Оценка салидрозида в качестве терапевтического средства для кальциноза сосудов с использованием сетевой фармакологии и экспериментальных моделей на крысах

Краткое содержание

В этом исследовании установлена модель кальцификации сосудов на крысах, вызванной диетой с высоким содержанием жиров (HFD) в сочетании с витамином D3 (VD3). Модель была использована для оценки терапевтической эффективности салидрозида в профилактике и лечении кальцификации сосудов, что позволило получить представление о его потенциальных механизмах действия с помощью сетевой фармакологии и экспериментов in vivo .

Аннотация

Кальциноз сосудов (ВКК) является критическим патологическим состоянием, связанным со значительной заболеваемостью и смертностью. В этом исследовании используется гибридный подход сетевой фармакологии и молекулярной биологии для определения терапевтических механизмов салидрозида (SAL), активного соединения из Rhodiola crenulata, против VC. С помощью интеллектуального анализа баз данных и сетевого анализа было выявлено 388 целей SAL, пересекающихся с 2871 целью, связанной с венчурным капиталом, в результате чего было получено 208 общих целей. Сеть белок-белковых взаимодействий (PPI), построенная с помощью базы данных String и топологического анализа в Cytoscape 3.9.1, точно определила 10 ключевых мишеней, включая IL6, TNF, TP53, IL1B, HIF1A, CASP3 и STAT3, среди прочих. Идентифицированные гены были сконцентрированы в липидном и атеросклерозном путях, что указывает на то, что улучшение VC с помощью SAL может происходить за счет регуляции аномальной экспрессии липидных и воспалительных факторов. Также было обнаружено, что SAL ингибирует аномальную экспрессию воспалительных факторов, тем самым активируя путь JAK2/STAT3 для вмешательства в прогрессирование VC. Путь JAK2/STAT3 является ключевым молекулярным механизмом, с помощью которого SAL предотвращает дальнейшее ухудшение состояния VC. Анализ функционального обогащения выявил участие этих мишеней в воспалительных реакциях и липидном обмене, основных путях в ВК. Исследования in vivo на крысах продемонстрировали эффективность SAL в смягчении дислипидемии и воспаления сосудов, с улучшением липидного профиля сыворотки и снижением отложения кальция в сосудах. Механистическое исследование, основанное на вестерн-блоттинге, продемонстрировало способность салидрозида регулировать сигнальный путь JAK2/STAT3, подчеркивая его потенциал в качестве модулятора в этом критическом молекулярном механизме и предлагая потенциальную терапевтическую мишень для VC. Сила этого исследования заключается в его методологической строгости, объединяющей вычислительные прогнозы с проверками in vivo . Этот комплексный подход создает надежную основу для изучения терапевтических механизмов природных соединений в борьбе с ВК.

Введение

Кальцификация сосудов (ВК) относится к аномальному отложению кальция в стенках сосудов, что приводит к артериальной жесткости и снижению эластичности, что в конечном итоге ухудшает функцию сосудов. Традиционно ВК делят на два типа: интимальная кальцификация, связанная с накоплением липидов, и медиальная кальцинация. Первый тесно связан с воспалительной инфильтрацией, вызывающей остеогенную трансформацию сосудистой стенки, характеризующуюся миграцией, пролиферацией и дифференцировкой гладкомышечных клеток сосудов (VSMC) в остеобластоподобные клетки¹.

Способность VSMC подвергаться остеогенной дифференцировке, на которую влияют такие факторы, как старение, генетика и условия окружающей среды, такие как диабет и хроническая болезнь почек, является основным фактором возрастной VC. Это остеобластоподобное преобразование усугубляет кальцификацию и дегенерацию артерий¹.

ВК — это многогранное состояние, обусловленное дегенеративными изменениями, метаболическим дисбалансом и различными системными состояниями. Примерно в 80% случаев повреждения сосудов и в 90% случаев ишемической болезни сердца наблюдается ВК, что значительно увеличивает риск тяжелых сердечно-сосудистых событий ^1,2. Таким образом, существует острая необходимость в поиске фармакологических методов лечения, которые эффективно смягчают или обращают вспять это состояние.

В настоящее время стратегии лечения ВК включают в себя различные фармакологические вмешательства, хотя нет препаратов, специально разработанных для этой цели. Пациентам с легкой кальцинозией часто назначают статины для стабилизации бляшек. Однако, хотя они могут уменьшать стеноз коронарных артерий за счет снижения уровня липидов, их влияние на кальцификацию ограничено².

Учитывая сложность атеросклероза, у многих пациентов наблюдается повышенная активация тромбоцитов, что обуславливает необходимость использования антитромбоцитарных препаратов, таких как аспирин или клопидогрел, для ингибирования агрегации тромбоцитов и снижения риска тромбоза. Тем не менее, терапия аспирином полезна только для людей с высоким показателем кальция в коронарных артериях и низким риском кровотечения³.

Кроме того, исследования добавок, таких как витамин К, свидетельствуют о потенциале предотвращения прогрессирования ВК⁴. В тяжелых случаях могут быть рассмотрены инвазивные вмешательства, хотя они часто не подходят для широко распространенной ВК⁵. Для лиц без существующей ВК управление факторами риска, такими как артериальное давление, липидный профиль и образ жизни, остается критически важным⁶.

Родиола кренулата, многолетнее травянистое растение семейства толстянковых, традиционно используется в китайской медицине. Его основной биологически активный компонент, салидрозид, привлекает значительное внимание благодаря своей заметной биологической активности. Салидрозид известен своей способностью подавлять апоптоз, проявлять сильные антиоксидантные свойства и обладать противовоспалительными свойствами ^7,8. Эти свойства способствуют его способности улучшать сосудистую функцию, задерживать старение сосудов и защищать эндотелий сосудов. Как потенциальное терапевтическое средство для ВК, салидрозид имеет значительную ценность для исследований. Тем не менее, точные механизмы, с помощью которых салидрозид улучшает ВК, остаются полностью выясненными и требуют дальнейшего изучения для использования его терапевтического потенциала в лечении ВК.

Для изучения этих механизмов в данном исследовании используется сетевая фармакология — инновационная методология, объединяющая фармакологию, биоинформатику и информатику для анализа биологических систем и выяснения механизмов приема лекарственных препаратов. По сравнению с традиционными исследованиями лекарств с одной мишенью, сетевая фармакология предлагает более комплексный подход, анализируя влияние препарата на несколько биологических мишеней и сигнальных путей. Являясь ключевым инструментом в разработке современных лекарств, он конструирует сети лекарств, мишеней и путей для выявления основных механизмов действия лекарств ^9,10. Несмотря на его широкое использование в изучении терапевтических механизмов, были проведены ограниченные исследования механизмов взаимодействия между салидрозидом и VC с точки зрения биоинформатики и сетевой фармакологии.

В рамках этого исследования создается молекулярная сетевая карта потенциального влияния салидрозида на венчурный капитал путем выявления и анализа ключевых мишеней с помощью обширного анализа базы данных. Генерируется сеть белок-белковых взаимодействий (PPI) и применяется топологический анализ для выделения критических узлов в процессе кальцификации.

Для подтверждения расчетных прогнозов была разработана модель VC на крысах путем введения диеты с высоким содержанием жиров и витамином D3 (VD3). Данная модель воспроизводит патологические особенности ВК человека. Сосудистое повреждение оценивается с помощью гистологических методов, сывороточные липидные профили и маркеры воспаления оцениваются для изучения системных эффектов салидрозида, а экспрессия белков, связанных с SAL анти-VC, измеряется с помощью вестерн-блоттинга для изучения влияния салидрозида на экспериментально индуцированный VC, это исследование направлено на внесение ценного вклада в изучение потенциала этого соединения в качестве терапевтической стратегии борьбы с VC.

Протокол

Протокол одобрен Комитетом по экспериментальным животным Чанчуньского университета китайской медицины (одобрение No 2023091). Это исследование соответствует международным рекомендациям, включая Руководящие принципы Европейского сообщества и Директиву ЕЭС от 1986 года, обеспечивая этичное обращение с животными на протяжении всего исследования. Для исследования использовали самцов крыс линии Wistar (8-10 недель, масса 200-220 г). Подробная информация об используемых реагентах и оборудовании приведена в Таблице материалов.

1. Сетевое фармакологическое прогнозирование потенциальных мишеней салидрозид-VC

Сетевая фармакология использует вычислительные методы и крупномасштабный анализ данных для исследования сложных взаимодействий между молекулами лекарственных препаратов и биологическими мишенями, такими как пути, гены и белки в организме^11,12. Такой подход помогает расшифровать биологические функции и взаимосвязи изучаемых сущностей. Методология включает в себя использование базы данных, обработку химической информации, получение данных о биологической активности, извлечение данных о белках, анализ профилей экспрессии генов, построение сетей взаимодействия и анализ обогащения путей¹¹. На рисунке 1 показана сеть взаимодействия основных мишеней между салидрозидом и кальцинозом сосудов.

1. Построение целевой базы данных "Ингредиент"
   1. Используйте термин «Салидрозид» в качестве ключевого слова для ингредиентов для поиска в базах данных¹³ (см. Дополнительную таблицу 1), таких как HERB, TCMSP, PubChem, SwissTargetPrediction, CTD, PharmMapper, SEA и STITCH.
   2. Обзор соответствующей литературы для определения целей, связанных с салидрозидом, с видом Homo sapiens. После удаления дубликатов стандартизируйте целевые белки с помощью UniProt (см. дополнительную таблицу 1) и создайте всеобъемлющую базу данных мишеней Salidroside¹⁴.
2. Построение целевой базы данных "Болезнь"
   1. Используйте термин «кальцификация сосудов» в качестве ключевого слова для поиска в базах данных¹⁵ (см. дополнительную таблицу 1), включая GeneCards, OMIM, PharmGkb и DrugBank, с видом Homo sapiens. После дедупликации создайте целевую базу данных кальцификации сосудов.
3. Прогнозирование потенциальных терапевтических мишеней
   1. Введите мишени для салидрозида и кальцификации сосудов (см. дополнительную таблицу 1) для определения общих мишеней. Сгенерируйте диаграмму Венна для визуализации потенциальных терапевтических мишеней для салидрозида при лечении кальцификации сосудов.
4. Построение сети белок-белковых взаимодействий (ИПП) «Салидрозид-сосудистая кальцификация»
   1. Сгруппируйте потенциальные мишени в список нескольких белков и проанализируйте их с помощью STRING (см. дополнительную таблицу 1), при этом для организма установлено значение Homo sapiens, а для оценки взаимодействия — средняя достоверность (>0,4)¹⁶. Извлеките данные PPI в формате TSV для дальнейшего анализа.
      Учитывая, что 85% генов крыс гомологичны человеческим генам, выполняя сходные биологические функции, крысы были выбраны в качестве экспериментальных объектов для проверки влияния салидрозида на^{кальцификацию} сосудов.
5. Выбор и построение сети ключевых объектов
   1. Импортируйте данные сети PPI в Cytoscape 3.9.1 (см. дополнительную таблицу 1) для анализа с помощью плагина CytoNCA для оценки таких параметров, как международность (BC), близость (CC), степень (DC), собственный вектор (EC), локальная средняя связность (LAC) и центральность сети (NC). Выберите ключевые цели с CC=1 для построения карты спектра действия основной цели для 'SAL-VC'.
   2. Используйте плагин CytoHubba для определения 10 ведущих генов-хабов на основе расчетов максимальной центральности клики (MCC), максимального компонента соседства (MNC) и степени, создавая карту спектра генов-хабов.
6. Анализ пути обогащения GO и KEGG
   1. Выполните преобразование идентификаторов генов с помощью DAVID (см. дополнительную таблицу 1), выбрав ENSEMBL_GENE_ID для типа гена-9606 для получения информации о виде. Проанализируйте список преобразованных генов с помощью Omicshare (см. дополнительную таблицу 1) для обогащения функционала GO и пути KEGG, при этом значение P установлено на уровне P < 0,05¹⁸.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Функциональный анализ ГО включает в себя молекулярную функцию (MF), биологический процесс (BP) и клеточный компонент (CC). Анализ путей KEGG включает обогащение путей и обогащение классификацией путей¹⁹. Результаты анализа обогащения представлены на рисунке 2.

2. Эксперимент на животных

1. Акклиматизация
   1. Акклиматизируйте крыс Wistar в определенных условиях, свободных от патогенов (SPF) с 12-часовым циклом света/темноты. Убедитесь , что у них есть свободный доступ к пище и воде для поддержания их здоровья до начала экспериментов. Выполняйте адаптивное кормление в течение 1 недели.
2. Образцовое учреждение
   1. Акклиматизируйте крыс к условиям окружающей среды и случайным образом разделите их на пять групп: контрольная группа (Ctrl, ND + Vehicle), Модельная группа (Model, HFD + Vehicle), низкодозированная группа SAL (SAL-L, HFD + SAL 5 мг/кг), высокодозированная группа SAL (SAL-H, HFD + SAL 10 мг/кг) и группа симвастатина (SIM) (HFD + SIM 5 мг/кг).
   2. Вводите нормальную диету (ND) в группу Ctrl и диету с высоким содержанием жиров (HFD) в остальные группы в течение всего эксперимента. В первый день введения HFD вводите однократную подкожную дозу 600 000 МЕ/кг VD3 во все группы, кроме группы Ctrl^20,21. Затем следует еженедельная подкожная инъекция 100 000 МЕ/кг VD3 в течение следующих 8 недель (Рисунок 3).
   3. Ежедневно следите за состоянием здоровья и выживаемостью животных. Приступайте к экспериментальным вмешательствам на девятой неделе.
   4. Усыпляйте животных по завершении исследования (в соответствии с утвержденными в учреждении протоколами). Соберите образцы сыворотки, дайте им постоять в течение 30 мин и центрифугируйте для выделения сыворотки (в соответствии с ранее опубликованными отчетами^20,21). Рассеките сосудистые ткани (брюшную аорту) и промойте фосфатно-солевым раствором (PBS) для удаления крови.
   5. Зафиксируйте одну часть ткани в 4% параформальдегиде для гистологического исследования и храните другую часть в жидком азоте для молекулярного анализа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перед применением разведите салидрозид теплой водой.

3. Оценка повреждения сосудистой ткани с помощью окрашивания HE, VK, EVG

ПРИМЕЧАНИЕ: Зафиксируйте сосудистую ткань (брюшную аорту) в 4% параформальдегиде, обезвоженную в этаноле через 48 ч и погруженную в парафин. Разрежьте встроенные парафиновые блоки на срезы размером 5 мкм для окрашивания гематоксилином-эозином (HE), Elastica van Gieson (EVG) и Von Kossa (VK) и рассмотрите гистологическую морфологию под световым микроскопом. Окрашивание HE используется для оценки изменений морфологии тканей. В сосудистой ткани он выявляет структурные изменения в стенке сосуда, включая пролиферацию гладкомышечных клеток, дезорганизацию клеточного расположения и воспаление. Окрашивание EVG визуализирует эластичные и коллагеновые волокна, что важно для оценки повреждения эластичных волокон или ремоделирования в сосудистой ткани и помогает понять влияние кальцификации на эластичность сосудов. Окрашивание VK обнаруживает отложения кальция, что является ключевой особенностью VC, что делает его критически важным для оценки степени и распределения кальцификации в сосудистой ткани^22,23.

1. Окрашивание HE для выявления повреждений сосудистой ткани
   1. Депарафинизация и регидратация
      1. Депарафинизируйте срезы в двух вариантах ксилола в течение 8 мин каждая и регидратируйте через градуированный этанол (100%, 95%, 85%, 75%) в течение 3 мин за этап. Затем 2 минуты промойте в проточной воде из-под крана.
   2. Окрашивание гематоксилином
      1. Испачкайте срезы гематоксилином в течение 5-10 минут и промойте для удаления излишков пятна, после чего промойте проточной водой из-под крана.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется слегка окрашивать в течение 5 минут, чтобы избежать слишком темного окрашивания, которое может повлиять на цитоплазматический цвет.
   3. Дифференциация
      1. Дифференцируйте секции в растворе для дифференцировки в течение 30 секунд, затем дважды прополощите в водопроводной воде в течение 3 минут каждая.
   4. Противоокрашивание эозином
      1. Поместите срезы в морилку эозином на 1 минуту. После удаления излишков пятна проведите быстрое обезвоживание.
   5. Обезвоживание, осветление и монтаж
      1. Для быстрого обезвоживания окуните секции в 75%, 85%, 95% и 100% этанол на 3 с каждая, а затем 100% этанол на 1 минуту.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется быстрая дегидратация, так как эозин может потерять цвет в градиентах воды и этанола.
2. Окрашивание VK для обнаружения кальция
   1. Депарафинизация и регидратация
      1. Выполните этот шаг, следуя шагу 3.1.1.
   2. Реакция нитрата серебра
      1. Промокните участки насухо, обведите контуром тонкой кистью и покрасьте краской Von Kossa (см. Таблицу материалов). Выдержите их на ультрафиолетовом свете в течение 4 часов, после чего тщательно промойте проточной водой из-под крана.
   3. Противоокрашивание гематоксилином
      1. Окрашивайте срезы гематоксилином в течение 5 минут, промойте в проточной воде из-под крана, дифференцируйте и снова промойте, после чего промойте проточной водой из-под крана.
   4. Противоокрашивание эозином
      1. Обезвоживайте срезы с помощью отсортированного этанола (85% и 95% в течение 5 мин каждый), затем окрашивайте эозином в течение 5 мин.
   5. Обезвоживание и монтаж
      1. Обезвоживайте срезы в ваннах с этанолом (100% этанол I, II, III в течение 5 мин каждая) и осветляйте в ваннах с ксилолом (ксилол I и II в течение 5 мин). Затем смонтируйте секции нейтральным бальзамом.
   6. Микроскопическое исследование и получение изображений
      1. Рассмотрите окрашенные срезы под световым микроскопом и сделайте снимки для анализа.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что отложения кальция выглядят от коричнево-черного до темно-черного, ядра — синими, а фон — красным. Приготовьте раствор нитрата серебра для свежего окрашивания ВК непосредственно перед применением.
3. Окрашивание EVG для эластичных и коллагеновых волокон
   1. Депарафинизация и регидратация
      1. Обрабатывайте парафиновые срезы теплом в течение 50 минут, затем погружайте их в ксилол на 20 минут, чтобы удалить парафин. Затем подвергните срезы воздействию этанола (100%, 95%, 85%, 75%) на 5 минут каждая, а затем промойте в проточной воде из-под крана в течение 5 минут.
   2. Окрашивание EVG
      1. Нанесите раствор для окрашивания EVG (см. Таблицу материалов) на 10 минут, затем кратковременно промойте в проточной воде из-под крана в течение 5 секунд, чтобы удалить излишки пятна.
      2. Затем нанесите рабочий раствор Верхуффа (см. Таблицу материалов) в течение 5 минут, после чего последует еще одно кратковременное полоскание в проточной воде в течение 5 с. Нанесите дифференцирующий раствор Верхуффа в течение 5 с, пока волокна эластина не станут хорошо видны, а затем промойте проточной водой в течение 5 с.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Смешайте компоненты А, В и С (входят в коммерчески доступный набор) в соотношении 5:2:2 для приготовления рабочего раствора Верхуффа перед использованием. Используйте раствор в течение 2 часов и пополняйте его по мере необходимости в процессе окрашивания, чтобы предотвратить высыхание участков.
   3. Обезвоживание и монтаж
      1. Обезвоживайте срезы с помощью градуированного этанола (75%, 85%, 95% и 100%) в течение 5 с каждая, с последующим осветлением в двух сменах ксилола в течение 1 мин каждая. После короткого периода сушки на воздухе смонтируйте секции с нейтральным бальзамом.
   4. Микроскопическое исследование и анализ изображений
      1. Рассмотрите окрашенные срезы под световым микроскопом, чтобы визуализировать эластические и коллагеновые волокна, и сделать снимки для последующего анализа.

4. Анализ на щелочную фосфатазу (ЩФ)

ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте ЩФ в качестве ключевого показателя для оценки эффективности лечения против кальцинофикации.

1. Подготовка реагентов
   1. Растворите цветообразующий субстрат в ледяном карбонатном буфере 0,05 М pH 9,6 до конечного объема 2,5 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте буфер, растворив 1,59 г карбоната натрия и 2,93 г бикарбоната натрия в 1000 мл дважды дистиллированной воды.
2. Разбавление субстрата
   1. Разбавьте 10 мкл раствора-нитрофенола (10 мМ) с 0,05 М карбонатным буфером pH 9,6 до конечного объема 0,2 мл для достижения конечной концентрации 0,5 мМ.
3. Подготовка образцов
   1. Гомогенизировать брюшную аорту в буфере для лизиса. Центрифугируйте гомогенат (~12 000 x g в течение 10 мин при 4 °C) и соберите надосадочную жидкость для определения активности ЩФ.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что буфер для лизиса не содержит ингибиторов фосфатазы. Хранить в ожидании испытаний образцы при температуре -80 °C, избегая повторных циклов замораживания-оттаивания.
4. Подготовка микропланшетов к анализу
   1. Подготовьте 96-луночный планшет с пустыми, стандартными и пробными лунками. Добавьте 50 мкл стандартного раствора в стандартные лунки и 50 мкл ожидающих испытаний образцов в пробоотборные лунки. Инкубируйте пластину при температуре 37 °C в течение 10 минут.
5. Измерение окончания реакции и поглощения
   1. Добавьте по 100 мкл раствора остановки в каждую лунку, чтобы завершить реакцию. Измерьте абсорбцию на длине волны 405 нм и рассчитайте активность ALP на основе значений абсорбции (следуя инструкциям производителя, см. Таблицу материалов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Лунки, содержащие стандарт или образцы с активностью ALP, будут иметь различные оттенки желтого. Цвет остается стабильным до 2 часов.

5. Определение содержания кальция

ПРИМЕЧАНИЕ: Определение содержания кальция имеет решающее значение для оценки степени минерализации в биологических тканях.

1. Подготовка тканей
   1. Измельчите ткань на мелкие кусочки и гомогенизируйте в буфере для лизиса.
2. Разбавление проб и центрифугирование
   1. Разведите ткань в буфере для лизиса в соотношении 1:10. Гомогенизируйте смесь и центрифугируйте при 4 °C, 12 000 x g в течение 5 минут. Соберите надосадочную жидкость для анализа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте стандартные разведения кальция (0-1,0 мМ) с использованием стандартного раствора кальция 5 мМ (см. Таблицу материалов).
3. Установка планшетов и инкубация
   1. Добавьте 50 мкл стандартных или тестовых образцов в каждую лунку 96-луночного планшета. Добавьте 150 μл пробирного рабочего раствора, тщательно перемешайте и выдержите планшет в темноте при комнатной температуре в течение 10 минут. Измерьте поглощение на длине волны 575 нм и постройте стандартную кривую.
4. Расчет содержания кальция
   1. Рассчитайте содержание кальция с помощью стандартной кривой, включающей коэффициент разбавления, объем образца и атомную массу кальция.

6. Иммуноферментный анализ (ИФА) на воспалительные цитокины (ИЛ-6, ФНО-α, ИЛ-1β)

ПРИМЕЧАНИЕ: IL-6, IL-1β и TNF-α являются ключевыми провоспалительными цитокинами, которые указывают на наличие и тяжесть воспалительной реакции. Измерение этих цитокинов имеет важное значение для понимания воспалительного процесса и оценки эффективности противовоспалительного лечения.

1. Забор образцов
   1. Соберите сыворотку из брюшной аорты крысы. Дайте ему свернуться при комнатной температуре в течение 2 часов. Центрифугируйте образец при 3 000 x g в течение 10 минут при 4 °C и соберите надосадочную жидкость.
2. Подготовка микропланшетов к анализу
   1. Подготовьте планшет на 96 лунок с лунками, предназначенными для стандартов и тестовых образцов. Добавьте в соответствующие лунки 50 мкл стандартов (см. Таблицу материалов) в различных концентрациях.
3. Подготовка образцов
   1. Добавьте 40 мкл разбавителя образца в каждую лунку, предназначенную для испытуемых образцов. Добавьте 10 мкл образца в те же лунки, в результате чего получится 5-кратное разбавление.
4. Инкубация с мечеными ферментами реагентами
   1. Добавьте 100 мкл меченых ферментами реагентов, специфичных для IL-6, TNF-α или IL-1β, во все лунки, кроме холостой. Инкубируйте тарелку при температуре 37 °C в течение 60 минут.
5. Стирка
   1. Слейте жидкость из всех лунок, кроме болванки. Промойте лунки 1х промывным раствором (приготовленным в 20-кратном разведении в дистиллированной воде). Повторите этот этап промывки пять раз и просушите лунки.
6. Проявление и окончание цвета
   1. Добавьте по 50 мкл субстратов А и В (из коммерчески доступного набора, см. Таблицу материалов) в каждую лунку. Аккуратно перемешайте и выдержите тарелку при температуре 37 °C в темноте в течение 15 минут. Добавьте 50 μL раствора остановки в каждую лунку, чтобы завершить реакцию.
7. Измерение поглощения и анализ данных
   1. Установите колодец в ноль. Измерьте поглощение на длине волны 450 нм с помощью считывателя микропланшетов. Построение стандартной кривой на основе значений наружного диаметра и стандартных концентраций. Рассчитайте концентрации проб с помощью интерполяции и настройте коэффициент разбавления.

7. Анализ липидного профиля

ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ липидного профиля выявляет аномальные уровни липидов, при этом повышенный или несбалансированный уровень липидов может ускорить риск кальцификации сосудов.

1. Общий холестерин и триглицериды (ТК и ТГ)
   1. Соберите сыворотку крови и подготовьте 96-луночный планшет с выделенными лунками для заготовки, калибровки и ожидания тестовых образцов. Добавьте в каждую лунку по 2,5 мкл сыворотки, калибровочного стандарта или пустого раствора.
   2. Добавьте в каждую лунку по 250 мкл рабочего раствора. Аккуратно перемешайте и выдержите в тарелке при температуре 37 °C в течение 10 минут. Измерьте поглощение на длине волны 500 нм с помощью считывателя микропланшетов.
2. Липопротеины низкой плотности и липопротеины высокой плотности (ЛПНП и ЛПВП)
   1. Соберите сыворотку крови и подготовьте 96-луночный планшет с лунками, предназначенными для заготовки, калибровки и ожидания тестовых образцов. Добавьте в соответствующие лунки 2,5 мкл сыворотки, калибровочного стандарта или пустого раствора.
   2. Добавьте соответствующий реагент (Реагент Один на 180 мкл или Реагент Два на 60 мкл, см. Таблицу материалов) в каждую лунку, как указано в инструкции к набору для анализа. Инкубировать при температуре (37 °C) и в течение времени (Реагент 1 в течение 5 мин или Реагент 2 в течение 10 мин) рекомендуется для каждого реагента.
   3. Измерьте поглощение на определенной длине волны (600 нм), указанной для ХС ЛПНП или ХС ЛПВП, с помощью считывателя микропланшетов.

8. Вестерн-блоттинг

Вестерн-блоттинг (WB) играет важную роль в оценке уровней экспрессии ключевых белков, позволяя обнаруживать как обычные, так и фосфорилированные формы.

1. Подготовка тканей
   1. Взвесьте 0,05 г ткани и тщательно промойте PBS, чтобы удалить излишки мусора. Добавьте 500 мкл лизисного буфера, содержащего 1x фосфатазу и ингибиторы протеазы. Инкубируйте ткань при температуре 4 °C в течение 10 минут и гомогенизируйте ее с помощью измельчителя тканей.
2. Экстракция белка
   1. Дайте гомогенизированному образцу постоять в течение 1 минуты, затем центрифугируйте при 4 °C и 12 000 x g в течение 15 минут. Соберите надосадочную жидкость для анализа белка. Определяйте концентрацию белка методом ВСА, следуя инструкциям производителя (см. Таблицу материалов). Используйте стандартную кривую для расчета концентрации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перед использованием предварительно охладите центрифугу до 4 °C. Измерьте концентрацию белка на длине волны 562 нм.
3. Подготовка образцов
   1. Смешайте образец белка с 5-кратным загрузочным буфером, содержащим β-меркаптоэтанол и SDS в соотношении 4:1. Нагрейте смесь до 100 °C в течение 5 минут, чтобы денатурировать белки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если требуется 1x загрузочный буфер, разбавьте 5x буфер с помощью лизисного буфера.
4. Подготовка геля SDS-PAGE
   1. Приготовьте 12% гель SDS-PAGE и поместите его в аппарат для электрофореза. Добавьте 1x буфер для электрофореза до середины в соответствии с инструкциями (см. дополнительную таблицу 2).
5. Электрофорез
   1. Извлеките образцы белка при температуре -20 °C. Загрузите 60 мкг белка в лунку и запустите гель.
   2. Установите ток на 50 мА на 20 мин для стекирующего геля, затем увеличьте до 100 мА на 60 мин для разделительного геля, пока фронт красителя не достигнет дна.
6. Мембранный перенос
   1. Активируйте мембрану PVDF в метаноле на 5 минут.
   2. Соберите сэндвич для переноса в следующем порядке: фильтровальная бумага → гель SDS-PAGE → мембрана PVDF → фильтровальная бумага. Переносите белки при 300 мА в течение 60 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что между гелем SDS-PAGE и мембраной из ПВДФ не застревают пузырьки воздуха.
7. Блокировка
   1. Инкубировать мембрану PVDF в 5% BSA (приготовленной в 1x TBST) при комнатной температуре с легким встряхиванием в течение 60 минут. Промойте мембрану 1x TBST три раза по 5 минут каждый.
8. Первичная инкубация антител
   1. Инкубируют мембрану в 5 мл соответствующего первичного антитела (например, p-JAK2, JAK2, p-STAT3, STAT3, p-NF-κB p65, NF-κB p65, IκBα), разведенного в блокирующем буфере при комнатной температуре в течение 2,5 ч.
9. Вторичная инкубация антител
   1. Промойте мембрану 1x TBST три раза по 5 минут каждый раз после первичной инкубации антител. Инкубировать с соответствующими вторичными антителами при комнатной температуре в течение 1 ч. Снова промойте мембрану 1x TBST три раза по 5 минут каждый.
10. Обнаружение
    1. Визуализируйте белковые полосы с помощью ECL-хемилюминесцентного детектирования²⁴ (см. Таблицу материалов).
11. Денситометрический анализ
    1. Количественное определение белковых полос с помощью программного обеспечения ImageJ. Следуйте этому рабочему процессу в ImageJ: Изображение → 8-битный процесс → → вычитание фона. Анализируйте → задайте измерения → анализируйте → установите масштаб. Редактирование → инвертирование → анализ → измерение → результатов. Файл → сохранить как → IntDen.
    2. Создавайте статистические графики с помощью программного обеспечения для построения графиков и статистического анализа.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что результаты согласованы между репликами, чтобы проверить результаты.

9. Статистический анализ

1. Собирайте и систематизируйте данные с помощью GraphPad Prism 9.0.
2. Расчет и построение графиков погрешностей с использованием среднего значения ± SD на основе необработанных данных.
3. Выполнение статистического анализа с помощью одностороннего анализа ANOVA, за которым следует апостериорный тест Тьюки для множественных сравнений.
4. Определите статистическую значимость при P < 0,05, при этом меньшие P-значения указывают на большие различия в результатах.

Результаты

Сетевой фармакологический анализ

С помощью таких баз данных, как HERB, TCMSP, Pubmed, SwissTargetPrediction, CTD, PharmMapper, SEA и STITCH, было идентифицировано 388 потенциальных генов-мишеней для салидрозида. Кроме того, 2871 потенциальный ген-мишень, связанный с VC, был получен из баз данных, таких как GeneCards, OMIM, PharmGkb и DrugBank. Анализ пересечений с помощью диаграмм VENN выявил 208 перекрывающихся мишеней, которые считаются ключевыми целями для вмешател...

Обсуждение

ВК характеризуется дегенеративными изменениями в сосудистых клетках и тканях с патологическими отложениями минералов в кровеносных сосудах, приводящими к уплотнению стенок сосудов или образованию атеросклеротических бляшек, что может привести к обструктивным заболеваниям сосудов²⁵. Исследования показывают, что около 85% бляшек VC могут развиться в тромбоз, который может спровоцировать острые сердечно-сосудистые эпизоды. Кроме того, ВК является важнейшим индикаторо...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
30% (29:1) Раствор акриламида/биса Beijing	Solarbio Science & Technology Co., Ltd, Китай	A1010
4% раствор для фиксации параформальдегида	Beyotime Biotech Inc (Beyotime) , Китай	P0099
5* загрузочный буфер	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd, Китай	P1040
Набор для анализа щелочной фосфатазы	Beyotime Biotech Inc (Beyotime) , Китай	P0321S
AlphaView Software Proteinsimple	Inc. США	AlphaView SA
Набор для анализа белка BCA	Beyotime Biotech Inc (Beyotime) , Китай	P0012
Решение для воронения Beijing	Solarbio Science & Technology Co., Ltd, Китай	G1866
Набор для колориметрического анализа кальция	Beyotime Biotech Inc (Beyotime) , Китай	S1063S
Набор для окрашивания коллагеновых волокон и эластичных волокон (метод EVG-Verh eff)	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd, Китай	G1597
Обезвоживающая машина	Diapath Biosciences  Ltd, Италия	Встраиваемая машина Donatello
	Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd, Китай	JB-P5
Инструмент с ферментной маркировкой	Biotek Co., Ltd,США	Epoch
Ethanol absolute	GHTECH  Co., Ltd, Китай	64-17-5
Goat Anti-Mouse IgG (H+L) HRP	Bioworld technology, co, Ltd.,Китай	BS20242-Y
GraphPad Prism Software	GraphPad Software.,США	GraphPad Prism 9.0
Набор для окрашивания гематоксилин-эозином Beijing	Solarbio Science & Technology Co., Ltd, Китай	G1120
Набор для анализа холестерина липопротеинов высокой плотности	Nanjing Jiancheng Bioengineering Research Institute Co., Ltd, Китай	A112
меченый HRP козий антикролик IgG (H+L)	Guangzhou saiguo biotech Co., LTD	A0208
Image J Software	Национальные институты здравоохранения (NIH), США	Image J
Iκ B Альфа Поликлональные антитела	Proteintech Group, Inc.A, США	10268-1-AP
JAK2 Антитело	Affinity Biosciences Co., Ltd, Китай	AF6022
Набор для анализа холестерина липопротеинов низкой плотности	Nanjing Jiancheng Bioengineering Research Institute Co., Ltd, Китай	A113
NF-κ B p65 Antibody	Proteintech Group, Inc.A,США	10745-1-AP
Патологический микротом	Leica Biosystems,США	RM2016
Коктейльные столы ингибиторов фосфатазы	F. Hoffmann-La Roche, Ltd, Швейцария	04906845001
Phospho-JAK2 (Tyr931) Антитело	Affinity Biosciences Co., Ltd, Китай	AF3024
Phospho-NF-κ B p65(Ser276) Антитело	Affinity Biosciences Co., Ltd, Китай	AF2006
Phospho-STAT3(S727)	Антитело Abways  Наука и Technology Co., Ltd, Китай	CY5291
Коктейль ингибиторов протеазы	F. Hoffmann-La Roche, Ltd, Швейцария	11873580001
мембраной из PVDF	F. Hoffmann-La Roche, Ltd, Швейцария	3010040001
Rat IL-1β Комплект ИФА	Beyotime Biotech Inc (Beyotime) , Китай	PI303
Крыса IL-6 Набор ИФА	Beyotime Biotech Inc (Beyotime) , Китай	PI328
Крыса TNF-α ELISA Kit	Beyotime Biotech Inc (Beyotime) , Китай	PT516
RIPA Lysis Buffer	Beyotime Biotech Inc (Beyotime) , Китай	P0013B
Salisoroside	Shanghai yuanye Bio-Technology Co., Ltd,China	S25475
SDS	Guangzhou saiguo biotech Co.,LTD,Китай	3250KG001
Карбонат натрия	China National Pharmaceutical Group Co., Ltd., Китай	1001921933
Гидрокарбонат натрия	China National Pharmaceutical Group Co., Ltd. , Китай	10018960
Тиосульфат натрия	China National Pharmaceutical Group Co., Ltd. , Китай	20042518
STAT3 Antibody	Proteintech Group, Inc.A,США	10253-2-AP
TBST (10&раз;)	Beyotime Biotech Inc (Beyotime) , Китай	ST673
Набор для анализа общего холестерина	Nanjing Jiancheng Bioengineering Research Institute Co., Ltd, Китай	A111
Набор для анализа триглицеридов	Nanjing Jiancheng Bioengineering Research Institute Co., Ltd, China	A110
Tris Base	Guangzhou saiguo biotech Co., LTD	1115GR500
Вертикальный оптический микроскоп	Nikon Corporation,Япония	Eclipse E100
Von Kossa Solution	Wuhan servicebio technology CO.,LTD,Китай	G1043
Western Blotting Luminol Reagent	Santa Cruz Biotechnology, Inc.,США	SC-2048
&бета;-Антитела к актину	Cell Signaling Technology, Inc., США	E4967