Содержание флавоноидов в процессе роста и развития цветков календулы лекарственной (Calendula officinalis L.

Растущий интерес к вторичным метаболитам из лекарственных растений обусловлен их разнообразным применением в фармацевтической, терапевтической, косметической и других отраслях промышленности. Среди них Calendula officinalis L., однолетнее травянистое растение семейства сложноцветных, произрастающее в Средиземноморском регионе¹ , но широко культивируемое во всем мире, получившее признание благодаря различным применениям своих цветов, включая декоративное, лекарственное, промышленное и кулинарное применение². В настоящее время Англия является крупнейшим в мире производителем C. officinalis³.

Цветочные головки являются наиболее используемым органом этого растения, так как они содержат биологически активные соединения, такие как флавоноиды, каротиноиды, терпеноиды, эфирные масла, дубильные вещества, кумарины, углеводы и жирные кислоты 3,4,5,6. Эти природные соединения способствуют его фармакологическим свойствам, включая противовоспалительное, антиоксидантное, противомикробное и ранозаживляющее действие⁷. Исторически сложилось так, что C. officinalis, широко известный как ноготки, использовался в системах традиционной медицины, таких как аюрведа и гомеопатия, для облегчения широкого спектра заболеваний, от кожных ран и желудочно-кишечных расстройств до нарушений менструального цикла и воспалительных^{состояний.} Современное применение распространяется на фармацевтическую, пищевую и косметическую промышленность, где экстракты календулы добавляются в кремы, сыворотки, настойки и системы доставки лекарств⁹. Несмотря на обширные исследования, остаются проблемы с полным использованием терапевтического потенциала C. officinalis. Изменчивость концентраций биологически активных соединений в зависимости от факторов окружающей среды и культивирования подчеркивает необходимость стандартизированных процессов экстракции и составления рецептур. Биологическая активность флавоноидов и их идентификация в тканях растений являются существенными аспектами контроля качества^10,11.

В Мексике выращивание календулы часто происходит без детального понимания процессов ее роста и развития цветка, что ограничивает ее физиологические показатели, урожайность и корреляцию между биологически активными соединениями и агрономическими факторами. На концентрацию и распределение флавоноидов в тканях растений влияют условия роста и культивирования, что подчеркивает важность изучения физиологических процессов и процессов развития этого вида.

Целью данного исследования был анализ распределения биомассы и взаимоотношений между стоком и источником в вегетативных и репродуктивных органах C. officinalis, выявление ключевых событий развития цветков, а также количественная оценка общей концентрации флавоноидов в цветочных головках с помощью предложенного здесь микроспектрофотометрического метода. Результаты исследования направлены на оптимизацию методов ведения сельского хозяйства и повышение качества продукции, получаемой из этого растения.

1. Общие материалы и методы

1. Полевой эксперимент по выявлению цветочной инициации
   1. Настройте эксперимент в полевых условиях. Пересадите рассаду календулы на площадь 153 м² с плотностью посадки растений на квадратный метр, разнесенные на 60 см друг от друга.
   2. Установите локализованную систему капельного орошения с помощью колеи 16/8000 ПРИМЕЧАНИЕ: Партия семян, использованная в этом эксперименте, была собрана из одного генотипа, а затем отобрана методом массовой селекции в течение трех предыдущих циклов выращивания. Для умеренного климата время посева лучше всего подходит в весенний сезон, а затем пересадка примерно через 2 месяца, когда рассада будет готова. Орошение рекомендуется проводить раз в неделю. Следует избегать вредителей и болезней, а агрономический контроль следует проводить, исходя из потребностей культуры.
2. Собирайте образцы с выбранных растений через день, начиная с 14 дней после пересадки. Ищите апикальную меристему под стереоскопическим микроскопом (около 40Х) для того, чтобы определить дату появления соцветия зачатка.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Когда цветочная меристема (FM) появляется по крайней мере в половине образцов, то эта дата может быть записана как правильный возраст для FM. Экспериментальная единица для наблюдения за инициацией цветков состояла из пяти меристемов в одном растении с восемью репликациями (растениями). Анализ роста и развития цветков
   1. Собирают верхушечный капитулум, когда раскроется цветочный бутон.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что видны язычковые цветы.
   2. Проведение сборов флористических органов в течение последних семи флористических стадий¹² (рис. 1).
      Примечание: В этом эксперименте на каждой фенологической стадии использовались пять капитулумов из восьми различных растений. Во всех случаях цветки были собраны с верхушечной части растения.
   3. Отбирайте пробы целых растений шесть раз в течение биологического цикла.
   4. Просушите собранные образцы в течение 48 ч. Измерьте сухую массу вегетативных и репродуктивных органов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сушку рекомендуется проводить при температуре 40 °C в духовке с циркуляцией воздуха.
   5. Рассчитайте силу стока (SS) и активность стока (SA) как для вегетативных, так и для репродуктивных органов¹³.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для SS и SA используйте формулы, эквивалентные абсолютному темпу роста (AGR) и относительному темпу роста (RGR) соответственно.
   6. Построение кривых роста с помощью таблицы.

2. Количественное определение общего количества флавоноидов¹⁴

1. Высушите растительный материал в духовке с принудительной подачей воздуха при температуре 40 °C в течение 48 часов.
2. Храните высушенный материал в бумажных пакетах. Храните их в темноте при комнатной температуре (RT).
3. Заморозьте растительный материал, используя жидкий азот, чтобы подготовить его к измельчению.
4. Застывший материал измельчить в фарфоровой ступке до достижения однородной консистенции.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны при работе с жидким азотом, так как он может разбрызгаться при контакте с растительным материалом.
5. Подготовка образца: Взвесьте 25 мг измельченного сухого вещества из каждого образца. Добавьте 500 мкл 80% метанола.
6. Экстракция флавоноидов: Инкубируйте смесь в ультразвуке при температуре 70 °C в течение одного часа. Затем центрифугируйте его при 731 г в течение 13 мин¹⁵.
7. Приготовьте аликвоты: Возьмите 150 мкл полученного экстракта и добавьте 37 мкл 80% метанола.
8. Смешайте 50 мкл экстракта, 100 мкл 10% хлорида алюминия и 100 мкл 1 М ацетата калия. Добавьте дистиллированную воду, чтобы довести общий объем до 5 мл.
9. Дайте раствору отдохнуть в течение 30 минут при комнатной температуре.
10. . Для измерения поглощения на длине волны 415 нм использовался спектрофотометр.
11. Построение калибровочной кривой: Приготовьте исходный раствор, растворив 2,7 мг кверцетина в 10 мл 80% метанола. Из этого запаса приготовьте серию из 5 растворов кверцетина в диапазоне от 50, 100, 175, 250 и 350 мкл и разбавьте до 10 мкл.
12. Подготовьте калибровочные образцы: Для каждого раствора кверцетина (500 мкл ) добавьте 100 мкл 10% хлорида алюминия и 100 мкл 1М ацетата калия, 1,5 мл 80% метанола и 2,8 мл дистиллированной воды.
13. Дайте раствору настояться 40 минут при комнатной температуре.
14. Измерьте поглощение калибровочных образцов на длине волны 415 нм с помощью спектрофотометра. Запишите значения поглощения для построения калибровочной кривой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сравните общую концентрацию флавоноидов в лучевых цветках, трубчатых цветках и целых цветочных головках. В этом эксперименте использовался полностью рандомизированный экспериментальный дизайн с пятью повторениями за одну процедуру. Переменной отклика была концентрация флавоноидов; средства лечения сравнивали с тестом Тьюки (SAS Institute, 2003).

Рост C. officinalis проявлял кинетику накопления сигмовидной биомассы по всему растению и его органам. Это наблюдение согласуется с отчетами других авторов, которые последовательно отображают кривую роста сигмовидной кишки. Среди надземных органов стебли накопили больше всего биомассы (рисунок 3). Первоначальный рост во всех надземных органах был медленным, цветение и развитие бутонов началось на 41 день. Растение достигло своей максимальной биомассы на 69-й день, составив в среднем 76 г на растение.

Кинетическое поведение силы стока (SS) для основных органов растения оценивали по мере опыления в течение 77 дней после трансплантации (рис. 3). Результаты показывают, что вегетативные органы (корень, стебель, лист) продолжали расти, пока развивались цветочные головки. Поэтому существовала конкуренция за питательные вещества между вегетативными и репродуктивными органами. Вегетативные органы продемонстрировали значительно более высокий СС, чем цветочные головки. Вегетативные органы достигли своего максимального SS (2,2 г/сут) на 50-й день, в то время как репродуктивные органы достигли максимальной скорости роста (0,64 г/сут) на 62-й день.
Относительная скорость роста (ВВГ) горшечного растения бархатцев и его органов (Рисунок 4) снижалась по мере созревания урожая. Это снижение связано с пропорциональным уменьшением меристемной ткани растения. Пиковые значения ОРР наблюдались на 48-е сутки в репродуктивных органах, которые показали самый быстрый темп роста (0,137 г/г/сут), в то время как вегетативные органы показали самый быстрый темп роста (0,16 г/г/сут) значительно раньше, на 21-е сутки. Репродуктивные органы смогли превзойти вегетативные органы только после 44 дня. С этого дня у растения постепенно снижалась меристемная активность по образованию листьев, одновременно увеличивая активность репродуктивных меристем.

Цветочная инициация представляет собой переход меристемы от вегетативной (производящей только листья) к репродуктивной (образующей цветочные зачатки, которые разовьются в цветочные головки). Морфологически этот переход происходит быстро и визуально идентифицируется под микроскопом по переходу от небольшой куполообразной вегетативной вершины к более крупной остроконечной репродуктивной вершине с небольшими боковыми выступами16. Такая дифференциация включает в себя гистологические, физиологические и биохимические изменения в верхушках17.

У горшечных бархатцев, цветочные головки которых являются основными органами, заготавливаемыми в лечебных и декоративных целях, начало цветения происходило на пятой неделе после пересадки, когда они выращиваются в центральных высокогорных долинах Мексики (Таблица 1).

Выявлены различия в концентрации общих флавоноидов (выраженных в кверцетиновых эквивалентах) между стадиями развития цветка. Наибольшее содержимое наблюдалось между восьмой и одиннадцатой стадиями, что соответствует бутонам с отделенными чашелистиками до полностью раскрытых цветочных головок. Эти результаты свидетельствуют о том, что сбор цветочных головок календулы в терапевтических целях должен проводиться на этих стадиях, чтобы максимизировать содержание флавоноидов. На более ранних стадиях (бутоны с объединенными чашелистиками) или на более поздних стадиях (стареющие цветочные головки) концентрация флавоноидов была на 22-27% ниже по сравнению с полностью раскрытыми цветочными головками.

При рассмотрении производства флавоноидов на растение (Таблица 2) на седьмой и восьмой стадиях было получено наибольшее содержание флавоноидов в цветочных головках. Эта информация имеет важное значение для коммерческого производства календулы, так как она способствует не только максимальному выходу флавоноидов, но и стандартизации для разработки фитофармацевтических препаратов.
Рисунок 1: Стадии развития цветка у календулы. Рисунок иллюстрирует стадии развития цветков у Calendula officinalis L., широко известной как ноготки в горшке. Он обеспечивает визуальное представление о прогрессии от начальной стадии закладки почек до старения цветочной головки и начала формирования плодов (семянки). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Кинетика распределения биомассы в календуле. На этом рисунке показано, как биомасса распределяется между различными органами растения с течением времени, выделяя изменения в накоплении биомассы в различных частях растения, таких как стебли, листья, цветы и корни. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3: Кинетика прочности (СС) снижения прочности вегетативных и репродуктивных органов в календуле на протяжении всего цикла. На этом рисунке показано, как изменяется сила поглощения в различных органах растения, таких как стебли, листья и цветы, от начала до конца жизненного цикла растения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 4: Кинетика активности стока (СК) в вегетативных и репродуктивных органах календулы на протяжении ее цикла. На рисунке показано, как уровень активности, связанный со спросом на ресурсы, изменяется с течением времени для различных частей растения, таких как стебли, листья и цветы. Он отражает смещение опускания растения от ранних стадий роста к зрелости и репродуктивному развитию. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 5: Общая концентрация флавоноидов (мг/г сухого вещества) во время цветочного развития календулы. На рисунке показано количество флавоноидов, присутствующих в сухом веществе цветков бархатцев на разных стадиях развития. Этот показатель помогает узнать, как изменяется содержание флавоноидов по мере взросления цветов. Результаты представляют собой среднее значение, сравниваемое с помощью теста Тьюки HSD (p > 0,05) n=5. Столбцы представляют стандартную ошибку. Разные буквы указывают на существенные отличия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Таблица 1: Последовательность событий развития цветков у календулы. Эта таблица помогает понять ход развития цветков у календулы, описывая этапы от начального формирования бутонов до полного цветения и развития плодов (семянки). * Результаты отображаются как среднее ± стандартная ошибка (n = 5). По данным дисперсионного анализа, были выявлены достоверные различия между методами лечения (p ≤ 0,05). Разные буквы указывают на значительные различия между критерием нуждаемости Тьюки ( α = 0,05, n = 5). НД: Не обнаружено. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 2: Общее содержание флавоноидов в цветочных головках календулы на протяжении всего развития цветка. В этой таблице показано, как изменяется концентрация флавоноидов от начального формирования бутонов до полного цветения и развития плодов (семянки). Данные выделяют оптимальные этапы сбора урожая и максимизации содержания флавоноидов. Производство флавоноидов (г/растение) = [Сухая масса цветочного органа (г/растение) × Концентрация флавоноидов (мг/г) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Авторам нечего раскрывать.