Методическая статья

Усовершенствованная методология изучения постнатального остеогенеза через интрамембранозное окостенение в модели повреждения костного мозга мышей

DOI:

10.3791/67727

⸱

7 февраля 2025 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Orthopedic Surgery, UConn School of Medicine, 2Department of Neuroscience, UConn School of Medicine

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Модель повреждения костного мозга мышей является полезным инструментом для изучения постнатального остеогенеза посредством внутримембранозной оссификации. Этот упрощенный хирургический протокол описывает процедуру абляции костного мозга для последующей оценки новых костных образований и клеточных реакций после травмы.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Травмы длинных костей заживают эндохондральными или внутримембранозными путями формирования костей. В отличие от эндохондрального пути, для которого требуется хрящевая матрица, процесс внутримембранозной оссификации включает в себя прямую конверсию скелетных стволовых и прогениторных клеток (SSPC) в костеобразующие остеобласты. Существуют ограниченные хирургические методы для моделирования этого процесса на экспериментальных мышах. В данной работе мы улучшили модель повреждения костного мозга у мышей, чтобы облегчить изучение восстановления кости путем внутримембранозной оссификации и оценить постнатальные регуляторы остеогенеза. Этот метод отличается высокой воспроизводимостью и удобством в использовании, а также позволяет проводить временную оценку образования новой кости в течение короткого периода времени (3-7 дней после травмы) с помощью микрокомпьютерной томографии (μКТ) и гистологии замороженного среза. Кроме того, вклад SSPC и зрелых остеобластов может быть легко оценен с помощью комбинации флуоресцентных репортерных мышей и этой модели внутримембранозного повреждения костного мозга. В клинических условиях внутримембранозное формирование кости актуально для заживления дефектов критического размера, стабилизированных переломов, кортикальных дефектов, травм в результате резекции опухоли и замены суставов.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Травмы длинных костей заживают через эндохондральный или интрамембранозный путь формирования кости. В отличие от эндохондрального пути, который требует этапа предшественника хряща, восстановление кости путем внутримембранозной оссификации включает прямую конверсию скелетных стволовых и прогениторных клеток (SSPCS) в костеобразующие остеобласты1. Клинически этот процесс актуален для заживления костей в различных контекстах, включая дефекты критического размера, стабилизированные переломы, кортикальные дефекты, дистракционный остеогенез, травму от резекции опухоли и остеоинтеграцию имплантатов эндопротезирования суставов 2,3. Интересно, что в исследованиях пациентов с переломами длинных костей у 66%-82% были переломы со смещением, которые требовали фиксирующих устройств для стабилизации кости 4,5. Эти жестко стабилизированные кости в первую очередь заживают за счет внутримембранозного окостенения, поскольку сломанные концы костей вступают в прямой контакт друг с другом 6,7. Тем не менее, механистическая регуляция интрамембранозной регенерации кости остается относительно малоизученной по сравнению с формированием кости через эндохондральные пути. Одобренные Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) методы лечения для ускорения заживления костей затруднены ограниченной клинической эффективностью и высокой стоимостью, а также связаны со значительными побочными эффектами8.

Механическая абляция костного мозга представляет собой ценную модель для изучения внутримембранозного формирования костной ткани. Эта простая модель травмы позволяет изучать регенерацию костной ткани в костном мозге без разрушения кортикальной кости. После абляции КМ процесс заживления включает в себя отдельные, но перекрывающиеся фазы. Начальная фаза наступает в первые 1-5 дней и включает в себя образование тромбов и воспаление, когда воспалительные клетки и цитокины инициируют заживление. С 3 по 14 день вторая фаза характеризуется регенерацией, включающей неоваскуляризацию, миграцию и пролиферацию мезенхимальных стволовых клеток (МСК), остеобластическую дифференцировку и формирование тканой кости. Заключительная фаза ремоделирования начинается примерно через 10 дней после операции, костная ткань подвергается созреванию и реструктуризации до тех пор, пока костный мозг полностью не восстановится к56-9 дню. Эта быстрая временная шкала заживления делает модель абляции КМ идеальной для изучения ранних реакций на восстановление кости, особенно в критические периоды воспаления, рекрутирования клеток-предшественников и дифференцировки остеобластов. Используя такие методы, как гистология, проточная цитометрия и количественный анализ μКТ, можно оценить клеточные реакции и формирование кости на ранних стадиях восстановления. Используя вышеупомянутые методы, модель абляции КМ может дать представление о механизмах внутримембранозной регенерации кости и помочь в определении ключевых терапевтических мишеней для улучшения заживления костей.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Следующие процедуры были выполнены с одобрения Комитета по уходу за животными и их использованию (IACUC) Центра здоровья Университета Коннектикута. Все операции проводились в стерильных условиях, как указано в рекомендациях Национальных институтов здравоохранения (NIH). Боль и риск инфекций контролировались с помощью надлежащих анальгетиков и антисептиков для обеспечения успешного исхода.

1. Подготовка операционного поля и инструментов

  1. Подготовьте кабинет для хирургических процедур, продезинфицировав рабочие поверхности дезинфицирующим средством клинического класса.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Хирург должен носить соответствующие средства индивидуальной защиты (СИЗ), включая стерильные одноразовые перчатки, чепчик для волос, халат и маску.
  2. Подготовьте грелку, накрытую стерильной хирургической прокладкой. Соберите и расставьте все стерильные инструменты и реактивы (Таблица материалов) с удобным доступом.

2. Предоперационная анестезия

  1. Взвесьте всех мышей перед операцией. Рассчитайте объемы используемого анальгетика на основе имеющейся рецептуры бупренорфина.
  2. Соберите блок для анестезии животных в стерильном рабочем пространстве, которое включает в себя индукционную камеру и узел носового конуса. Установите выход кислорода на уровне 2 л мин-1 и изофлурана на 1,5-3% (v/v) в зависимости от возраста и веса мыши.
  3. После того, как мышь будет успокоена, извлеките животное из индукционной камеры и поместите его на стерильную хирургическую прокладку в положении лежа на спине. Нанесите офтальмологическую смазку на оба глаза. Поместите носовой конус над головой. Убедитесь, что мышь адекватно обезболивается, осторожно пощипнув палец ноги. Прежде чем продолжить, убедитесь, что рефлекторная реакция задних конечностей отсутствует.
  4. Перед операцией кратковременно удалите мышь из носового конуса, чтобы ввести общую дозу бупренорфина с пролонгированным высвобождением подкожным путем; Общая доза составляет 3,25 мг/кг.

3. Описание хирургической процедуры

ПРИМЕЧАНИЕ: В этой хирургической процедуре используются самцы и самки мышей C57BL/6 в возрасте от 10 недель до 24 недель. Процедуру можно проводить на мышах в возрасте от 6 недель до 33 недель, а также на различных инбредных линиях, как показано на других10,11. Молодым мышам может потребоваться более короткая длина иглы, в то время как более старым или крупным мышам может потребоваться более длинная игла.

  1. Наполните шприц объемом 3 мл, оснащенный иглой 26 G, стерильным физиологическим раствором. Отложите его в сторону.
  2. Удалите шерсть с задней конечности, на которой будет проводиться процедура, с помощью электрических машинок для стрижки или машинки с питанием от батареек (лезвие #40) и удалите выпавшую шерсть с операционного поля. С помощью стерильных аппликаторов с ватным наконечником обработайте место операции скрабом на основе йода (10% повидон-йода), а затем 70% изопропиловым спиртом. Потрите место операции, начиная с центра колена и делая круговой взмах наружу. Дайте участку высохнуть. Повторите шаги скраба 3 раза.
  3. Положите мышь на заднюю часть и согните колено операционной ноги. Держите ногу мыши в недоминантной руке так, чтобы колено было согнуто над средним пальцем, второй палец упирался в бедренную кость, а большой палец упирался в большеберцовую кость.
  4. Сделайте небольшой неглубокий горизонтальный надрез чуть ниже коленной чашечки с помощью скальпеля.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг улучшает визуализацию места введения. С опытом этот шаг можно пропустить.
  5. Найдите суставное пространство, поместив иглу горизонтально поперек согнутого колена и нащупав пространство между бедренной и большеберцовой костью. Используя этот анатомический участок в качестве ориентира, возьмите иглу 25 G и вручную просверлите (поворачивая иглу и одновременно оказывая умеренное давление на иглу) в дистальный отдел бедренной кости от колена к проксимальному отделу. Введите иглу через коленную чашечку или вокруг нее.
  6. Просканируйте мышь рентгеном, чтобы убедиться, что игла правильно размещена в костномозговой полости, как можно ближе к центру (Рисунок 1).
  7. Извлеките иглу 25 G и немедленно введите иглу 26 G в то же отверстие в полости костного мозга. Разверните боковые стороны костномозговой полости круговыми движениями не менее 5 раз, пока она не станет гладкой. Следите за тем, чтобы количество движений развертывания было одинаковым между каждой мышью.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги 3.5 и 3.7 могут привести к травме хирурга от укола иглой, если с ними не обращаться осторожно.
  8. Извлеките иглу 26 G и замените иглу 26 G, подключенную к шприцу с физиологическим раствором. Промойте полость до тех пор, пока обратный поток не станет прозрачным. Обычно для этого требуется 1,5-2 мл физиологического раствора. Извлеките шприц и иглу и безопасно утилизируйте их в острой емкости.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При нажатии на жидкость не должно быть сопротивления. Если это так, снова вставьте иглу, чтобы убедиться, что она находится в полости. Возможно, потребуется вытянуть иглу наполовину.
  9. Закройте рану на коже с помощью местного адгезивного шва.

4. Послеоперационный уход

  1. Сразу после операции введите оставшуюся половину дозы бупренорфина с пролонгированным высвобождением, используя дозировку, указанную на шаге 2.4.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Бупренорфин с пролонгированным высвобождением обеспечивает облегчение боли на срок до 72 часов.
  2. Следите за животными на грелке на предмет признаков нормального, беспрепятственного дыхания, пока они не проснутся после операции. После начала амбулаторного труда верните мышей в их клетку.
  3. Продолжайте наблюдать за мышами один раз в день в течение 3 дней после операции, чтобы убедиться, что они правильно заживают и обладают полной подвижностью, наблюдая за признаками боли.

5. Обработка костей для сканирования и анализа μКТ

  1. Усыпляйте мышей в соответствии с методом гуманной эвтаназии, регулируемым и одобренным IACUC или другой применимой институциональной политикой. В данном случае был использован первичный метод эвтаназии в виде ингаляцииСО2 , за которым последовал вторичный метод вывиха шейки матки.
  2. Соберите бедренные кости, сняв кожу вокруг задних конечностей и удалив всю конечность в тазобедренном суставе.
  3. Поместите каждую конечность между двумя губками в закладную кассету. Перенесите кости в кассетах в 10% раствор формалина и зафиксируйте их при температуре 4 °C на 5-7 дней, учитывая возраст и размер мыши.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Как чрезмерная, так и недостаточная фиксация приводят к плохому рассасыванию костного мозга.
  4. После фиксации промойте кассеты в фосфатно-солевом буфере (PBS) в течение 5 мин 3 раза.
  5. Извлеките конечности из кассет и при необходимости обрежьте мышцы с помощью скальпеля.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от последующих областей применения, грубое обращение может привести к разрушению надкостничного слоя кости.
  6. Отделите бедренную кость в колене, аккуратно разрезав связки с помощью небольших хирургических ножниц или скальпеля.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Голени можно использовать для других целей или выбросить из обращения.
  7. Переложите бедренные кости в конические пробирки объемом 1,7 мл или 15 мл в 70% раствор этанола. Кости могут оставаться в 70% этаноле при 4 °C до тех пор, пока не будут готовы к сканированию с помощью μКТ.
  8. Сканирование и оценка трабекулярных параметров бедренных костей, получение качественных и количественных данных.

6. Обработка костей для замороженных срезов и гистологии

ПРИМЕЧАНИЕ: Кости могут быть обработаны для замороженного среза и гистологии после прохождения μКТ-сканирования. Сканирование не влияет на флуоресцентное мечение или последующее окрашивание антителами.

  1. Переложите кости из 70% этанола в PBS и промойте 3 раза, по 5 минут на промывку.
  2. Инкубировать в ряде растворов сахарозы от 10%, 20%, до 30% в PBS при 4 °C в течение ночи при каждой концентрации. Храните кости в 30% сахарозе до 5 дней при 4 °C или в этом растворе при -20 °C в течение 6-12 месяцев до готовности к заделке.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Использование градиента сахарозы приводит к лучшему проникновению в ткани. После шага 6.1 кости можно поместить непосредственно в 30% раствор сахарозы на ночь.
  3. Встраивайте кости в смесь с оптимальной температурой резки (OCT) с помощью криовстраиваемых форм. Хранить при температуре -80 °C до готовности к разрезу.
  4. Разрезание закладных костей методом криопленочной ленты с температурой криостата от -24 °C до -26 °C.
  5. Приклейте секции на криопленке к адгезивному предметному стеклу с помощью оптического клея и отверждите его до затвердевания с помощью ультрафиолетового (УФ) сшивающего агента.

7. Обработка для проточной цитометрии

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол совместим с различными антителами. Для характеристики скелетных стволовых клеток и клеток-предшественников рекомендуется объединить 3-4 кости вместе, поскольку это редкие клеточные популяции в костном мозге.

  1. Приготовьте красительную среду (FSM) для сортировки клеток, активируемой флуоресценцией (FACS). Чтобы получить 1000 мл раствора ФСМ, смешайте: 100 мл сбалансированного раствора соли Ганкса (HBSS), 10 мл 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинетансульфоновой кислоты (HEPES), 20 мл фетальной бычьей сыворотки (FBS), 870 мл dd H2O. Пропустите раствор ФСМ через фильтр 0,2 мкм.
  2. Перед забором ткани заполните чашки Петри 4-5 мл стерильного PBS без кальция и магния.
  3. Подготовьте среду для сбраживания
    1. На каждые 4-6 бедренных костей готовят пищеварительную смесь в 10 мл PBS, содержащую 0,005 г коллагеназы Р и 0,02 г гиалуронидазы. Перемешайте с помощью осторожного вортекса и пропустите смесь через фильтр 0,22 мкм.
  4. Соберите кости на 3-й день после операции, как описано в шаге 5.2. Удалите все мышцы и соединительную ткань лезвием скальпеля.
  5. Наполните чашку Петри 5 мл питательной среды. Поместите 4-6 костей в среду для пищеварения. Каждую косточку мелко нарезать, сделав первый надрез продольно и сбоку.
  6. Переложите ткань в пробирку с круглым дном объемом 14 мл и запечатайте парапленкой. Накройте трубки алюминиевой фольгой.
  7. Встряхивайте при температуре 37 °C в течение 20 минут, держа трубку горизонтально на шейкере.
  8. Извлеките трубку из шейкера. Ячейки будут скапливаться внизу. Аккуратно соберите переваренный материал, не потревожив клетки на дне, и пропустите переваренный материал через фильтр 70 мкм. Соберите фильтрат в новую пробирку объемом 50 мл, содержащую 10 мл холодного ФШМ, и держите его на льду.
  9. К клеткам добавьте оставшиеся 5 мл пищеварительной смеси. Снова закройте парапленкой и накройте алюминиевой фольгой. Встряхните трубку, как описано выше. Повторите шаги 7.7-7.8.
  10. После 20-минутной инкубации при 37 °C переложите дигест в ту же пробирку, в которой находится дигест из стадии 7,8, пропустив через фильтр 70 мкм с еще 10 мл FSM.
  11. Центрифугируйте суспензию при температуре 274 x g при 4 °C. Отсадите надосадочную жидкость и соберите клеточную гранулу. Выбейте гранулу, осторожно постучав по трубке.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Центробежная сила (g) основана на радиусе ротора 170 мм. Пожалуйста, проверьте радиус ротора и отрегулируйте скорость соответственно.
  12. Для проведения лизиса эритроцитов добавьте 1 мл буфера для лизинга аммоний-хлорид-калий (ACK). Держите все реагенты и клетки на льду.
  13. Инкубируйте клетки в ACK в течение примерно 5 мин при РТ. Не превышайте 5 минут, чтобы избежать чрезмерного лизиса клеток.
  14. Добавьте 9 мл ФШМ. Центрифугируйте при 274 x g в течение 5 мин при 4 °C.
  15. Аспирируйте надосадочную жидкость. Разбейте клеточную гранулу, осторожно загребая пробирку на решетке для пробирок.
  16. Добавьте 10 мл ФШМ (объем для 4 костей, можно регулировать в зависимости от того, сколько костей объединено) и восстановите.
  17. Возьмите аликвоту каждого образца и добавьте йодид пропидия (PI) в соответствии с инструкциями производителя. Подсчитывайте живые и общие ячейки с помощью счетчика ячеек.
  18. Провести окрашивание образцов антителами с использованием желаемых маркеров для анализа проточной цитометрии 12,13,14.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Успех процедуры механической абляции костного мозга (КМ) был подтвержден рентгеновской визуализацией, в то время как игла 26G была введена в медуллярную полость (рис. 2A). Когда рентгеновская визуализация показала, что игла была введена под неправильным углом или проникла через кость, игла была повторно введена под правильным углом и повторно визуализирована для подтверждения точного размещения. Когда удачное положение не удавалось достичь, животное исключалось из анализа. В то время как рен...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Цель состояла в том, чтобы создать надежный и воспроизводимый метод изучения молекулярных и клеточных процессов, регулирующих восстановление кости, уделяя особое внимание прямому преобразованию скелетных стволовых и прогениторных клеток (SSPC) в костные отложенные остеобласты в пространстве/полости костного мозга. Описанный здесь метод механической абляции костного мозга представляет собой оптимизированный и валидированный протокол абляции костного мозга при механической травме, который ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не могут сообщить о каких-либо разглашениях.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Финансирование было предоставлено NIH/NIDCR R01-DE030716-01 и NIH/NIAMS R01-DE030716-01S1 для AS, NIH/NIAMS R01AR080131 для RG и грант UConn REP Convergence Grant для RG и AS.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
10% раствор формалина Sigma-AldrichHT501128
25 G 0.625 in Air-tite EZ Flo Игла для подкожных инъекцийAit Tite/ Fisher Scientific14-817-239; ссылка #NEZ25058
26 Г 1/2" Одноразовые иглы для подкожных инъекцийExel International/ Fisher Scientific14-840-83; ссылка #26402Любые иглы 26 Г могут быть заменены, должны быть отсоединены от шприца 
3 мл стерильного шприцаFisherbrand/ Fisher Scientific 14-955-457
AB Стерильная прокладкаMcKesson/ Fisher ScientificNC0593755В качестве альтернативы можно использовать автоклавируемые абсорбирующие прокладки 
Уксусная кислота, ледянаямиллипора SigmaAX0073Необходимо разбавить до 1%
лизирующего буфера хлорида аммония и калия (ACK)Gibco/ Thermo Fisher Scientific A1049201Используется для лизиса эритроцитов при подготовке к проточной цитометрии 
Индукционная камера для анестезии 2 лVetEquip941444
раствором бетадина (провидон-йода) Penn Veterinary Supply Inc/ Fisher ScientificNC0158124
бупренорфина гидрохлорида для инъекций 0,3 мг/мл;Дженерик / Covetrus59122Необходимо получить государственную и федеральную лицензию DEA для закупки контролируемого вещества
Кальцеин-AMSigma Aldrich206700-1MG
Collagenase P Roche11249002001используется для переваривания костей
Ватные палочки и аппликаторыFisherbrand/ Fisher Scientific 22-363-172
Криопленка тип II C(10), 3,5 смРазрез Лаборатория, ЯпонияCFS 105
DAPI Раствор для окрашивания Abcamab228549
Цифровые весы GramToprime/ AmazonB06X6LW4V9Можно использовать весы любой марки для взвешивания мышей
Рассекающие щипцы  Fisherbrand/ Fisher Scientific 08-953E; 08-953F
Ножницы для препарирования Fisherbrand/ Fisher Scientific 08-940
Выдержать низкопрофильные лезвия криостата/микротомаTanner ScientificTNR315LP
Ethiqa XR Бупренорфин с пролонгированным высвобождением 1,3 мг/млEthiqa XR/ Cevetrus72117Необходимо получить государственную и федеральную лицензию DEA для закупки контролируемого вещества
Fast Green, 0,2%Электронная мискроскопия Науки EMS50-319-57
Тепло сыворотки плода крупного рогатого скота инактивированныйGibco/ Thermo Fisher Scientific A5256801Используется для изготовления окрашивающих материалов FACS (FSM)
Решение для монтажа Fluoromount-G SouthernBiotech 0100-01
GLUSEAL Клей для наружного применения AD Хирургический GLU-550
Goat Anti-Rabbit Alexa 647Thermo FisherA21244Разбавление 1:300
Сбалансированный раствор соли Хэнкса (HBSS)Gibco/ Thermo Fisher Scientific14065056Используется для изготовления окрашивающих сред FACS (FSM)
Грелка (большая)Boncare/ AmazonB0CLHSWXSXМожно использовать грелку любой марки, снять тканевый чехол 
ГематоксилинMilliporeSigma/ Fisher ScientificM1051740500
гиалуронидазаMilliporeSigmaHX0514Используется для переваривания костей
Изофлуран Система анестезии животныхVetEquip901810
KUBTEC Параметр 2D Кабинет Рентгеновская системаOncoMed SolutionsN/AЛюбая рентгеновская кабинетная система визуализации может быть использована
Микроцентрифуга ТрубкиCorning/ Thomas Scientific 8600A52
Покровное стекло для микроскопа, 18 мм x 18 мм, # 1 ТолщинаГлобус Scientific1414-10
N-2-гидроксиэтилпиперазин-N-2-этан сульфоновая кислота HEPES (1M)  Gibco/ Thermo Fisher Scientific156300-80Используется для изготовления окрашивающих сред FACS (FSM)
Norland Optical Adhesive NO61Edmund Optical37-322Используется для приклеивания секций криопленки к предметному стеклу.
Моноклональное антитело к кролику Остерикс Abcamab2094841:500 разбавление
Peroxigard Готовое к использованию одноступенчатое дезинфицирующее средствоVirox Technologies29101Может быть заменено любым другим дезинфицирующим средством клинического/лабораторного класса
Йодид пропидия (PI)  Invitrogen/ Thermo Fisher Scientific P1304MPЯдерное флуоресцентное окрашивание, используемое для обнаружения мертвых клеток для подсчета жизнеспособности Аккумуляторный
электрический триммерWahl/ AmazonB001FWXKUEМожно использовать любые машинки для стрижки, триммер меньшего размера облегчит бритье мелких животных
Грызун Носовой конусVetEquip921609
Safranin O, 85% чистоты, сертифицированныйFisher ScientificAC419211000
Seal'N Freeze Cryotray Square MoldsЭлектронная мискроскопия Науки EMS62642-01Используется для встраивания, могут использоваться и другие формы для встраивания. Данная конкретная модель имеет более глубокую форму, а также крышку для запечатывания блока.
Нитрат серебраSigma AldrichS6506Нитрат серебра для окрашивания фон Косса
Стерильный фосфат Буферизованный физиологический раствор (PBS)Gibco/ Thermo Fisher Scientific10010023В качестве альтернативы, можно использовать свежеприготовленный PBS, который был отфильтрован и автоклавирован
Стерильные стандартные скальпелиIntegra Miltex/ Fisher Scientific12-460-455
Стерильные стандартные скальпелиIntegra Miltex/ Fisher Scientific12-460-455
Порошок сахарозы 1 кгThermo Fisher Scientific036508-A1
Superfrost Plus Мискроскоп СлайдыFisherbrand/ Fisher Scientific 1255015Адгезивные слайды
Sure-Tek Tissue Processing/ Встраиваемые кассетыFisherbrand Histosette/ Fisher Scientific22-048-141
Ткань плюс оптимальная температура резки O.C.T CompoundFisher Scientific23-730-571
Тканевые губкиEpredia/ Fisher Scientific84-53Тканевые губки защищают ткани от чрезмерного загрязнения 
Толуидин BlueFisher ScientificAC348600050

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bahney, C. S., et al. Cellular biology of fracture healing. J Orthop Res. 37 (1), 35-50 (2019).
  2. Ko, F. C., Sumner, D. R. How faithfully does intramembranous bone regeneration recapitulate embryonic skeletal development. Dev Dyn. 250 (3), 377-392 (2021).
  3. Patt, H. M., Maloney, M. A. Bone marrow regeneration after local injury: a review. Exp Hematol. 3 (2), 135-148 (1975).
  4. Chitnis, A., et al. Long bone fractures: treatment patterns and factors contributing to use of intramedullary nailing. Expert Rev Med Devices. 17 (7), 731-737 (2020).
  5. Singaram, S., Naidoo, M. The physical impact of long bone fractures on adults in KwaZulu-Natal. S Afr J Physiother. 76 (1), 1393(2020).
  6. Kim, T., et al. Orthopedic implants and devices for bone fractures and defects: past, present and perspective. Eng Regen. 1, 6-18 (2020).
  7. Marsell, R., Einhorn, T. A. The biology of fracture healing. Injury. 42 (6), 551-555 (2011).
  8. Katagiri, T., et al. morphogenetic protein-induced heterotopic bone formation: what have we learned from the history of a half century. Jpn Dent Sci Rev. 51 (2), 42-50 (2015).
  9. Wise, J. K., et al. Temporal gene expression profiling during rat femoral marrow ablation-induced intramembranous bone regeneration. PLoS One. 5 (10), e12987(2010).
  10. Chen, X. D., et al. Biglycan-deficient mice have delayed osteogenesis after marrow ablation. Calcified Tissue Int. 72 (5), 577-582 (2003).
  11. Moran, M. M., et al. Intramembranous bone regeneration differs among common inbred mouse strains following marrow ablation. J Orthop Res. 33 (9), 1374-1381 (2015).
  12. Jeffery, E. C., Mann, T. L. A., Pool, J. A., Zhao, Z., Morrison, S. J. Bone marrow and periosteal skeletal stem/progenitor cells contribute distinct to bone maintenance and repair. Cell Stem Cell. 29 (11), 1547-1561.e6 (2022).
  13. Loopmans, S., Stockmans, I., Carmeliet, G., Stegen, S. Isolation and in vitro characterization of murine young-adult long bone skeletal progenitors. Front Endocrinol. 13, 930358(2022).
  14. Chan, C. K. F., et al. Identification and specification of the mouse skeletal stem cell. Cell. 160 (1-2), 285-298 (2015).
  15. Moran, M. M., et al. Intramembranous bone regeneration in diversity outbred mice is heritable. Bone. 164, 116524(2022).
  16. Lybrand, K., Bragdon, B., Gerstenfeld, L. Mouse models of bone healing: fracture, marrow ablation, and distraction osteogenesis. Curr Protoc Mouse Biol. 5 (1), 35-49 (2015).
  17. Cooper, G. M., et al. Testing the critical size in calvarial bone defects: revisiting the concept of a critical-size defect. Plast Reconstr Surg. 125 (6), 1685-1692 (2010).
  18. Yu, Y., Bahney, C., Hu, D., Marcucio, R. S., Miclau, T. Creating rigidly stabilized fractures for assessing intramembranous ossification, distraction osteogenesis, or healing of critical sized defects. J Vis Exp. (62), e3552(2012).
  19. Wu, X., et al. Enhancing calvarial defects repair with PDGF-BB mimetic peptide hydrogels. J Control Release. 370, 277-286 (2024).
  20. Stanton, E., et al. A murine calvarial defect model for the investigation of the osteogenic potential of newborn umbilical cord mesenchymal stem cells in bone regeneration. Plast Reconstr Surg. 153 (3), 637-646 (2023).
  21. Manassero, M., et al. Establishment of a segmental femoral critical-size defect model in mice stabilized by plate osteosynthesis. J Vis Exp. (116), e52940(2016).
  22. Petersen, A., et al. A biomaterial with a channel-like pore architecture induces endochondral healing of bone defects. Nat Commun. 9 (1), 4430(2018).
  23. Xiao, X., et al. Spatial transcriptomic interrogation of the murine bone marrow signaling landscape. Bone Res. 11 (1), 59(2023).
  24. Yu, V. W. C., Scadden, D. T. Heterogeneity of the bone marrow niche. Curr Opin Hematol. 23 (4), 331-338 (2016).
  25. Matsushita, Y., Ono, W., Ono, N. Growth plate skeletal stem cells and their transition from cartilage to bone. Bone. 136, 115359(2020).
  26. Mizuhashi, K., et al. Resting zone of the growth plate houses a unique class of skeletal stem cells. Nature. 563 (7730), 254-258 (2018).
  27. Muruganandan, S., et al. A FoxA2+ long-term stem cell population is necessary for growth plate cartilage regeneration after injury. Nat Commun. 13 (1), 2515(2022).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Skeletal Stem CellsBone RegenerationMurine Bone ModelOsteoblast DifferentiationMicro Computed TomographyFrozen Section HistologyBone Repair Mechanisms

Похожие статьи