Method Article

Плагин Micro-Manager с открытым исходным кодом для визуализации флуоресцентных диполей в режиме реального времени

DOI:

10.3791/67755

⸱

March 14th, 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1College of Engineering, Eastern Institute of Technology, 2Department of Biomedical Engineering, College of Future Technology, Peking University, 3National Biomedical Imaging Center, Peking University, 4Zhejiang Provincial Engineering Research Center for Organelles Diagnostics and Therapy

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы разработали плагин Micro-Manager с открытым исходным кодом, который позволяет наблюдать флуоресцентные диполи в режиме реального времени на микроскопе со структурированным освещением. Плагин поддерживает наблюдение как 2D, так и 3D ориентации диполя.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Флуоресцентная поляризационная микроскопия (ФПМ) позволяет получить изображение положения и дипольной ориентации флуорофоров. Несмотря на достижения флуоресцентной поляризационной микроскопии со сверхвысоким разрешением, их зависимость от пострегистрации затрудняет наблюдение в реальном времени. Микроскопия с поляризованным структурированным освещением (pSIM) обеспечивает визуализацию флуоресцентных диполей со сверхвысоким разрешением и высокой скоростью визуализации и хорошо подходит для применения с живыми клетками. Мы разработали реализацию с открытым исходным кодом для реконструкции поляризационных изображений в реальном времени и отображения флуоресцентных диполей. Кроме того, мы расширили метод для достижения 3D-картографирования ориентации (3DOM), расширив его полезность для сложных биологических исследований. Кроме того, мы представили подробное введение в расширение существующего SIM-микроскопа для поляризационной визуализации и предоставили подробное руководство по настройке Micro-Manager 2.0 для управления микроскопом, позволяющего просматривать поляризационную визуализацию в режиме реального времени. Кроме того, мы предоставили код MATLAB для полной реконструкции, охватывающий как pSIM, так и 3DOM. Это всеобъемлющее руководство призвано помочь новичкам быстро освоить и легко приступить к работе.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Флуоресцентная поляризационная микроскопия (ФПМ) стала мощным методом одновременной визуализации положения и дипольной ориентации флуорофоров, предлагая глубокое понимание биологическойвизуализации. Облегчая наблюдение за ориентацией биомолекул, FPM раскрывает сложное расположение макромолекул, таких как актин 3,4,5, микротрубочки5, септин6, филаментДНК 7-9, комплекс ядерных пор10 и мембранные белки11. Его высокоскоростные, неинвазивные и совместимые с живыми клетками возможности позволяют отслеживать динамику вращения молекул с высоким временным разрешением11,12. При интеграции с биосиловыми зондами, FPM не только отображает величины сил с субклеточным разрешением, но и измеряет направления сил, тем самым улучшая наше понимание биомеханических процессов, выявляя направление сил13.

В последние десятилетия флуоресцентная поляризационная микроскопия со сверхвысоким разрешением претерпела стремительную эволюцию. Заметным достижением в этой области является одномолекулярная ориентационная микроскопия, также называемая SMOLM, которая может локализовать как положение, так и ориентацию флуорофоров, тем самым обеспечивая многомерную локализацию. Измерение поляризации в SMOLM может быть выполнено с использованием модуляции поляризационного возбуждения7, многоканального поляризационного детектирования3 или спроектированной функции поляризационного чувствительного рассеяния точки (PSF)14. Несмотря на то, что SMOLM достигает пространственного разрешения порядка десятков нанометров и измеряет поляризацию отдельных молекул, он страдает от длительного времени визуализации. Это связано с повторяющимися циклами мигания и локализации флуорофора, что создает проблему для визуализации со скоростью видео и приложений с живыми клетками.

В отличие от этого, поляризованная микроскопия структурированного освещения (pSIM) обеспечивает пространственное разрешение примерно до 100 нм в сочетании с получением поляризационной информации с помощью того же набора данных SIM. Примечательно, что pSIM может достигать скорости визуализации со скоростью видео и хорошо совместим с визуализацией живых клеток, без строгих требований к флуоресцентным молекулам. Недавно с помощью pSIM была успешно выявлена структура актинового кольца в мембраноассоциированном периодическом скелете (МПС)5 и получено картирование биологических сил со сверхвысоким разрешением13.

Тем не менее, pSIM требует реконструкции изображения после захвата, что препятствует визуализации результатов поляризации в режиме реального времени. Эта задержка препятствует непосредственному наблюдению за биологическими явлениями, не позволяя исследователям быстро фиксировать интересующие биологические явления и вносить корректировки в образцы и условия визуализации в режиме реального времени. Чтобы обойти это ограничение, мы разработали реализацию с открытым исходным кодом, которая облегчает получение изображений, реконструкцию и отображение результатов поляризации в режиме реального времени на основе платформы ImageJ и Micro-Manager (https://github.com/KarlZhanghao/live-pol-imaging).

Кроме того, в то время как pSIM была ограничена предоставлением двухмерной поляризационной информации в плоскости, мы недавно расширили ее возможности для достижения 3D-отображения ориентации с использованием почти того жеоборудования15, что называется 3D-отображением ориентации (3DOM). Это программное обеспечение с открытым исходным кодом также обеспечивает управление, реконструкцию и визуализацию 3DOM. Модули реконструкции и визуализации также совместимы с приложением для отслеживания ориентации одной молекулы. Все эти функциональные возможности повышают полезность поляризационной визуализации в сложных биологических исследованиях.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Расширение существующего микроскопа со структурированным освещением для поляризационной визуализации

  1. Подготовьте SIM-микроскоп.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мы предполагаем, что читатели имеют определенные знания в настройке микроскопа и уже владеют структурированным световым микроскопом. Если у вас нет соответствующего опыта, обратитесь к этой статье, в которой представлено подробное описание того, как построить микроскоп SIM16. Блок управления поляризацией "HWP+WQP+LCVR" может быть заменен на вихревую волновую пластину для пиццы в нашем pSIM work5 или полуволновую пластину для пиццы17.
  2. Измерение коэффициентов затухания поляризации трех направлений полос путем загрузки различных шаблонов на пространственный модулятор света (SLM). Поместите и поверните поляризатор сразу после объектива и используйте измеритель мощности для измерения мощности лазера. Для pSIM вращайте волновую пластину, чтобы поддерживать s-поляризацию в трех направлениях с коэффициентом затухания > 10.
  3. Для 3DOM поверните HWP2, чтобы сохранить p-поляризацию в шести направлениях. Замените пространственную маску SIM на пространственную маску 3DOM, чтобы пропускать лучи 1-го порядка шести направлений (см. рис. 1B).
    ПРИМЕЧАНИЕ: s-поляризация требуется в pSIM, в то время как p-поляризация требуется в 3DOM. Подробная настройка включена в другие статьи для pSIM5 и 3DOM15.

2. Настройка Micro-Manager

  1. Скачайте версию Micro-Manager 2.0 с официального сайта, установите программное обеспечение, следуя инструкции.
  2. Подготовьте соответствующие драйверы устройств и программное обеспечение для успешного подключения к системе Micro-Manager. В этой системе микроскопа используйте Micro-Manager для управления камерой, трансляционным столиком, лазером, платой сбора данных и микроскопом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поддерживаемые инструменты перечислены в https://micro-manager.org/Device_Support. Подробную информацию о подключаемых инструментах см. в Таблице материалов . Установите драйверы или официальное/вспомогательное программное обеспечение и подключите прибор к компьютеру с помощью USB-кабеля.
  3. Добавьте инструменты в Micro-Manager с помощью мастера настройки оборудования.
    1. Откройте программу и выберите «Нет» в первоначальном раскрывающемся списке.
    2. Выбор устройств | Мастер настройки оборудования... | Создайте новую конфигурацию и нажмите кнопку Далее, чтобы перейти на страницу конфигурации.
    3. Найдите плагин Camera / Laser / Stage / DAQ/ microscope в выпадающем списке оборудования и нажмите Add | ОК | Далее.
    4. Перейдите в раздел Выбор устройств по умолчанию и выберите настройку автоматического спуска затвора. Установите параметры Камера по умолчанию, Затвор по умолчанию и Область фокусировки по умолчанию. Нажимайте кнопку Далее , пока не будет достигнута опция Сохранить конфигурацию и выход , и сохраните имя файла конфигурации. Нажмите кнопку Готово.
  4. Общие настройки шаблона
    1. Сохраните шаблон для режима реального времени и режима привязки SIM-карты.
    2. Установите время экспозиции и режим срабатывания следующим образом: выберите Группу «+» в настройках конфигурации, назовите название группы «Режим», выберите Режим экспозиции и триггера, нажмите OK.
    3. Выберите пресет «+», чтобы добавить разные пресеты для группы «Режим». Назовите одну предустановку «live» для настроек экспозиции в режиме реального времени, а другую «SIM» для режима SIM. Например, в режиме «live» установите время экспозиции 15 мс, а в режиме привязки к SIM-карте установите время экспозиции 10 мс, а режим запуска — Standard (Overlap).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Файл конфигурации (MMConfig_psim_demo.cfg) включен в наш репозиторий кода, который может быть загружен непосредственно из Micro-Manager 2.0.

3. Калибровка системы с помощью флуоресцентных шариков

  1. Погрузите покровные стекла в 75% этанол, промойте их 3 раза деионизированной водой (ddH2O) и высушите.
  2. Нанесите вихревой слой флуоресцентных шариков с длиной волны 100 нм (разбавленных до 1:1000 фосфатно-солевым буфером [PBS]) и нанесите суспензию пипеткой непосредственно на покровные стекла. Выдерживать 5-10 минут в темноте, затем аккуратно промыть PBS.
  3. Добавьте 20 μL монтажного материала на предметное стекло микроскопа и расположите покровное стекло над ним, следя за тем, чтобы на нем не было пузырей. Поддерживайте температуру на уровне 4 °C и держите предметное стекло в темноте, чтобы предметное стекло с флуоресцентными шариками 100 нм было подготовлено к калибровке системы.
  4. Для pSIM получите три изображения трех различных фаз флуоресцентных шариков. Пользовательский код MATLAB (Bead_calib.m) принимает изображения в качестве входных данных и выводит два калибровочных изображения (calib1.tif, calib2.tif) для дальнейшего анализа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Как было показано ранее5, эксперимент с pSIM может быть выполнен на большинстве коммерческих систем. Как на домашних, так и на коммерческих SIM-микроскопах требуется калибровка системы, чтобы устранить погрешность измерения флуоресцентных диполей, вызванную неравномерным освещением в трех направлениях диаграммы направленности. Эксперимент по калибровке предполагает изотропную поляризацию флуоресцентных шариков и требует только необработанных изображений во время получения SIM-карты. Подробная процедура калибровки включена в нашу оригинальную работу5. Для реконструкции pSIM требуется вывод двух калибровочных изображений calib1.tif и calib2.tif, которые указывают на пиксельную энергию освещения направления паттерна 2; 3 относится к направлению паттерна 1.

4. Пробоподготовка: актин в неподвижных клетках

  1. Погрузите покровные стекла в 75% этанол, промойте их 3 раза с ddH2O. Поместите покровные стекла в шестилуночный планшет для культивирования клеток.
  2. Культивируйте клетки U2OS (клеточная линия ATCC HTB-96) в модифицированной среде Dulbecco Eagle's Medium (DMEM) с добавлением 10% (v/v) фетальной сыворотки крупного рогатого скота (FBS) при 37 °C и 5%CO2 на покровных листах до тех пор, пока они не достигнут примерно 75% конфлюенции.
  3. Аккуратно промойте ячейки 3 раза с PBS. Для фиксации клеток нанесите 4% параформальдегид на 15 минут при комнатной температуре. После фиксации снова промойте клетки 3 раза PBS.
  4. Для повышения проницаемости мембраны обработайте клетки 0,1% Triton X-100 в PBS в течение 5 минут, затем промойте клетки PBS 3 раза.
  5. Флуоресцентный фаллоидин растворить в 150 мкл ДМСО для получения стокового раствора (66 мкМ). Приготовьте рабочий раствор красителя фаллоидина, разбавив 5 мкл стокового раствора в 995 мкл PBS. Инкубируйте клетки в темноте с рабочим раствором красителя фаллоидина при комнатной температуре в течение ~1 ч. Промойте клетки в течение 3 х 3 минут с помощью PBS.
  6. Добавьте 20 μл монтажной среды на предметное стекло микроскопа. Аккуратно поместите покровное стекло на предметное стекло без образования пузырей. Храните предметное стекло при температуре 4 °C и храните его в темном месте.

5. Подготовка образца: λ-ДНК in vitro

  1. Растворите 0,5 г полиметилметакрилата в 10 мл материала основы зубных протезов. После тщательного растворения равномерно нанесите раствор на поверхность предметного стекла, а затем дождитесь, пока он испарится для образования пленки.
  2. Разведите 0,3 мкл λ-ДНК и 32 мкл 1000-кратного окрашивания оранжевых нуклеиновых кислот SYTOX в 968 мкл PBS. Добавьте в предметное стекло 1 мкл приготовленного раствора и дайте ему высохнуть.
  3. Запечатайте покровное стекло на предметном стекле с помощью крепежа для защиты и сохранности образца. Храните предметное стекло при температуре 4 °C в темноте.

6. Визуализация

  1. Поместите покровное стекло на держатель образца и отрегулируйте его по фокальной плоскости в режиме реального времени. Выберите ROI 512 x 512 пикселей и отрегулируйте время экспозиции и интенсивность лазера.
  2. Откройте независимое управляющее программное обеспечение пространственного модулятора света и выберите подходящий путь последовательности светового шаблона для pSIM/3DOM или живого режима.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для pSIM диаграмма направленности включает в себя три различных угла поляризации и три разные фазы. Для 3DOM диаграмма направленности включает в себя шесть различных поляризационных углов.
  3. Выберите режим съемки SIM-карты , выберите Multi-D Acq., выберите временные точки и установите количество (9 или 6 изображений для pSIM или 3DOM) и интервал (0 мс) в открытом окне. Нажмите «Приобрести»!
  4. Нажмите на TriggerSLM.bsh (файл конфигурации включен в наш репозиторий кода), карта сбора данных MyDaq активирует пространственный модулятор света для съемки.

7. Live-view плагин для pSIM и 3DOM

  1. Настройте FakeCamera и путь доступа к изображению: загрузите скрипт (MMConfig_FakeCam_demo.cfg), нажав на Устройства | Загрузить конфигурацию оборудования.... Настройка локального каталога образов в разделе Устройства | Браузер свойств устройств... | Маска Camera-Path (рис. 2A-C).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Часть скрипта, связанная с получением, зависит от настройки оборудования, поэтому мы предоставили версию (MMConfig_FakeCam_demo.cfg) с использованием устройства FakeCamera для чтения локальных изображений на жестком диске для демонстрации. Пользователи могут вносить изменения в нашей версии. Не забудьте изменить путь чтения изображения (маска Camera-Path).
  2. Установите панель быстрого доступа, нажав на Инструменты | Панель быстрого доступа | Создайте новую панель. Нажмите на значок настроек в левом нижнем углу, переместите «Запустить скрипт» в верхнюю часть, которая может загрузить «psim.bsh» и «3DOM.bsh» (Рисунок 2D).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Система Панели Быстрого Доступа позволяет пользователям создавать настраиваемые окна и легко получать доступ к элементам управления в Micro-Manager, который требуется чаще всего. Также можно добавить 'Live', 'Snap' или другие каналы, как показано на рисунке 2D.
  3. Взяв в качестве примера pSIM, выполните реконструкцию поляризационного изображения в реальном времени, нажав на 'psim.bsh'; наблюдать за изображениями, восстановленными в реальном времени, с результатами поляризации (рис. 2E). Не забудьте изменить путь к калибровочным изображениям в файле 'psim.bsh' (calibPath = "путь к файлу калибровочных изображений").
    ПРИМЕЧАНИЕ: Плагин live-view представляет собой скрипт beanshell (psim.bsh и 3DOM.bsh), который может быть запущен в панели скриптов. Плагин получает девять изображений для pSIM или шесть изображений для 3DOM и рассчитывает результаты отображения ориентации на основе изображений с широким полем. Изображения с картографированием ориентации отображаются для получения информации о поляризации в режиме реального времени, что облегчает немедленный контроль, несмотря на низкое разрешение.

8. Анализ данных с реконструкцией сверхвысокого разрешения

  1. Установите MATLAB R2019b с сайта (см. Таблицу материалов).
  2. Откройте программу; Для реконструкции pSIM получите девять изображений, состоящих из трех различных фаз для каждого из трех углов ориентации. Убедитесь, что имена девяти изображений находятся в диапазоне от '1.tif' до '9.tif', поместите их в файл с именем 'Input' и запустите программу с именем 'PSIM.m'. Наблюдайте за восстановленным широкопольным изображением, изображением SIM и изображением pSIM с помощью цветового круга.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для реконструкции pSIM необходимо выполнить два этапа: этап SIM и этап PM. Данные анализируются специально написанной программой MATLAB для упрощения отладки. Получите код восстановления из папки 'reconsr' в GitHub.
  3. Для 3DOM захватите шесть различных значений направления поляризации. Объедините шесть изображений вместе, назовите полученный файл 'Raw_data.tif' и запустите программу с именем 'Recon_3DOM.m'. Наблюдайте за восстановленным широкопольным изображением и изображением 3DOM с азимутальными результатами и результатами полярного угла.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В процессе реконструкции может возникнуть ошибка --'функция или переменная 'bfopen' не распознана'. 'bfopen' — это функция в библиотеке био-форматов, которая обычно используется для открытия и чтения файлов изображений. Введите addpath ('path_to_bioformats_toolbox') в командном окне MATLAB. Замените «path_to_bioformats_toolbox» фактическим путем к папке библиотеки. Мы также добавили зависимость Bio-Formats в репозиторий GitHub.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Метод pSIM может быть выполнен на SIM-микроскопах на основе интерференции с использованием s-поляризованных лазерных лучей. S-поляризационная интерференция является наиболее широко используемым типом SIM и генерирует высококонтрастные световые полосы. Академический прототип микроскопической установки включен в оригинальную работу pSIM5. Как вкратце показано на рисунке 1, пространственный модулятор света (SLM) генерирует дифракционные п...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В нашем исследовании мы разработали плагин, который позволяет в режиме реального времени просматривать два метода поляризационной визуализации: pSIM и 3DOM. Обе технологии могут быть реализованы в существующей SIM-системе с небольшой модификацией. Мы подробно рассказали о том, как установить микроскоп pSIM и 3DOM, а также настроить Micro-Manager для управления микроскопом и продемонстрировать, как получить результаты поляризации в режиме реального времени. Экспериментальные результаты вк...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана Национальной программой ключевых исследований и разработок Китая (2022YFC3401100).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
100 нм Флуоресцентные бусиныInvitrogenF8801
4% Раствор формальдегидаInvitrogenR37814
CameraTucsenDhyana 400BSI V3https://www.tucsen.com/download-software/
Материалы основы для зубных протезов (тип I Термофиксирующий тип, жидкий)New Century DentalN/A
Dulbecco' s Модифицированный Eagle' s MediumGibcoC11995500BT
Eclipse TE2000 Инвертированный микроскопNikonTE2000 E
Фетальная бычья сывороткаGibco10099141C
MATLAB R2019bMathWorksVersion R2019bhttps://ww2.mathworks.cn/downloads/
MetroCon V4.0KopinVersion 4.0Программное обеспечение пространственного модулятора света
Микро-менеджер 2.0; Μ anagerVersion 2.0Скачать Micro-Manager Последняя версия
MS-2000 XYZ Автоматизированный столикПрикладные научные приборыMIM3https://www.asiimaging.com/support/downloads/usb-support-on-ms-2000-wk-controllers/
myDAQNational Instruments781325-01Загрузка программного обеспечения и драйверов - NI
OBIS 561 нм LS 20 мВт лазернаякогерентная1325777
Phalloidin-AF568InvitrogenA12380
Фосфат буферизованный физиологический растворCorning21-040-CV
ПолиметилметакрилатSolarbioM9810
ProLong DiamondInvitrogenP36980
Пространственный модулятор светаKopinSXGA-12
SYTOX краситель для оранжевыхнуклеиновых кислотInvitrogenS11368
Triton X-100InvitrogenHFH10
TrypsinGibco25200056
λ-ДНКInvitrogenS11368

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zhanghao, K., Gao, J., Jin, D., Zhang, X., Xi, P. Super-resolution fluorescence polarization microscopy. J Innov Opt Health Sci. 11 (01), 1730002(2018).
  2. Alonso, M. A., Brasselet, S. Polarization microscopy: from ensemble structural imaging to single-molecule 3D orientation and localization microscopy. Optica. 10 (11), 1486-1510 (2023).
  3. Valades Cruz, C. A., et al. Quantitative nanoscale imaging of orientational order in biological filaments by polarized superresolution microscopy. Pro Natl Acad Sci USA. 113 (7), E820-E828 (2016).
  4. Zhanghao, K., et al. Super-resolution dipole orientation mapping via polarization demodulation. Light Sci Appli. 5 (10), e16166(2016).
  5. Zhanghao, K., et al. Super-resolution imaging of fluorescent dipoles via polarized structured illumination microscopy. Nat Commun. 10 (1), 4694(2019).
  6. Vrabioiu, A. M., Mitchison, T. J. Structural insights into yeast septin organization from polarized fluorescence microscopy. Nature. 443 (7110), 466-469 (2006).
  7. Backer, A. S., Lee, M. Y., Moerner, W. E. Enhanced DNA imaging using super-resolution microscopy and simultaneous single-molecule orientation measurements. Optica. 3 (6), 659-666 (2016).
  8. Backer, A. S., et al. Single-molecule polarization microscopy of DNA intercalators sheds light on the structure of S-DNA. Sci Adv. 5 (3), eaav1083(2019).
  9. Hulleman, C. N., et al. Simultaneous orientation and 3D localization microscopy with a Vortex point spread function. Nat Commun. 12 (1), 5934(2021).
  10. Kampmann, M., Atkinson, C. E., Mattheyses, A. L., Simon, S. M. Mapping the orientation of nuclear pore proteins in living cells with polarized fluorescence microscopy. Nat Struct Mol Biol. 18 (6), 643-649 (2011).
  11. Lazar, J., Bondar, A., Timr, S., Firestein, S. J. Two-photon polarization microscopy reveals protein structure and function. Nat Methods. 8 (8), 684-690 (2011).
  12. Dong, B., et al. Parallel Three-Dimensional Tracking of Quantum Rods Using Polarization-Sensitive Spectroscopic Photon Localization Microscopy. ACS Photonics. 4 (7), 1747-1752 (2017).
  13. Blanchard, A., et al. Turn-key mapping of cell receptor force orientation and magnitude using a commercial structured illumination microscope. Nat Commun. 12 (1), 4693(2021).
  14. Toprak, E., et al. Defocused orientation and position imaging (DOPI) of myosin V. Proc Natl Acad Sci USA. 103 (17), 6495-6499 (2006).
  15. Zhong, S., et al. Three-dimensional dipole orientation mapping with high temporal-spatial resolution using polarization modulation. PhotoniX. 5 (1), 12(2024).
  16. Young, L. J., Ströhl, F., Kaminski, C. F. A Guide to Structured Illumination TIRF Microscopy at High Speed with Multiple Colors. J Vis Exp. (111), e53988(2016).
  17. Huang, X., et al. long-term, super-resolution imaging with Hessian structured illumination microscopy. Nat Biotechnol. 36 (5), 451-459 (2018).
  18. Ando, R., et al. StayGold variants for molecular fusion and membrane-targeting applications. Nat Methods. 21 (4), 648-656 (2024).
  19. Hirano, M., et al. A highly photostable and bright green fluorescent protein. Nat Biotechnol. 40 (7), 1132-1142 (2022).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Fluorescence Polarization MicroscopyPolarized Structured IlluminationSuper Resolution ImagingFluorescent DipolesLive Cell ImagingMicro Manager PluginReal Time Reconstruction3D Orientation MappingPolarization ImagingMATLAB Reconstruction Code
Video Coming Soon

Related Articles