Методическая статья

Флуоресцентные анализы для изучения взаимодействия микобактерий туберкулеза с иммунным рецептором SLAMF1

DOI:

10.3791/67745

⸱

28 февраля 2025 г.

 ,  ,  , 
1Centro de Investigaciones Básicas y Aplicadas (CIBA), Universidad Nacional del Noroeste de la Provincia de Buenos Aires (UNNOBA), 2Centro de Investigaciones y Transferencias del Noroeste de la Provincia de Buenos Aires (CIT NOBA), UNNOBA- Universidad Nacional de San Antonio de Areco (UNSAdA)- Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET), 3CONICET- Universidad de Buenos Aires, Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales (IQUIBICEN), 4Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Departamento de Química Biológica, Universidad de Buenos Aires

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом исследовании представлен протокол оценки взаимодействия Mycobacterium tuberculosis с микробным сенсором SLAMF1. Анализы проводились на макрофагах, полученных из моноцитов человека, с использованием проточной цитометрии и флуоресцентной микроскопии. Описанные инструменты актуальны для изучения взаимодействий между патогенами и иммунорецепторами.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Оценка прямого взаимодействия между патогенами и иммунными рецепторами обычно включает в себя сложные методы или подразумевает использование трансгенных штаммов и генетически модифицированных клеток. В данной работе описан альтернативный метод выявления биохимического взаимодействия между макрофагальным микробным сенсором SLAMF1 и Mycobacterium tuberculosis . Были разработаны два технических подхода с использованием проточной цитометрии и флуоресцентной микроскопии. Генерировали экстракты общих клеточных белков из макрофагов человека, затем инкубировали с целыми клетками антигенов M. tuberculosis (WCMtb) или M. tuberculosis (Mtb Ags) в течение ночи при 4 °C и, наконец, сшивали с помощью обработки формальдегидом/глицином/этиленгликолем bis (сукцинимидилсукцинатом).Взаимодействие SLAMF1 с WCMtb с помощью проточной цитометрии было обнаружено с помощью PE-специфического антитела против SLAMF1. Существование взаимодействия с помощью флуоресцентной микроскопии осуществляли путем присоединения окрашенных Rhodamine-PE Mtb Ags к предметным стеклам, покрытым поли-D-лизином, которые инкубировали с экстрактом общего белка из макрофагов, полученных из моноцитов. После лечения кросслинкингом SLAMF1 визуализировали с использованием первичных (анти-SLAMF1) и вторичных (Alexa Fluor 488) антител. Эти анализы обеспечили мощный биохимический инструмент для измерения взаимодействий патогенов и иммунорецепторов, преодолев трудности, связанные с трансгенными клеточными линиями и экспериментами по модуляции экспрессии белковых генов.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mycobacterium tuberculosis, возбудитель туберкулеза, выявленный 142 года назад, остается глобальной проблемой, в настоящее время инфицируя, по меньшей мере, четвертьнаселения мира1. Передаясь воздушно-капельным путем от инфицированных людей, M. tuberculosis достигает альвеолярных макрофагов в легких, где может выживать в течение длительных периодов времени в латентном состоянии 2,3. Мало того, что активируется местный макрофагический ответ, но в последние годы было описано, что периферические моноциты могут рекрутироваться в дыхательные пути и дифференцироваться в альвеолярные макрофаги, вызывая еще более устойчивый ответ против M. tuberculosis, чем их аналог фетальногопроисхождения.

Макрофаги являются основными игроками врожденного иммунитета. При приеме внутрь M. tuberculosis макрофаги проявляют многочисленные микробицидные функции, такие как секреция провоспалительных цитокинов, слияние фаголизосомы и активация других иммунных клеток для уничтожения M. tuberculosis 2,3. Тем не менее, сложная архитектурная структура этого патогена обеспечивает эффекторы (например, белки и липиды), способные регулировать метаболизм и функции макрофагов и, как следствие, воспалительныйпроцесс. Это манипулирование реакциями макрофагов посредством секреции факторов вирулентности или эксплуатации факторов хозяина приводит к различным стратегиям убегания, применяемым M. tuberculosis. Некоторые ключевые механизмы уклонения включают индукцию противовоспалительных цитокинов, ингибирование созревания и закисления фаголизосом, изменения окислительного стресса, нарушение аутофагии и дефицит во время процессинга и презентации антигена 3,5.

Жестко регулируемое взаимодействие между макрофагами и M. tuberculosis имеет решающее значение для развития правильного иммунного ответа. Таким образом, изучение этих синапсов является ключом к выявлению иммунопротекторных или иммунопатогенных механизмов, индуцированных перекрестными помехами между хозяином и патогеном, а также к выявлению потенциальных терапевтических мишеней. Многие рецепторы опосредуют распознавание и/или интернализацию M. tuberculosis, в том числе TLR 6,7,8, NLR 7,8, рецепторы комплемента 6,8, лектиновые рецепторыС-типа 6,8 и рецепторы мусорщика 6,8. Накапливающиеся данные указывают на то, что как поверхностные, так и внутриклеточные PRR играют важную роль во время инфекции, распознавая опсонизированные и неопсонизированные M. tuberculosis.

Zihad and Sifat et al. недавно рассмотрели участие PRR в индуцированных M. tuberculosis ответах врожденных клеток9. В частности, большинство представителей семейства TLR были вовлечены во взаимодействие с лигандами M. tuberculosis 6,7. Surface TLR2 распознает антигены микобактерий, такие как ацилированные липопротеины, липопротеин 19 кДа, липопротеин LprA, липопротеин LprG, антиген 30 кДа, антиген 38 кДа, MymA, пролин-пролин-глутаминовая кислота (PPE)-57, LAM, LM, PIM, белок теплового шока 60, сигнатурный белок Rv1509 и секретируемый белок ESAT-67. Мембрана TLR4 взаимодействует с белками теплового шока, антигеном 38 кДа, RpfE, Rv0652, Rv0335c, Rv2659c, Rv1738, Rv2627c, Rv2628, GrpE и HBHA. С другой стороны, лиганды для эндосомальных TLR (TLR 3, 7, 8 и 9) включают дцРНК, тРНК, ссРНК, фагосомальную РНК и дцДНК M. tuberculosis. Кроме того, TLR2 играет активную роль в инициировании иммунных реакций при совместном действии с TLR1 и TLR6, TLR4 и TLR9 6,7. NOD2 и NLRP3 являются наиболее хорошо охарактеризованными цитоплазматическими NLR при туберкулезе. Хотя их специфические лиганды остаются изученными, эти рецепторы активируются мурамилдипептидом или ESAT-6, соответственно 7,8. Лектиновые рецепторы С-типа классически участвуют в эндоцитозе M. tuberculosis. В то время как Dectin-2 действует как прямой PRR для ManLAM клеточной стенки M. tuberculosis, лиганд Dectin-1 еще не обнаружен8. Mincle и MCL распознают гликолипидный трегалоз-6,6'-димиколат (TDM), также называемый фактором кордового мозга7. DCAR взаимодействует с микобактериальными гликолипидами фосфатидил-мио-инозитолманнозидами (PIMs)7. CR3 распознает микобактериальные LAM и PIM, DC-SIGN лигирует ManLAM, MR распознает ряд компонентов M. tuberculosis, включая ManLAM, PIM, LM, гликопротеин 38 кДа, антиген 19 кДа и другие маннозилированные белки, в то время как лиганд DCIR до сих пор не идентифицирован.

Растворимые CLR включают SP-A, который распознает ManLam, LM, гликопротеин 60 кДа и гликопротеин Apa; SP-D, взаимодействующий с LAM, LM и PILAM; и MBL, которая специализируется на распознавании ManLAM 6,7. SR-A и MARCO имеют TDM в качестве лиганда, SR-B1 распознает ESAT-6, а CD36 связывается с ManLAM и LM 7,8. Кроме того, Dectin-1, Mincle и MARCO также могут сочетаться с TLR2 или TLR4 для запуска сигналов после обнаружения M. tuberculosis PAMPs 6,7. CD14 является поверхностным рецептором, который обладает способностью интернализировать неопсонизированные бактерии, а также распознает белок теплового шока Шаперонин 60.1. В частности, CD14 функционирует как корецептор наряду с MARCO и TLR26. AIM2 является цитозольным рецептором, который может воспринимать одноцепочечную ДНК при выходе M. tuberculosis из фагосомы8. Наконец, AhR является лиганд-активируемым транскрипционным фактором, который связывается с пигментированным фактором вирулентности нафтохинон-фтиоколом M. tuberculosis6.

Многие из описанных выше взаимодействий были постулированы, а не строго продемонстрированы. Даже лиганды для некоторых рецепторов остаются неизвестными, что усиливает необходимость лучшего понимания области иммунораспознавания M. tuberculosis. В этом контексте костимулирующая молекула SLAMF1 (Signaling Lymphocytic Activation Molecule) была недавно описана как рецептор M. tuberculosis в Barbero et al.10. Действуя не только как сигнальная молекула, но и как сенсор M. tuberculosis, SLAMF1 играет особенно интригующую роль при туберкулезе. SLAMF1 может индуцировать активацию иммунных клеток путем модуляции защитных функций, таких как производство ИФН-γ Т-клетками посредством фосфорилирования Erk/CREB 11,12,13, аутофагия в нейтрофилах 14 и бактериальный клиренс в макрофагах15.

Взаимодействие рецепторов и лигандов изучалось на протяжении многих лет с использованием таких методов, как ИФА, поверхностный плазмонный резонанс (SPR), изотермическая титрованная калориметрия (ITC), флуоресцентная поляризация (FP), рентгеновская кристаллография, спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР), микромасштабный термофорез (MST), резонансный перенос энергии (например, BRET или FRET), конфокальная микроскопия, электронная микроскопия, криоэлектронная микроскопия (крио-EM) и атомно-силовая микроскопия (AFM)16,17, 18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28. Некоторые из этих подходов подразумевают использование репортерных генов, меченых рекомбинантных белков или химерных молекул, моделей нокаута, нокдауна или сверхэкспрессии. В качестве альтернативы, вычислительные инструменты могут предсказывать рецептор-лигандные взаимодействия и сайты связывания и часто используются в сочетании с биологическими подходами для получения всестороннего понимания взаимодействий 29,30,31. В этой статье описываются две альтернативы для обнаружения биохимического взаимодействия, а также раздел о том, как флуоресцентно мечить бактерии. Представлен протокол, который позволяет изучать рецептор-патогенные взаимодействия in vitro, в частности, оценивать взаимодействие SLAMF1-M. tuberculosis с помощью проточной цитометрии и флуоресцентной микроскопии, двух обычно доступных и регулярно используемых методов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все процедуры с участием макрофагов, полученных из моноцитов человека, были выполнены в соответствии с Хельсинкской декларацией (2013) и по согласованию с Комитетом по этике UNNOBA (COENOBA). Письменное информированное согласие было получено до сбора пробы. Распределение мужчин и женщин в группах было 13/6, а средний возраст составил 32 года, с межквартильным диапазоном (МКР) 18-75 лет. Наличие предшествующих патологий, сопутствующих заболеваний или положительный диагноз на туберкулез были определены как критерии исключения. Подробная информация о реагентах и оборудовании приведена в Таблице материалов.

1. Культивирование и стимуляция макрофагов, полученных из моноцитов

  1. Забор крови
    1. Получить 60 мл крови от здоровых доноров методом венепункции в гепаринизированном шприце.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Забор крови должен быть выполнен биохимиком или техником по флеботомии.
    2. Выбросьте иглу в контейнер для утилизации острых предметов и любой материал, который контактировал с кровью донора, в контейнер для патологических отходов.
  2. Выделение моноцитов и генерация макрофагов
    1. Осторожно перелейте кровь в пробирки объемом 50 мл и разбавьте ее наполовину физиологическим раствором.
    2. Выполнение центрифугирования на среде с градиентом плотности для получения мононуклеарных клеток периферической крови (ПМЦ).
    3. Соберите PBMC с белесого ореола.
    4. Выполните два промывки солевым раствором при 400 х г в течение 10 минут и последнее промывание при 200 х г в течение 15 минут при 20 °C для устранения тромбоцитов.
    5. Определите количество PBMC в камере для подсчета клеток и выполните положительный магнитный отбор CD14 с помощью гранул CD14.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При выборе магнитного поля внимательно следуйте инструкциям производителя. Кроме того, проверить чистоту выделенных моноцитов можно с помощью проточной цитометрии.
    6. Ресуспендировать выделенные клетки в RPMI 1640 и определить количество моноцитов в камере для подсчета клеток.
    7. Затравка 500 мкл 1 × 106/мл CD14 положительных отобранных моноцитов на лунку в 24-луночном планшете для культивирования клеток в отсутствие сыворотки для повышения адгезивности.
    8. Через 2 ч удалите неадгезивные клетки, промыв их предварительно подогретым РПМИ 1640.
    9. Для дифференцировки макрофагов культивируют адгезивные моноциты в течение дополнительных 16-18 ч (в течение ночи) в 1 мл полной среды (среда RPMI 1640 с добавлением L-глутамина, 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 100 ЕД/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина).
    10. На следующий день смените питательную среду. Удалите среду, промойте 1 мл 1x PBS и добавьте 1 мл готового носителя.
    11. Стимулируйте макрофаги ультразвуком M. tuberculosis (M. tuberculosis antigens (Ags)) в течение 24 ч. Используйте 10 мкл M. tuberculosis Ags (10 мкл = 1 ×10 6 бактерий) на 1 ×10 6 моноцитарных макрофагов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: 10 μL M. tuberculosis Ags (Mtb Ags) = 1 × 106 бактерий, количественно определяемых по O.D. 600нм в спектрофотометре с учетом O.D. 1 как 1 x 108 бактерий/мл. Используйте шкафы биобезопасности BSL2 и инкубатор при температуре 37 °C в атмосфере с 5%CO2 для всех этапов культивирования.
  3. Подтверждение экспрессии SLAMF1
    1. Соберите макрофаги из одной лунки. Поставьте тарелку с культурой на холодную поверхность. Отделите ячейки движениями вверх и вниз, добавив 1 мл холодного FACS (1x PBS + 2% FBS) два раза подряд. Для сбора используйте цитометрическую трубку с круглым дном.
    2. Центрифугируйте клетки при давлении 500 x g в течение 5 минут при 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость, сбросив ее.
    3. Окрашивать клетки флуорофорным антителом SLAMF1 к человеку в течение 30 минут при 4 °C в темноте. Вихрь после добавления 1,25 мкл антитела.
    4. Промойте клетки для устранения избытка антител с помощью FACS, повторно суспендируйте гранулу в FACS и получите образец с помощью проточного цитометра.
      ПРИМЕЧАНИЕ: 1,25 мкл антитела против SLAMF1 соответствует 0,0625 мкг, которое используется для мечения 0,5 x 106 макрофагов. Тем не менее, настоятельно рекомендуется титрование антитела, а также выполнение соответствующего изотипа или контроля флуоресценции минус один (FMO).

2. Приготовление экстракта общего клеточного белка

  1. Подготовка буфера для лизиса
    1. Приготовьте буфер для радиоиммуноципитации (RIPA) с NaCl 150 мМ, Трис 10 мМ, ЭДТА 5 мМ, SDS 1%, Тритон X-100 1% и дезоксихолат натрия 1%.
    2. Дополните буфер RIPA 1 мМ фенилметилсульфонилфторидом (PMSF) и ингибиторами протеазы, такими как пепстатин А и лейпептин.
  2. Сбор клеток и выделение белков
    1. Отбросьте полный RPMI из лунок планшета с помощью пипетки P1000 и соберите макрофаги путем пипетирования вверх и вниз холодным 1x PBS.
    2. Переложите ячейки в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл. Соберите по одной лунке на микротрубку.
    3. Центрифугируйте при 500 x g в течение 5 мин при 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость.
    4. Добавьте 1 мл холодного PBS и повторите шаги 2.2.2 и 2.2.3, собирая клетки в ту же микроцентрифужную пробирку.
    5. Ресуспендируйте клеточные гранулы в 100 мкл 1x PBS и объедините четыре пробирки. Повторите шаг 2.2.3. Каждая пробирка будет содержать 2 x 106 макрофагов.
    6. Добавьте 100 мкл дополненного буфера RIPA и инкубируйте суспензию на льду в течение 1 ч, вортексируя каждые 10 мин.
    7. Центрифугируйте при давлении 14 000 x g в течение 15 мин. Соберите надосадочную жидкость и сохраните до использования при температуре -20 °C.

3. Взаимодействие M. tuberculosis -SLAMF1 методом проточной цитометрии

  1. Белково-бактериальная сшивка
    1. Инкубировать 1 × 106 целых инактивированных клеток M. tuberculosis (WCMtb, M. tuberculosis , инактивированных гамма-облучением) с экстрактом белка из 1 x 106 макрофагов (50 мкл) в течение ночи при 4 °C во вращающемся держателе микротрубок.
      ПРИМЕЧАНИЕ: 10 мкл WCMtb = 1 × 106 бактерий, количественно определяемых по O.D. 600нм на спектрофотометре с учетом O.D. 1 как 1 x 108 бактерий/мл.
    2. На следующий день добавьте 500 мкл 1% формальдегида, разведенного в 1x PBS. Инкубировать в течение 15 минут при перемешивании (шейкере) при комнатной температуре (RT).
    3. Добавьте 25 мкл 0,125 М глицина, разведенного в воде. Инкубировать в течение 5 минут при перемешивании (шейкере) при RT.
    4. Дважды вымойте 1 мл 1x PBS при 14 000 x g в течение 5 минут. Выбросьте надосадочную жидкость между этапами стирки.
    5. Повторно суспендируйте гранулу и инкубируйте суспензию в 500 мкл 2 мМ сшивающего агента этиленгликоля биса (сукцинимидилсукцината) (EGS), разведенного в смеси ледяной уксусной кислоты:вода в соотношении 1:1 в течение 1 ч при RT.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Настоятельно рекомендуется готовить реагенты во время использования. Для приготовления EGS необходимо смешать ледяную уксусную кислоту и воду в равных пропорциях и нагреть до 70 °C. Если раствор не горячий, EGS не полностью ресуспендируется.
  2. Окрашивание SLAMF1
    1. Повторите шаг 3.1.4, используя 500 мкл 1x PBS в первой стирке и 1 мл во второй.
    2. Окрашивайте белково-бактериальный комплекс в течение 30 мин при 4 °C в темноте антителом против человека SLAMF1 (как на шаге 1.3.3) путем добавления антитела в микротрубку и вортексинга. Используйте количество антитела, подходящее для 1 x 106 клеток (2,5 мкл или 0,125 мкг).
    3. Промойте клетки для устранения избытка антител с помощью FACS, повторно суспендируйте гранулу в FACS и получите образец в проточном цитометре (как в шаге 1.3.4).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните управление соответствующим изотипом или FMO.

4. Мечение антигенов M. tuberculosis

  1. Ресуспендируйте родамин В в этаноле в исходной концентрации 5 мг/мл (1000x). Хранить при температуре -20 °C до использования.
  2. Добавьте 1 мкл родамина B на 100 мкл M. tuberculosis Ags в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл.
  3. Инкубировать в течение 45 мин при РТ при непрерывном перемешивании (вихре).
  4. Простирайте не менее 3 раз при 14 000 x g в течение 5 минут при 24 °C с использованием 1 мл 1x PBS до тех пор, пока надосадочная жидкость не станет прозрачной. Пеллета (Mtb-R Ags) будет выглядеть светло-розовой.
  5. Суспендируйте Mtb-R Ags в 100 мкл 1x PBS для восстановления исходного объема.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется работать в стерильных условиях. Убедитесь, что окрашивание выполняется непосредственно перед проведением экспериментов.

5. Взаимодействие M. tuberculosis и SLAMF1 методом флуоресцентной микроскопии

  1. Сшивание бактерий и белков
    1. Введите круглые покровные стекла диаметром 12 мм в 24-луночные культуральные планшеты (1 покровное стекло на лунку) с помощью хирургического пинцета с круглым носиком.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Тщательно очистите покровные стекла 70% этанолом. При желании они могут быть автоклавированы или стерилизованы под ультрафиолетовым излучением в течение 30 минут.
    2. Инкубируйте покровное стекло с 400 мкл 10 мкг/мл поли-D-лизина в течение ночи при 4 °C. Накройте тарелку алюминиевой фольгой, чтобы защитить ее от света.
    3. На следующий день достаньте тарелку из холодильника и дважды промойте покровную крышку 1 мл воды.
    4. Дайте покровному листу высохнуть.
    5. Разведите 20 мкл (2 x 106) Mtb-R Ags в 180 мкл 1x PBS. Последних 200 мкл достаточно, чтобы полностью покрыть покровное стекло.
    6. Инкубируйте покровное стекло с Mtb-R Ags в течение 1 ч при 37 °C в клеточном инкубаторе.
    7. Слейте остатки жидкости и дважды промойте 1 мл 1x PBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе правильная адгезия Mtb-R к покровному стеклу может быть проверена с помощью флуоресцентного микроскопа с использованием фильтров, соответствующих красному каналу.
    8. Добавьте 400 мкл блокирующего буфера (10% FBS в 1x PBS) в течение 30 минут при RT в перемешивании (шейкере).
    9. Дважды промойте с 400 μл блокирующего буфера.
    10. Инкубировать со 100 мкл белкового экстракта, разведенного в 300 мкл 1x PBS, в течение 2 ч при RT в перемешивании (шейкере).
    11. Добавьте 400 мкл 1% формальдегида, разведенного в 1x PBS. Инкубировать в течение 15 минут при перемешивании (шейкере) при RT.
    12. Добавьте 500 мкл глицина 0,125 М, разведенного в воде. Инкубировать в течение 5 минут при перемешивании (шейкере) при RT.
    13. Умойтесь дважды 1 мл 1x PBS.
    14. Добавьте 400 мкл 2 мМ EGS в течение 1 ч при RT при перемешивании (шейкере).
    15. Повторите шаг 5.1.13
      ПРИМЕЧАНИЕ: Настоятельно рекомендуется готовить реагенты во время использования.
  2. Окрашивание SLAMF1
    1. Заверните крышку тарелки для культуры в парафиновую пленку.
    2. Добавьте каплю 60 мкл предварительно титруемого первичного антитела против SLAMF1 (разведение 1:75) на крышку, покрытую парафиновой пленкой.
    3. Осторожно снимите покровное стекло с пластины с помощью изогнутого хирургического пинцета с тонким концом и игл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы облегчить снятие покровных стекол, иглу можно согнуть примерно под углом 45°.
    4. Переверните покровную крышку над каплей, содержащей антитело. Инкубировать в течение 30 минут при RT в темноте.
    5. Поднимите покровное стекло и дважды промойте с помощью блокирующего буфера.
    6. Переверните покровное стекло над новой каплей, содержащей вторичное антитело (разведение 1:200). Инкубировать в течение 30 минут при RT в темноте.
    7. Повторите шаг 5.2.5.
    8. Удалите лишнюю жидкость и закрепите покровное стекло на каплю монтажной жидкости, помещенную на предметное стекло.
    9. Наблюдайте под флуоресцентным микроскопом с использованием соответствующих фильтров.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется работать в стерильных условиях. Разведите антитела в блокирующем буфере. Обращайтесь с покровным стеклом осторожно, чтобы не поцарапать его, которые могут затруднить наблюдение под микроскопом. Настоятельно рекомендуется использовать монтажную жидкость, подходящую для флуоресценции.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В данной работе представлен протокол, позволяющий оценить взаимодействие M. tuberculosis с иммунным рецептором SLAMF1 в макрофагах человека (рис. 1). С этой целью была получена периферическая кровь от здоровых доноров. Затем PBMC разделяли центрифугированием на среде с градиентом плотности, а моноциты выделяли методом магнитного положительного отбора (чистота ≥95%, рис. 2A, B). Выделенные моноциты приклеивали к пластиковым культуральным...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование является полезным руководством для изучения биохимического взаимодействия между M. tuberculosis и микробными сенсорами, экспрессируемыми в макрофагах человека, ключевом типе клеток, участвующем в реакции хозяина во время туберкулеза. Предоставленные протоколы будут актуальны для расшифровки молекул, которые играют роль в проникновении M. tuberculosis в фагоциты.

Характеристика биомолекулярных взаимодействий, таких как взаимод...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана Национальным университетом Норвегии провинции Буэнос-Айрес (номера грантов SIB 0618/2019, SIB 2582/2012 для V.P.), Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica (ANPCyT, номера грантов PICT-2012-2459 и PICT A 2017-1896 для V.P. и PICT-2021-I-INVI-00584 для A.B.); Фонд Флоренсио Фиорини; и Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET, grant no PIO 157201501000CO to V.P.). Благодарим Наталью Мените и Гастона Вильяфанье за техническую поддержку. Мы выражаем признательность д-ру Пауле Баррионуэво и д-ру Лусиане Бальбоа за научную дискуссию во время публикации, которая привела к разработке анализов, представленных в этой работе. Наконец, мы благодарим доктора Эстермана за его советы по протоколам кросслинкинга, Lic. Морони за советы по работе с полилизином и ликом. Морикони за помощь в составлении схематических рисунков.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Вторичное антитело Alexa Fluor 488ИнвитрогенА21121Для флуоресцентной микроскопии
антитела к SLAMF1 FITC eBioscience11-1509-42Для проточной цитометрии
антитела к SLAMF1 PE Биолегенда306308Для проточной цитометрии
первичное антитело к SLAMF1 Биолегенда306302Для флуоресцентной микроскопии
Аква-Поли / КреплениеПолинауки18606-20Монтажный носитель
CD14 МикрогранулыМилтеньи Биотек130-097-052Для выделения моноцитов
Покровные стекла 12 ммHDA-Для анализа взаимодействия методом микроскопии
EGSThermoFisher Scientific 21565Для лечения сшивки
FACSCanto IIBD Biosciences338960Проточный цитометр с программным обеспечением BD FACSDiva
Фетальная сыворотка крупного рогатого скота Натокор-Инактивированный и облученный, для культивирования макрофагов
Ficoll-Paque PLUSЦитива17144003Для отделения МПК
Фиджи/ImageJПрограммное обеспечение с открытым исходным кодом-Для анализа микрофотографий
FlowJo 7.6.2 Древовидная звезда-Для анализа проточной цитометрии
ФормальдегидМеркK47740803613Для лечения сшивки
Стеклянные предметные стеклаСтекло Класс-Для анализа взаимодействия методом микроскопии
ГлицинСигмаГ8898Для лечения сшивки
Имидж-сканер.A2Карл Цейсс430005-9901-000Флуоресцентный микроскоп с модулем подсветки Colibri 7
Марк iMarkБИО-РАД1681130Считыватель абсорбции микропланшетов 
L-глютаминСигма Олдрич49419Для культивирования макрофагов
M. tuberculosis, штамм H37Rv, гамма-облученные цельные клетки BEI Resources, NIAID, NIHНР-14819Для анализа взаимодействия
M. tuberculosis, штамм H37Rv, лизат цельных клетокBEI Resources, NIAID, NIHНР-14822Для стимуляции макрофагов и анализа взаимодействия
Неофуге 13РИсцеляющая силаНеофуге 13РВысокоскоростная охлаждаемая центрифуга для экстракции белка
Пенициллин/стрептомицинGibco15140122Для культивирования макрофагов
ПМСФThermoFisher Scientific36978Для выделения белков
Поли-D-лизинСигма ОлдричА-003-МДля обработки покровных стекол
Коктейль ингибиторов протеазыСигма Олдрич П8340Для выделения белков
Rhodamine B Сигма Олдрич 21955Для окрашивания M. tuberculosis
РПМИ 1640Gibco11875093Для культивирования макрофагов
Центрифуга Sorvall ST 16/16RThermoFisher Scientific75004240Для выделения PBMC и моноцитов

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Global Tuberculosis Report 2023. , World Health Organization. Available at: https://www.who.int/tb/publications/global_report/en/ (2023).
  2. Ahmad, F., et al. Macrophage: A cell with many faces and functions in tuberculosis. Front Immunol. 13, 882130(2022).
  3. Bo, H., et al. Mycobacterium tuberculosis-macrophage interaction: Molecular updates. Front Cell Infect Microbiol. 13, 1187205(2023).
  4. Papp, A. C., et al. AmpliSeq transcriptome analysis of human alveolar and monocyte-derived macrophages over time in response to Mycobacterium tuberculosis infection. PLoS One. 13 (5), e0198069(2018).
  5. Zhai, W., Wu, F., Zhang, Y., Fu, Y., Liu, Z. The immune escape mechanisms of Mycobacterium tuberculosis. Int J Mol Sci. 20 (2), 340(2019).
  6. Van Crevel, R., Ottenhoff, T. H. M., Van der Meer, J. W. M. Innate immunity to Mycobacterium tuberculosis. Clin Microbiol Rev. 15 (2), 294-309 (2002).
  7. Mortaz, E., et al. Interaction of pattern recognition receptors with Mycobacterium tuberculosis. J Clin Immunol. 35 (1), 1-10 (2015).
  8. Stamm, C. E., Collins, A. C., Shiloh, M. U. Sensing of Mycobacterium tuberculosis and consequences to both host and bacillus. Immunol Rev. 264 (1), 204-219 (2015).
  9. Zihad, S. M. N. K., et al. Role of pattern recognition receptors in sensing Mycobacterium tuberculosis. Heliyon. 9 (10), e20636(2023).
  10. Barbero, A. M., et al. SLAMF1 signaling induces Mycobacterium tuberculosis uptake leading to endolysosomal maturation in human macrophages. J Leukoc Biol. 109 (8), 257-273 (2021).
  11. Pasquinelli, V., et al. Expression of signaling lymphocytic activation molecule-associated protein interrupts IFN-γ production in human tuberculosis. J Immunol. 172 (2), 1177-1185 (2004).
  12. Pasquinelli, V., et al. Phosphorylation of mitogen-activated protein kinases contributes to interferon-γ production in response to Mycobacterium tuberculosis. J Infect Dis. 207 (2), 340-350 (2012).
  13. Pasquinelli, V., et al. IFN-γ production during active tuberculosis is regulated by mechanisms that involve IL-17, SLAM, and CREB. J Infect Dis. 199 (5), 661-665 (2009).
  14. Pellegrini, J. M., et al. Neutrophil autophagy during human active tuberculosis is modulated by SLAMF1. Autophagy. 17 (2), 423-426 (2021).
  15. Song, T., Dong, C., Xiong, S. Signaling lymphocyte-activation molecule SLAMF1 augments mycobacteria BCG-induced inflammatory response and facilitates bacterial clearance. Int J Med Microbiol. 305 (6), 572-580 (2015).
  16. Eble, J. A. Titration ELISA as a method to determine the dissociation constant of receptor-ligand interaction. J Vis Exp. (132), e57032(2018).
  17. Patching, S. G. Surface plasmon resonance spectroscopy for characterization of membrane protein-ligand interactions and its potential for drug discovery. Biochim Biophys Acta Biomembr. 1838 (1), 43-55 (2014).
  18. Draczkowski, P., Matosiuk, D., Jozwiak, K. Isothermal titration calorimetry in membrane protein research. J Pharm Biomed Anal. 87, 296-304 (2014).
  19. Smith, D. S., Eremin, S. A. Fluorescence polarization immunoassays and related methods for simple, high-throughput screening of small molecules. Anal Bioanal Chem. 391 (5), 1499-1507 (2008).
  20. García-Nafría, J., Tate, C. G. Cryo-electron microscopy: Moving beyond X-ray crystal structures for drug receptors and drug development. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 60, 51-71 (2020).
  21. Asami, J., Shimizu, T. Structural and functional understanding of the toll-like receptors. Protein Sci. 30 (4), 761-772 (2021).
  22. Phạm, T. T. T., Rainey, J. K. On-cell nuclear magnetic resonance spectroscopy to probe cell surface interactions. Biochem Cell Biol. 99 (6), 683-692 (2021).
  23. El Deeb, S., et al. Microscale thermophoresis as a powerful growing analytical technique for the investigation of biomolecular interaction and the determination of binding parameters. Methods Appl Fluoresc. 10 (4), 045001(2022).
  24. El Khamlichi, C., et al. Bioluminescence resonance energy transfer as a method to study protein-protein interactions: Application to G protein-coupled receptor biology. Molecules. 24 (3), 505(2019).
  25. Schneider, P., Willen, L., Smulski, C. R. Tools and techniques to study ligand-receptor interactions and receptor activation by TNF superfamily members. Methods Enzymol. 545, 103-125 (2014).
  26. Park, A. M. W., Schirmer, P. S. H. Atomic force microscopy: A multifaceted tool to study membrane proteins and their interactions with ligands. Biochim Biophys Acta Biomembr. 1838 (1), 74-89 (2014).
  27. Zalejski, J., Sun, J., Sharma, A. Unravelling the mystery inside cells by using single-molecule fluorescence imaging. J Imaging. 9 (9), 183(2023).
  28. Zheng, S., Zou, M., Shao, Y., Wu, H., Wang, X. Two-dimensional measurements of receptor-ligand interactions. Front Mol Biosci. 10, 1075587(2023).
  29. Zlotnikov, I. D., Kudryashova, E. V. Computer simulation of the receptor-ligand interactions of mannose receptor CD206 in comparison with the lectin concanavalin A model. Biochemistry (Moscow). 87 (1), 54-69 (2022).
  30. Fu, Y., Zhao, J., Chen, Z. Insights into the molecular mechanisms of protein-ligand interactions by molecular docking and molecular dynamics simulation: A case of oligopeptide binding protein. Comput Math Methods Med. 2018, 7604567(2018).
  31. Farina, B., et al. A novel approach for studying receptor-ligand interactions on living cells' surface by using NUS/T1ρ-NMR methodologies combined with computational techniques: The RGDechi15D-αvβ5 integrin complex. Comput Struct Biotechnol J. 19, 3303-3318 (2021).
  32. Driessen, N. N., et al. Role of phosphatidylinositol mannosides in the interaction between mycobacteria and DC-SIGN. Infect Immun. 77 (10), 4538-4547 (2009).
  33. Bansal, K., et al. Src homology 3-interacting domain of Rv1917c of Mycobacterium tuberculosis induces selective maturation of human dendritic cells by regulating PI3K-MAPK-NF-κB signaling and drives Th2 immune responses. J Biol Chem. 285 (47), 36511-36522 (2010).
  34. Xu, Y., et al. PPE57 induces activation of macrophages and drives Th1-type immune responses through TLR2. J Mol Med. 93 (6), 645-662 (2015).
  35. Olesen, R., et al. DC-SIGN (CD209), pentraxin 3 and vitamin D receptor gene variants associate with pulmonary tuberculosis risk in West Africans. Genes Immun. 8, 456-467 (2007).
  36. Berger, S. B., et al. SLAM is a microbial sensor that regulates bacterial phagosome functions in macrophages. Nat Immunol. 11 (10), 920-927 (2010).
  37. Degos, C., et al. Omp25-dependent engagement of SLAMF1 by Brucella abortus in dendritic cells limits acute inflammation and favours bacterial persistence in vivo. Cell Microbiol. 22 (4), e13156(2020).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

SLAMF1

Похожие статьи