Оптимизированный метод культивирования и микробной биоаугментации Typha latifolia (рогоз)

Summary

Typha latifolia, которая в основном размножается бесполым путем через корневища, создает проблемы для сбора из-за своей обширной корневой системы. В данной статье представлен метод выращивания T. latifolia из семян, облегчающий выращивание в лаборатории и обеспечивающий потенциал для стерильного роста растений и ранней микробной биоаугментации.

Abstract

Typha latifolia, более известный как широколистный рогоз или камыш обыкновенный, имеет глобальный ареал обитания и доминирует в экосистемах водно-болотных угодий в Северной Америке. В то время как различные виды рогоза часто считаются инвазивными в Северной Америке, T. latifolia считается местным видом региона и встречается по всему континенту как доминирующий вид Typha . Исторически сложилось так, что Typha выполняла различные функции, начиная от источников пищи и заканчивая строительными материалами. В последнее время T. latifolia стала заметным видом, способствующим усилиям по биоочистке. В связи с растущим интересом к разработке сконструированных систем очистки водно-болотных угодий (CWTS) для очистки от загрязняющих веществ, необходимы воспроизводимые методы выращивания рогоза в лабораторных условиях. В представленной здесь работе были рассмотрены и проверены различные параметры роста для успешного выращивания T. latifolia из семян. Успешное проращивание видов Typha предполагает скарификацию (разрыв семенной оболочки), которая была достигнута с помощью механических приемов для крупномасштабного производства. Было показано, что раннее закоренение семян способствует низким условиям роста питательных веществ в течение первой недели, за которым следует внесение удобрений в последующие недели для повышения выживаемости после пересадки. Что касается микробной биоаугментации растительной системы, результаты показали, что замачивание семян в инокулюме приводит к более обширной колонизации корневой ткани и долговременной бактериальной персистенции. Оптимизированная методика стерилизации семян с использованием комбинации отбеливателя и моющего средства была использована для улучшения успеха колонизации микроорганизмов. Сосуды для роста, как стерильные, так и нестерильные, разработанные в этом исследовании, поддерживают долгосрочный рост T. latifolia в различных условиях.

Introduction

Как экономичная и энергоэффективная технология, построенные системы очистки водно-болотных угодий (CWTS) завоевали значительную популярность для восстановления загрязнителей окружающей среды ^1,2,3. CWTS использует физические, химические и биологические процессы для удаления, преобразования или стабилизации загрязняющих веществ. В то время как физические и химические процессы, связанные с химическим оборотом, были хорошо охарактеризованы с момента создания CWTS, воздействие растительности оставалось в значительной степени^{загадочным2}. В последние годы все больше внимания уделяется пониманию механизмов, с помощью которых растения преобразуют органические и неорганические загрязнители, представляющие потенциальную опасность в сточных водах ^2,4,5. Тем не менее, механистические исследования, подобные этим, основаны на способности культивировать большое количество макрофитов и способствовать росту из семян, чтобы гарантировать, что каждое растение находится на одной и той же стадии роста и развития.

CWT в Северной Америке часто создаются с использованием растительности, характерной для естественных водно-болотных угодий региона, такой как виды Typha, Scirpus, Juncus и Phragmites ^6,7. Выбор растительности также зависит от используемого водно-болотного угодья, которое может варьироваться по глубине, потоку воды, источникам субстрата и источникам воды (с рециркуляцией или без нее)². Наконец, климат также влияет на растительность водно-болотных угодий, причем более прохладный климат благоприятствует погруженным растениям из-за их повышенной приспособляемости⁸. Виды Typha представляют особый интерес на глубоководных водно-болотных угодьях, построенных поверхностным стоком, благодаря их способности быстро колонизировать окружающую среду и адаптироваться к различным условиям окружающей среды ^9,10.

Недавний обзор результатов показал, что из 87 тестов на фитотоксичность с использованием видов Typha только в 15 исследованиях испытуемые растения начинались с семян, и из них только в одном исследовании изучался рост зрелых растений¹¹. Такое недопредставление экспериментов с рогозом из семян указывает на пробел в литературе, касающийся протоколов, направленных на описание выращивания рогоза для лабораторных исследований. Изложенные здесь протоколы направлены на восполнение этого пробела путем представления углубленного протокола роста Typha latifolia от семени до зрелого растения в стерильных и нестерильных условиях. Кроме того, в данной статье обсуждается метод бактериальной биоаугментации видов рогоза на стадии посева, где ранняя инокуляция может помочь сохранить долгосрочную стойкость интродуцированных ризо- и эндофитных микробов.

Protocol

1. Скарификация семян

1. Семена рогоза были получены из водно-болотных угодий в Калгари, Австралия, Канада, осенью 2023 года (51,11312° с.ш., 114.39381° з.д.). Соцветия рогоза соберите осенью и храните в бумажном пакете в темноте до использования. Если еще на черенке, соберите соцветие весной, но извлечение семян будет снижено.
2. С помощью садовых ножниц срежьте стебель растения на ~2 см от основания соцветия. Снимите семена с соцветия и поместите в лабораторный блендер до тех пор, пока объем блендера не заполнится примерно на четверть. Это примерно 250 мл семян без уплотнения.
3. Наполните блендер 500 мл водопроводной воды. Поддерживайте свободное пространство в блендере 10 см. Взбивайте на средне-низкой скорости в течение 20 секунд и сразу переложите в большой стакан объемом 1 л. Полученный раствор должен быть вязким.
4. Перелейте примерно 100 мл этого осадка из семян обратно в блендер и заполните блендер 400-600 мл свежей водопроводной воды. Взбивайте на средне-высокой скорости в течение 20 секунд и сразу переложите в свежую 1-литровую мензурку.
5. Наполните стакан водой из-под крана до 800 мл и оставьте на время не менее 60 с. Скарифицированные и жизнеспособные семена рогоза опустятся на дно стакана, а перо и клюв (см. Рисунок 1 для описания структуры семян рогоза) всплывут наверх. Зачерпните ил в верхней части стакана и медленно вылейте воду из стакана, не потревожив семена на дне. Переложите семена в стакан объемом 100 мл.
6. Повторите процесс смешивания на оставшейся части осадка рогоза из шага 1.5.
7. Поместите стакан с семенами на тарелку для перемешивания и вращайте на средней скорости в течение 1 часа. Через 1 час счерпните весь растительный материал, плавающий в верхней части стакана.
8. Высыпьте семена в воронку Бюхнера с прикрепленной к вакууму фильтровальной бумагой, чтобы высушить семена на ночь. Сухие семена можно хранить при температуре -20 °C в конических полипропиленовых пробирках объемом 15 мл.

2. Проращивание по нестерильной методике

1. Приготовьте половинчатые сердечные тарелки Мурасигэ и Скуга (МС) с 1% фитоагаром¹².
2. Поместите примерно 1 мл сухих семян в коническую полипропиленовую трубку объемом 15 мл и залейте 10 мл водопроводной воды. Вращайте орбитальный вибростенд на низкой скорости в течение 24 часов, чтобы вызвать прорастание.
3. Удалите лишнюю воду так, чтобы в конической полипропиленовой трубке объемом 15 мл оставалось 3 мл.
4. Отрежьте кончик пластикового наконечника пипетки объемом 1000 мкл, чтобы увеличить размер отверстия, и энергично пипетируйте раствор семян, чтобы суспензировать семена внутри наконечника пипетки.
5. Поместите семена и воду на половинчатые пластины агара MS. Перекрутите тарелку, чтобы равномерно распределить семена.
6. Оберните планшеты лабораторной герметизирующей пленкой и поместите их в ростовую камеру с циклом «свет-темнота» 16 ч/8 ч при температуре 23 °C и влажности 70%. Инкубируйте пластины в течение 1 недели (до 2 недель), чтобы вызвать прорастание семян.

3. Проращивание по стерильной методике

ПРИМЕЧАНИЕ: Были протестированы и сравнены различные протоколы стерилизации семян. Метод, обеспечивающий наивысшую всхожесть при производстве полностью стерилизованных семян, был модифицирован по сравнению с предыдущим протоколом¹³ и описан здесь.

1. Приготовьте полупрочные МС медиа пластины с 1% фитоагаром¹².
2. Поместите объем примерно 1 мл семян в коническую полипропиленовую пробирку объемом 15 мл и заполните 10 мл стерильного ddH₂O. Поместите на орбитальный шейкер на средне-высокой скорости на 10 минут.
3. Удалите воду и добавьте 5 мл 0,1% раствора полисорбата 20 (приготовленного в стерильном ддН₂О) в коническую полипропиленовую пробирку объемом 15 мл. Поместите на орбитальный шейкер на средне-высокой скорости на 10 минут.
4. Удалите раствор и добавьте 5 мл 30% коммерческого отбеливателя и 0,025% раствора полисорбата 20 (приготовленного в стерильном ddH₂O) в коническую полипропиленовую пробирку объемом 15 мл. Встряхивайте на средне-высокой скорости в течение 30 минут.
5. Удалите раствор и замените его стерильным ddH₂O. Встряхивайте на средне-высокой скорости в течение 5 минут. Повторите в общей сложности 3 полоскания водой.
6. Заполните коническую полипропиленовую трубку объемом 15 мл стерильным ddH₂O и вращайте с низкой скоростью в течение 24 часов, чтобы вызвать прорастание. Через 24 ч удалите лишнюю воду так, чтобы в пластиковой трубке осталось 3 мл.
7. Асептически разрежьте кончик пластикового наконечника для пипетки объемом 1000 мкл и энергично втяните пипетку, чтобы суспензировать семена внутри кончика.
8. Пластинчатые семена и жидкость на пластинах агара МС половинной прочности. Переверните тарелку, чтобы равномерно распределить семена.
9. Оберните планшеты в лабораторную герметизирующую пленку и поместите в камеру выращивания с циклом «свет-темнота» 16 ч/8 ч при температуре 23 °C и влажности 70%. Оставьте пластины на 1 неделю (до 2 недель), чтобы дать возможность прорасти.

4. Инокуляция семян отобранными бактериями

1. Чтобы инокулировать семена рогоза, сначала следуйте приведенному выше протоколу проращивания стерильных семян до шага 3.6, чтобы получить стерильные семена. Удалите последнюю воду для промывки из конической полипропиленовой трубки объемом 15 мл, как описано в шаге 3.6 выше.
2. Используя выращенные за ночь микробные культуры, инокулированные из одного изолята или сообщества, измерьте OD600 и нормализуйте до значения поглощения 1,0 путем разбавления в питательной среде. Инкубируйте культуры в течение более длительного периода времени, если не достигнут OD600 1,0.
   Примечание: Здесь были созданы культуры из Luteimonas sp ., выделенного из корней растений в северной Альберте и конъюгированных для экспрессии флуоресцентного белка DsRed для микроскопической визуализации.
3. Вращайте 1 мл культуры при 9300 x g в течение 2 минут. Удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 1 мл 1 фосфатного буферного раствора. Вращайте при 9300 x g в течение 2 минут.
4. Удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте бактериальную гранулу в 1 мл стерильного ddH2O.
5. В конической полипропиленовой пробирке объемом 15 мл встряхнуть примерно 1 мл семян на низкой скорости в течение 24 ч в 10 мл в соотношении 1:10 с 0,025% силиконорганическим поверхностно-активным веществом.
6. Следуйте оставшейся части протокола проращивания стерильных семян, начиная с шага 3.8.

5. Нестерильный рост рогоза на почве

1. Наполните горшки почвой с низким содержанием органических веществ по вашему выбору, оставив 1 см пространства от верхней части горшка. Предварительно увлажните почву водопроводной водой и проделайте в почве отверстия на 1 см.
2. С помощью пинцета аккуратно извлеките проросшую за 1 неделю рассаду из пластин агара MS, выращенных в соответствии с описанным в пункте 3 выше, стараясь не повредить корни. Аккуратно поместите саженец в каждую лунку в почве и засыпьте ее почвой.
3. Поместите горшки в поддон и наполните их водопроводной водой до уровня почвы. На каждые 10 горшков добавьте 100 мл 0,5% удобрения 20/20/20 NPK.
4. В каждый набор из десяти горшков добавьте удобрения следующим образом: неделя 2 - 100 мл 0,5% удобрения, неделя 3 - 100 мл 1,0% удобрения, неделя 4 - 100 мл 1,0% удобрения.
5. Через 4 недели прекратите еженедельное внесение удобрений и удобряйте только один раз в месяц 100 мл 1,0% раствора удобрения. Через 4 недели пересадите в горшки большего размера, если это необходимо. В этот момент растения менее чувствительны к типу почвы, поэтому используйте любую смесь.
6. Продолжайте пересаживать рогоз по мере того, как они перерастают свою емкость. Удалите отмершую листву с помощью секатора. Удобряйте рогоз раз в месяц.
7. Для экспериментов пересадите рассаду в небольшой горшок, который, будучи помещен на дно пустой коробки для наконечника для пипетки, закреплен по бокам коробки. Это позволяет правильно затоплять почву, тем самым имитируя условия водно-болотных угодий. При проведении экспериментов на более старых рогозах модифицируют аналогичным образом, так что горшок можно почти полностью погрузить в воду.

6. Стерильный рост рассады

1. Конструкция камеры выращивания рассады
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для сборки каждой камеры выращивания рассады требуются два ящика для посевов, один шприц с наконечником с люэровским замком, одноразовый стерильный фильтр 0,2 мкм и термостойкий силикон. На рисунке 2 показано визуальное представление конфигурации камеры.
   1. Снимите крышки с ящиков для культуры и с помощью ручной дрели сделайте отверстия диаметром 3,5 см в центре крышек. Используйте термостойкий силикон, чтобы склеить верхушки двух крышек.
   2. Просверлите отверстие размером с кончик шприца (~1 см в диаметре) в нижнем углу одного из ящиков для культуры. Отрежьте кончик от шприца и выбросьте корпус шприца.
   3. Используйте термостойкий силикон для фиксации наконечника шприца в коробке для культур с помощью резьбы замка Люэра на внешней стороне коробки.
   4. Дайте силикону застыть не менее чем за 24 часа до использования.
2. Стерильный рост в почве
   1. Следуйте протоколу проращивания стерильных семян, описанному в шаге 3, чтобы получить стерильные семена.
   2. Заполните стерильную камеру роста почвой по выбору, смоченной водопроводной водой.
   3. Автоклав на жидком цикле 20 мин, накрыв наконечник замка приманки алюминиевой фольгой. Через 24 часа снова запустите систему в жидкостном цикле в течение 20 минут. Выполняйте все последующие действия в вытяжке с ламинарным потоком.
   4. Прикрепите фильтрующий блок 0,2 μм к креплению Luer lock на ростовой камере (Рисунок 2). Откройте камеру роста и добавьте в почву 500 μл стерилизованного фильтром 1% удобрения 20/20/20. Перемешайте почву стерильным шпателем. Перемешивая почву, добавьте стерильный ddH₂O, чтобы обеспечить ее достаточную гидратацию без перенасыщения.
   5. С помощью стерильного бритвенного лезвия разрежьте агар MS из пластин, содержащих 1-недельную рассаду, на четвертинки. С помощью стерильного шпателя уложите кусочек агара на почву.
   6. Поместите блок камеры роста в инкубатор для выращивания растений на 16 ч/8 ч дневной-ночной цикл при 23 °C и влажности 70%.
3. Стерильный рост в гидропонном растворе
   1. Следуйте протоколу стерильного проращивания, описанному в шаге 3, чтобы получить стерильные семена.
   2. Автоклав наконечника для дозатора и агара половинной концентрации MS на жидком цикле 20 мин. В колпаке с ламинарным потоком оберните нижнюю часть наконечника стерильной лабораторной герметизирующей пленкой. Заполните каждое отверстие пипетки агаром почти доверху.
   3. Добавьте вкладыш для наконечника обратно в коробку для наконечников, заполнив дно коробки гидропонным раствором для выращивания половинной силы (0,5 мМ NH₄H₂PO₄, 3 мМ KNO₃, 2 мМ Ca(NO₃)₂, 1 мМ MgSO₄, 0,023 мМ H₃BO₃, 0,005 мМ MnCl₂·4H₂O, 0,0004 mM ZnSO₄·7H₂O, 0,0002 мМ CuSO₄·5H₂O, 0,00007 мМ H₂MoO₄·1H₂O, и 0,045 мМ FeSO₄·7H₂O, скорректированные на pH 7,0).
   4. Осторожно извлеките рассаду из пластин МС агар и поместите ее на МС агар поверх агара в отверстие для пипетки во вкладыше для наконечника.
   5. Закройте крышку коробки с наконечниками и поместите в камеру для выращивания в режиме 16 ч/8 ч дня и ночи при температуре 23 °C и влажности 70%.
   6. Когда растения станут слишком большими для кончикового ящика, пересадите их в камеру для выращивания культуры, описанную в шаге 5.1. Для переноса снимите всю агаровую пробку с растением и переместите ее в поролоновую пробку с радиальным разрезом. Поролоновая пробка может быть помещена между двумя ящиками для культур, а нижняя коробка для культур может быть заполнена половинчатым материалом Hoagland's.

Results

На рисунке 1 показано семя Typha , прошедшее процесс скарификации, а также не полностью скарифицированное семя с удаленным клювом и нескарифицированное семя. Убедитесь, что время смешивания достаточно для получения в первую очередь полностью скарифицированных семян.

После скарификации и сушки семян жизнеспособность семян следует проверить с помощью метода нестерильного проращивания. По истечении 7 дней минимум 20% семян должны иметь всплывающий радикал с ...

Discussion

Представленный здесь протокол представляет собой подробное руководство по выращиванию видов рогоза из семян для лабораторных применений. В то время как рогоз можно легко размножить черенками корневища, выращивание растений из семян позволяет осуществлять генетическую изменчивость в пределах набора образцов, обеспечивает нахождение растений на равных стадиях роста и дает возможность ранней колонизации для экспериментов по биоаугментации микробов. Важно правильно идентифицировать собираемы...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 и микро; M-стерильный фильтр	VWR	514-4126
3′,5′-Диметокси-4′-гидроксиацетофенон	PhytoTech Labs	S7777
Культивные коробки с крышками (77 мм и раз; 77 мм и раз; 97 мм)	Millipore Sigma	V8505
Термостойкий силиконовый герметик высокой температуры	Имперская производственная группа	KK0205
Лабораторная герметизационная плёнка	Millipore Sigma	P7793
Murashige и Skoog media	PhytoTech Labs	M401
Органосиликоновый поверхностно-активный материал	PhytoTech Labs	S7777
Phytoagar	GoldBiotechnology	P1003
Полисорбат 20	Рош	11332465001