Таблице материалов.

1. Подготовка материалов

  1. Автоклав не менее десяти квадратных стеклянных покровных колпачков и щипцов размером 22 мм x 22 мм перед нанесением ячеек на покровные стекла.

2. Приготовление растворов

  1. Дополнительные среды: Приготовьте 500 мл модифицированной орлиной среды (DMEM) от Dulbecco с 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS), 100 ЕД/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина.
  2. Буфер для разведения антител (ADB): Растворите 2 г бычьего сывороточного альбумина (BSA) и 1 г рыбьего желатина в 80 мл 1x фосфатно-солевого буфера (PBS). Доведите до 100 мл PBS после растворения BSA и рыбьего желатина.
  3. 1x PBS-Tween (PBS-T): Приготовьте 500 мл PBS и 0,5 мл Tween. Поместите на водяную баню при температуре 37 °C до тех пор, пока Tween не сможет легко смешаться с раствором.

3. Выращивание нужных клеток

Примечание: Клетки HeLa выращивали по этому протоколу до конфлюенции в колбе T75.

  1. Сбрызните шесть покровных стекол 70% этанолом и дайте им высохнуть на воздухе на безворсовой салфетке. Поместите покровные листы в стерильный 6-луночный планшет с помощью щипцов, по одному покровному листу на лунку.
  2. Добавьте по 2 мл дополненного DMEM в каждую лунку в 6-луночном планшете.
  3. Отсадите среду из клеток и промойте клетки, добавив в колбу 15 мл PBS, аккуратно взбалтывая. Аспирируйте PBS и добавьте 2 мл трипсина-ЭДТА (трипсина).
    1. Смажьте клетки трипсином и поместите колбу обратно в инкубатор, увлажненный при температуре 37 °C и 5%CO2 , на 2 минуты, чтобы клетки могли отсоединиться от колбы.
  4. Добавьте в колбу 8 мл дополненного DMEM для сбора трипсинизированных клеток. Проведите пипеткой вверх и вниз несколько раз, чтобы отделить комкующиеся ячейки. Соберите клеточную суспензию в колбу и поместите ее в полистирольную пробирку объемом 15 мл.
  5. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра.
  6. Добавляйте 500 000 ячеек, капля за каплей, непосредственно на каждый из покровных стекол в 6-луночном планшете. Дайте клеткам вырасти в течение ночи при 37 °C и 5%CO2 в увлажненном инкубаторе.

4. Фиксация и пермеабилизация клеток

  1. Перед применением приготовьте 4% раствор формальдегида в свежем виде: Добавьте 2 мл 37,5% раствора формальдегида в 18 мл PBS. Тщательно перемешиваем.
  2. Приготовьте свежий раствор для пермеабилизации перед использованием: добавьте 100 μл Triton-X в 20 мл PBS. Дайте поинкубироваться на водяной бане при температуре 37 °C в течение нескольких минут, пока Triton-X не растворится в растворе. Тщательно перемешиваем.
  3. Отсасывайте среду в лунки пластины. Промойте ячейки один раз 2 мл PBS. Отсасывайте все PBS из лунок.
  4. Добавьте в каждую лунку по 2 мл 4% раствора формальдегида. Оставьте на 10 минут при комнатной температуре (RT). Полностью отасывайте 4% формальдегида из лунок.
  5. Промойте ячейки 3 раза 2 мл PBS. Полностью удаляйте PBS из лунок после каждой промывки.
  6. Добавьте по 2 мл раствора для пермеабилизации в каждую лунку. Оставьте на 10 минут на RT. Полностью аспирируйте раствор для пермеабилизации.
  7. Промойте ячейки 3 раза 2 мл PBS. Полностью аспирируйте PBS после первых двух промывок, оставляя PBS в лунках после третьей промывки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Элементы можно хранить в последней промывке PBS при температуре 4 °C в течение нескольких недель после этого этапа, обеспечивая герметичность пластины парафиновой пленкой во избежание испарения жидкости. Если процедуру можно продолжить, этот шаг можно пропустить.

5. Иммунофлюоресцентное окрашивание

  1. Удалите все PBS из лунок. Заблокируйте ячейки, добавив 2 мл ADB в каждую лунку, и инкубируйте при RT, покачивая в течение 30 минут.
  2. К концу 30-минутного времени блокировки смешайте первичное разведение антител в ADB (разведение 1:1000 для антител к Lamin B1 и dsDNA, Таблица 1). Для каждого покровного стекла необходимо 75 μл, поэтому для шести покровных покрытий следует смешать 600 μл ADB, 0,6 μл первичного антитела Lamin B и 0,6 μL антитела к дцДНК. Вортекс тщательно.
  3. Удалите ADB из скважин. На плоскую поверхность приклейте скотчем кусок парафиновой пленки, площадь которого достаточно велика, чтобы уложить все обрабатываемые покровные стекла.
  4. Для каждого покровного стекла добавьте 75 мкл первичного разведения антител на парафиновую пленку, следя за тем, чтобы в ADB не образовывались пузырьки. Затем положите покровную ячейку вниз на каплю ADB с помощью щипцов.
  5. Накройте инкубационные крышки крышкой луночного планшета и дайте инкубироваться в течение 1 часа при RT.
  6. Снимите покровные стекла с парафиновой пленки с помощью щипцов и поместите их обратно в 6-луночный планшет стороной ячейки вверх.
  7. Промойте покровные стекла 3 раза 2 мл PBS-T, каждый раз покачиваясь в течение 3-5 минут. Удаляйте все PBS-T из лунок после каждой промывки.
  8. Во время последней промывки приготовьте разведение вторичных антител (1:1000 для обоих соответствующих вторичных антител, Таблица 1). Для каждого покровного стекла необходимо 75 μл, поэтому для шести покровных покрытий следует смешать 600 μл ADB и 0,6 μл обоих вторичных антител, меченных Alexa Fluor. Вортекс тщательно. Максимально прикрывайте вторичное разведение антител от света.
АнтителоИсточникКомпанияСсылка
Антитела к маркерам дцДНК (HYB331-01)Мышь моноклональнаяСанта-КрусСК-58749
Козье антимышиное антитело IgG (H+L) с высокой степенью перекрестной адсорбции, Alexa Fluor Plus 488КозаТермоФишерА32723
Козье антимышиное антитело IgG (H+L) с высокой степенью перекрестной адсорбции, Alexa Fluor Plus 405КозаИнвитрогенА31553
Поликлональное антитело к ламину B1КроликПротеинтек12987-1-АП
Козье антитело против кролика IgG (H+L) с высокой степенью перекрестной адсорбции, Alexa Fluor 594КозаИнвитрогенА11037

Таблица 1: Антитела. Список всех антител, используемых в этом протоколе.

  1. Удалите все PBS-T с последней стирки. Инкубируйте покровные стекла во вторичном разведении антител на парафиновой пленке, как на этапе 5, в течение 30 минут при RT. Защищайте от света на этом этапе и на всех остальных этапах. Для экранирования света можно использовать небольшой ящик. Убедитесь, что вы работаете быстро, когда это необходимо, чтобы добавить или удалить растворы из скважин.
  2. Снимите покровные стекла с парафиновой пленки с помощью щипцов и поместите их обратно в 6-луночный планшет ячейкой вверх.
  3. Промойте покровные стекла 3 раза 2 мл PBS-T. Удаляйте все PBS-T из лунок после каждой промывки.
  4. Обезвоживайте предметные стекла с помощью этанола (70%, 90%, 100%). Начните с добавления 2 мл 70% этанола в каждую лунку. Дайте постоять 1-2 минуты и удалите весь этанол из лунок. Повторите то же самое с оставшимся процентом этанола.
  5. Снимите покровные стекла с лунок с помощью щипцов и дайте им высохнуть на воздухе, защищенном от света, на безворсовой салфетке.
  6. Установите покровное стекло клеточной стороной вниз на предметное стекло микроскопа, используя 20 мкл монтажного материала на каждое покровное стекло. Дайте высохнуть в течение ночи, защищенное от света место.

6. Получение изображения

  1. Перед нанесением изображения покройте края покровных лаков тонким слоем прозрачного лака для ногтей (подойдет любая марка или тип). Дайте высохнуть на воздухе в защищенном от света месте.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Инструкции по использованию микроскопа для получения изображений могут различаться в зависимости от используемого микроскопа. Разрешение камеры на используемом здесь микроскопе составляет 1280 x 960 пикселей. Будет достаточно аналогичного или лучшего разрешения.
  2. Перед тем, как поставить предметное стекло на предметный столик микроскопа, необходимо отрегулировать параметры сохранения файлов. Включите микроскоп и вставьте USB-накопитель. Отрегулируйте параметры сохранения в настройках микроскопа и убедитесь, что все каналы (GFP и RFP) будут сохраняться отдельно, а изображения будут отправляться в правильное место на USB-накопителе.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Создайте папку на USB-накопителе и присвойте каждой обложке собственное имя для дальнейшего использования.
  3. Перед визуализацией распылите на безворсовую салфетку с 70% этанолом и аккуратно очистите обратную сторону предметных стекол. Аккуратно очистите переднюю часть слайдов, обеспечивая минимальное давление.
  4. Положите на микроскоп чистое предметное стекло покровными стеклами вниз. Накройте световым щитом коробку.
  5. Используя объектив с 40-кратным увеличением, используйте соответствующий канал (RFP для используемого здесь антитела к ламину B1) для определения местоположения ядер на экране микроскопа. Для начала отрегулируйте интенсивность света примерно до 50%.
  6. Чтобы проверить наличие перенасыщенных областей, выберите опцию «Выключить цвет» и убедитесь, что ни на одной области покровного стекла нет красного сигнала в черно-белом режиме. Если красного сигнала много, уменьшите интенсивность света до тех пор, пока не появится минимальный красный сигнал.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Красный сигнал указывает на перенасыщение. Если ядра кажутся едва заметными, увеличивайте интенсивность с шагом 10% до тех пор, пока не будет достигнута соответствующая интенсивность без пересыщения.
  7. Проверьте все остальные покровные стекла с той же интенсивностью, чтобы убедиться, что они не перенасыщены. Проверьте все покровные листы с помощью другого канала, используя тот же процесс, что и выше (GFP для антител к дцДНК, используемый здесь).
  8. Запишите интенсивность света для каждого канала. Убедитесь, что интенсивность света для каждого канала остается постоянной на протяжении всего процесса визуализации.
  9. Сфотографируйте каждый покровный лист по отдельности. Начните с первого канала, сфокусируйте ядра и сделайте снимок.
  10. Осторожно переключайте каналы и снова сфокусируйте клетки. Когда вы сфокусированы, сделайте снимок.
  11. После захвата изображений в необходимых каналах (GFP и RFP) выберите Наложение , чтобы наблюдать за объединенным изображением и убедиться, что слайд не двигался во время съемки. Если каналы не перекрываются, повторяйте нужный канал до тех пор, пока изображения не выровняются.
  12. Сохраните изображение, нажав на иконку флешки . Перейдите в другое место на покровном листе, чтобы продолжить съемку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что каждый раз визуализируется новая область покровного стекла, чтобы избежать повторного захвата одной и той же области. Рекомендуется начинать съемку с верхнего левого угла покровного стекла и двигаться по S-образной схеме, чтобы обеспечить полное покрытие без дублирования.

7. Анализ данных

  1. Данные, полученные с помощью этого метода, являются визуальными. Изучите изображения на наличие признаков утечки ДНК или ядерного блекбинга. Примеры блеббинга и утечки показаны в разделе репрезентативных результатов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

В этом исследовании представлен метод ПЧ для визуализации ядерной пластинки в сочетании с двухцепочечной ДНК (дцДНК). После проведения ПЧ полученные изображения могут быть исследованы на наличие признаков ядерного блеббинга и утечки ДНК.

figure-results-1
Рисунок 2: Ядерный блеббинг в клетках HeLa CT и ZM...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Представленный протокол содержит несколько критических этапов, наиболее важным из которых является лечение фиксированных клеток первичными и вторичными антителами. Обеспечение использования первичного антитела хорошего качества против исследуемой мишени с правильным соответствующим вторичным антителом с флуорофорами в пределах используемого микроскопа даст оптимальныерезультаты. Качество антитела может оказать значительное влияние на результаты применения данного ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантом Национального института по проблемам старения R03AG064525 ASW. Мы хотели бы поблагодарить доктора Джейсона А. Стюарта за помощь в наставничестве в области техники и лабораторию Хуэй Чен за предоставленный микроскоп. Мы также хотели бы поблагодарить Фабио Мартинона за клеточные линии HeLa, использованные в этих экспериментах.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
22 мм Квадратные стеклянные покровные стеклаPropper Manufacturing CompanyM8710Можно использовать любой размер или форму, при условии, что они могут быть закреплены на стандартном предметном стекле микроскопа.
36,5% формальдегидSigma AldrichF8775фиксирующий реагент
75 см 2 колбыCorning430725UДля клеточных культур. 
Бычья сыворотка альбинум (BSA)Fisher Scientific9048-46-8Буфер для разведения антител. 
DMEM с 1 г/л глюкозы, L-глутамина и пирувата натрияCorning10-014-CVДля клеточных культур.
Этанол (200 Proof)Decon Laboratories2701Для обезвоживания образцов перед монтажом, разбавленных до получения кратных концентраций.
EVOS FL Цифровой инвертированный флуоресцентный микроскоп FisherScientific12-563-460Imaging. 
Рыбий желатинSigma AldrichG7041Буфер для разведения антител. 
Фторомант-ГSouthern Biotech0100-01Монтажная среда для предотвращения фотообесцвечивания.
Парапленка (4 дюйма)Fisher Scientific13-374-12Любой размер может быть заменен, при условии, что используемые покровные стекла могут поместиться.
Пенициллин-стрептомицинGibco15-140-122Для клеточной культуры.
Фосфатно-солевой буфер (PBS)N/AN/AИзготовлен и стерилизован в лаборатории для культивирования тканей и растворов.
Сыворотка для плода крупного рогатого скота премиум-класса (FBS)Atlanta BiologicalsS11150для клеточных культур. 
Superfrost Premium Microscope SlidesFisher Scientific12-544-7Можно использовать любые стандартные предметные стекла для микроскопа.
Культура тканей обработана 6-луночными планшетами с плоским дномFalcon353046для культивирования клеток.
TritonX-100Thermofisher ScientificA16046. APДля стирки.
Трипсин-ЭДТА (0,5%)Gibco15-400-054Для клеточных культур.
Tween 20Fisher Scientific9005-64-5Реагент для проникновения клеток. 
.

Ссылки

  1. Navarro, C. L., et al. New ZMPSTE24 (FACE1) mutations in patients affected with restrictive dermopathy or related progeroid syndromes and mutation update. Eur J Hum Genet. 22 (8), 1002-1011 (2014).
  2. Dittmer, T. A., Misteli, T. The lamin protein family. Genome Biol. 12 (222), 1-16 (2011).
  3. Gruenbaum, Y., Margalit, A., Goldman, R. D., Shumaker, D. K., Wilson, K. L. The nuclear lamina comes of age. Nat Rev Mol Cell Biol. 6, 21-31 (2005).
  4. Navarro, C. L., et al. Lamin A and ZMPSTE24 (FACE-1) defects cause nuclear disorganization and identify restrictive dermopathy as a lethal neonatal laminopathy. Hum Mol Genet. 13 (20), 2493-2503 (2004).
  5. Barrowman, J., Wiley, P. A., Hudon-Miller, S. E., Hrycyna, C. A., Michaelis, S. Human ZMPSTE24 disease mutations: Residual proteolytic activity correlates with disease severity. Hum Mol Genet. 21 (18), 4084-4093 (2012).
  6. Richards, S., Muter, J., Ritchie, P., Lattanzi, G., Hutchison, C. The accumulation of un-repairable DNA damage in laminopathy progeria fibroblasts is caused by ROS generation and is prevented by treatment with N-acetyl cysteine. Hum Mol Genet. 20 (20), 3997-4004 (2011).
  7. Davies, B. S., Fong, L. G., Yang, S. H., Coffinier, C., Young, S. G. The post-translational processing of prelamin A and disease. Annu Rev Genomics Hum Genet. 10, 153-174 (2009).
  8. Barrowman, J., Hamblet, C., George, C. M., Michaelis, S. Analysis of prelamin A biogenesis reveals the nucleus to be a CaaX processing compartment. Mol Biol Cell. 19, 5398-5408 (2008).
  9. Young, S., Meta, M., Yang, S. H., Fong, L. G. Prelamin A farnesylation and progeroid syndromes. J Biol Chem. 281 (52), 39741-39745 (2006).
  10. Houthaeve, G., Robijns, J., Braeckmans, K., De Vos, W. H. Bypassing border control: Nuclear envelope rupture in disease. Physiol. 33 (1), 39-49 (2017).
  11. Schreiber, K. H., Kennedy, B. K. When lamins go bad: Nuclear structure and disease. Cell. 152 (6), 1365-1375 (2013).
  12. Fong, L. G., et al. Heterozygosity for Lmna deficiency eliminates the progeria-like phenotypes in Zmpste24-deficient mice. Proc Natl Acad Sci USA. 101 (52), 18111-18116 (2004).
  13. Pendas, A. M., et al. Defective prelamin A processing and muscular and adipocyte alterations in Zmpste24 metalloproteinase-deficient mice. Nat Genet. 31, 94-99 (2002).
  14. Goldman, R. D., et al. Accumulation of mutant lamin A causes progressive changes in nuclear architecture in Hutchinson-Gilford progeria syndrome. Proc Natl Acad Sci USA. 101, 8963-8968 (2004).
  15. Eriksson, M., et al. Recurrent de novo point mutations in lamin A cause Hutchinson–Gilford progeria syndrome. Nature. 423, 293-298 (2003).
  16. Young, S. G., Fong, L. G., Michaelis, S. Thematic review series: Lipid post-translational modifications. Prelamin A, Zmpste24, misshapen cell nuclei, and progeria—new evidence suggesting that protein farnesylation could be important for disease pathogenesis. J Lipid Res. 46 (12), 2531-2558 (2005).
  17. Worman, H. J., Michaelis, S. Prelamin A and ZMPSTE24 in premature and physiological aging. Nucleus. 14 (1), 1-17 (2023).
  18. Pande, S., Ghosh, D. K. Nuclear proteostasis imbalance in laminopathy-associated premature aging diseases. FASEB J. 37 (8), 1025-1035 (2023).
  19. Odell, I. D., Cook, D. Immunofluorescence techniques. J Invest Dermatol. 133 (4), 1-12 (2013).
  20. Kumar, V. Immunofluorescence and enzyme immunomicroscopy methods. J Immunoassay Immunochem. 21 (2-3), 235-253 (2000).
  21. Tjaden, A., Giessmann, R. T., Knapp, S., Schroder, M., Muller, S. High-content live-cell multiplex screen for chemogenomic compound annotation based on nuclear morphology. STAR Protoc. 3 (101791), 1-15 (2022).
  22. Gunn, A. L., Yashchenko, A. I., Dubrulle, J., Johnson, J., Hatch, E. M. A high-content screen reveals new regulators of nuclear membrane stability. Sci Rep. 14, 6013(2024).
  23. Yu, L., Liu, P. Cytosolic DNA sensing by cGAS: Regulation, function, and human diseases. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (170), 1-14 (2021).
  24. Odinammadu, K. O., et al. The farnesyl transferase inhibitor (FTI) lonafarnib improves nuclear morphology in ZMPSTE24-deficient fibroblasts from patients with the progeroid disorder MAD-B. Nucleus. 14 (1), 1-14 (2023).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

ZMPSTE24HeLa
Обнаружение ядерного блеббинга и утечки ДНК в клетках млекопитающих с помощью иммунофлюоресценции
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.