Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Модифицированный метод QuEChERS-ВЭЖХ для обнаружения полициклических ароматических углеводородов в эмбрионах рыбок данио, подвергшихся воздействию мелкодисперсных частиц

1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/67757

⸱

13 июня 2025 г.

 ,  ,  ,  , 
1Suzhou Industrial Park Center for Disease Control and Prevention, 2Suzhou Medical College of Soochow University, 3MOE Education Key Laboratory of Geriatric Diseases and Immunology

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Мы разработали модифицированный метод QuEChERS-HPLC для оценки внутренних уровней 16 ПАУ в эмбрионах рыбок данио.

Аннотация

Воздействие на матерей мелкодисперсных твердых частиц (PM2,5) с аэродинамическим диаметром 2,5 мкм или менее было связано с самопроизвольным абортом и различными врожденными заболеваниями у людей. Однако основные механизмы остаются неясными. Эмбрионы рыбок данио широко используются для изучения токсичности PM2,5 для развития, но измерение внутренних уровней полициклических ароматических углеводородов (ПАУ), основных токсичных составляющих PM2,5, представляет собой сложную задачу. В этом исследовании мы разработали метод быстрой, простой, дешевой, эффективной, прочной и безопасной высокоэффективной жидкостной хроматографии (QuEChERS-HPLC) для оценки внутренних уровней 16 ПАУ, перечисленных в списке приоритетных загрязнителей Агентства по охране окружающей среды США (EPA). Эмбрионы рыбок данио обрабатывали экстрагируемым органическим веществом (ЭОМ) из PM2,5 в течение 2-72 ч после оплодотворения (HPF). Для пробоподготовки был использован метод QuEChERS, а для качественного и количественного анализа ПАУ — HPLC-FLD/DAD (ВЭЖХ с флуоресцентным детектором и детектором диодной матрицы). Мы успешно обнаружили шесть ПАУ (фенантрен, антрацен, флуорен, аценафтен, флуорантен и пирен) в эмбрионах рыбок данио, подвергшихся воздействию PM2,5. Этот метод имеет решающее значение для изучения механизмов токсичности, вызванной PM2,5 для развития.

Введение

Мелкодисперсные твердые частицы (PM2,5) с аэродинамическим диаметром не более 2,5 мкм. является ведущим фактором экологического риска. Благодаря своим небольшим размерам PM2,5 способен проникать в систему кровообращения и проникать через материнско-фетальный барьер. Эпидемиологические исследования связывают воздействие PM2,5 на матерей с самопроизвольным абортом и различными врожденными заболеваниями 1,2,3,4. Тем не менее, основные механизмы эмбриональной токсичности PM2,5 недостаточно изучены. ПАУ, основной токсичный компонент PM2,5, высокотоксичны для человека благодаря своим мутагенным и канцерогенным свойствам 5,6. Из сотен ПАУ 16 были отнесены Агентством по охране окружающей среды США к высокоприоритетным загрязнителям.

Данио рерио, Danio rerio, является мощным позвоночным модельным организмом благодаря своему генетическому сходству с человеком, быстрому развитию, высокой репродуктивной способности и простоте обслуживания. Прозрачность эмбрионов рыбок данио позволяет непосредственно наблюдать за всем телом под микроскопом, что позволяет проводить детальные исследования. Растворенные ПАУ могут проникать в эмбрионы рыбок данио путем диффузии7. Во многих исследованиях использовались эмбрионы рыбок данио для изучения токсических эффектов и механизмов извлечения органического вещества (ЭОМ) из PM2,5 8,9,10,11. Тем не менее, большинство из этих исследований характеризовали только 16 приоритетных ПАУ в ЭОМ, не обнаруживая внутренние уровни ПАУ в эмбрионах рыбок данио. Эта проблема может быть связана с небольшим размером эмбрионов рыбок данио и сложностью эмбрионального матрикса.

Метод «Быстрый, простой, дешевый, эффективный, прочный и безопасный» (QuEChERS) представляет собой инновационную методику пробоподготовки, используемую для анализа остатков пестицидов, ветеринарных препаратов и других загрязняющих веществ в пробах пищевых продуктов и окружающей среды13,14. В сочетании с высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ) этот метод был использован для обнаружения пестицидов у рыбокданио-15. ПАУ, которые содержат два или более бензольных кольца, обладают сильными флуоресцентными свойствами, что делает их особенно подходящими для обнаружения с помощью флуоресцентных детекторов. В этом исследовании мы разработали модифицированный метод QuEChERS-ВЭЖХ для оценки уровней 16 ПАУ в эмбрионах рыбок данио, подвергшихся воздействию ЭОМ.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Обработка образца

  1. Коллекция PM2.5
    1. Собирают PM2,5 на 47 мм кварцевых мембранных фильтрах.
      ПРИМЕЧАНИЕ: PM2.5 был собран в городе Сучжоу, Китай.
  2. Извлечение EOM
    1. Разрежьте фильтр на кусочки и поместите в коническую стеклянную колбу со 150 мл ацетонитрила.
    2. Ультразвуковое воздействие на колбу при 35 °C в течение 1 ч и перенос экстракта в четыре пробирки объемом 50 мл.
    3. Центрифугируйте при 7 000 × г в течение 20 минут, затем перенесите надосадочную жидкость в ротационный испаритель и сконцентрируйте ее примерно до 5 мл.
    4. Выпарить до сухости под потоком азота на водяной бане при температуре 35 °C и растворить остаток в диметилсульфоксиде (ДМСО).
  3. Лечение эмбрионов данио-рерио
    1. Поддерживайте рыбок данио в системе рециркуляции воды в течение 14 часов в светлом и 10 часов в темное время суток при температуре 28 °C16.
    2. Соберите оплодотворенные яйца (200 эмбрионов в группе) и перенесите их в стеклянные чашки Петри (натриево-известковое стекло, 80 х 15 мм) с 30 мл воды из системы оборотного водоснабжения.
    3. Добавьте 30 μL EOM (10 мг/мл) в стеклянную чашку Петри, содержащую 200 эмбрионов, через 2 ч после оплодотворения (HPF). Необработанные группы служат пустыми элементами управления.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Конечная концентрация ЭОМН составляет 10 мг/л, исходя из частоты сердечных пороков развития (дополнительный рисунок S1).
    4. Поместите посуду в инкубатор с температурой 28 °C.

2. Пробоподготовка QuEChERS

  1. Достаньте из инкубатора посуду с зародышами при 72 л.с. Промойте эмбрионы 3 раза чистой водой.
  2. Перенесите эмбрионы в пробирки объемом 1,5 мл (в соответствии с разными группами) и удалите лишнюю воду.
  3. Поместите пробирки в морозильную камеру при температуре -80 °C на 30 минут, чтобы лиофилизировать эмбирос17 и лиофилизировать их. Затем измельчите зародыши с помощью стеклянного стержня.
  4. Добавьте 25 мкл смешанного стандартного раствора 16 ПАУ (2,0 мкг/мл) в контрольную группу ДМСО для проверки восстановления спайков.
  5. Добавьте 1 мл н-гексана и вортексируйте в течение 30 с, затем ультразвукируйте при 35 °C в течение 30 минут.
  6. Центрифугируйте при 7 000 × г в течение 5 минут и перелейте надосадочную жидкость в свежую пробирку.
  7. Повторите шаги 2.5 и 2.6.
  8. Собранные надосадочные жидкости выпарить до сухости под потоком азота на водяной бане при температуре 35 °С.
  9. Добавьте 1 мл ацетонитрила и вортекс на 30 с.
  10. Добавьте 10 мг первичного вторичного амина (ПСА), 45 мг сульфата магния и 15 мг упаковки C18, затем перемешайте в течение 30 секунд.
  11. Центрифугируйте при 7 000 × г в течение 5 минут и переложите надосадочную жидкость в свежую пробирку.
  12. Повторите шаг 2.9 и центрифугируйте при 7 000 × г в течение 5 минут. Переложите надосадочную жидкость в свежую трубку.
  13. Выпарить надосадочную жидкость до 0,5 мл под азотом.
  14. Фильтруйте через микропористую мембрану толщиной 0,22 мкм.

3. Определение ПАУ с помощью ВЭЖХ

  1. Приготовьте серию рабочих растворов (в диапазоне от 1 до 500 нг/мл) для стандарта 16 ПАУ, смешанного с ацетонитрилом, и введите их в жидкостный хроматограф с использованием ацетонитрила/воды в качестве подвижной фазы.
    1. Введите 20 μл и используйте следующую процедуру элюирования: 0-18,5 мин, от 40% ацетонитрила до 100% ацетонитрила; 18,5-28 мин, 100% ацетонитрил; 28-29,5 мин, от 100% до 40% ацетонитрила; время остановки: 32 мин; температура столба: 25 °C; расход: 1,8 мл/мин. Постройте стандартную кривую с массовыми концентрациями стандартных рабочих растворов по оси x и соответствующими пиковыми площадями по оси y, охватывающую диапазон от 5 нг/мл до 500 нг/мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Длины волн возбуждения/излучения ПАУ можно найти в Дополнительной таблице S1.
  2. Введите очищенный образец (из шага 2.14.) в жидкостный хроматограф с помощью флуоресцентного детектора (FLD) и детектора диодной матрицы (DAD).
  3. Определите наличие ПАУ путем сравнения времени удержания и измерьте связанные с ними пиковые площади.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Массовые концентрации ПАУ определяли с использованием ранее построенной стандартной кривой на шаге 3.1.1.
  4. Рассчитайте внутренние концентрации 16 ПАУ на основе измеренных массовых концентраций образцов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Вся процедура воздействия ЭОМ, подготовки образцов и обнаружения ЛАГ проиллюстрирована на рисунке 1. Для ВЭЖХ-ГРИПП/ДАД приемлемым было признано соотношение сигнал/шум 3:1 с диапазоном обнаружения от 0,3 до 5,0 нг/мл. Пределы метода обнаружения варьировали от 3,0 × 10-4 до 5,0 × 10-3 нг/организм. Все калибровочные кривые показали высокую линейность (r2 > 0,999). Значения точности, определенные с помощью экстрактов, полученных из матричных образцов, состави...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Эмбрионы рыбок данио являются мощной моделью позвоночных для исследований токсичности для развития, но их небольшой размер затрудняет обнаружение полулетучих органических соединений (УВО), таких как ПАУ. Во время подготовки образцов решающее значение имеет предотвращение заражения эмбрионов рыбок данио. Надлежащая очистка образцов является ключевым шагом, позволяющим избежать переноса соединений из среды воздействия в экстракт образца. Неполная промывка может привести к завышенной оценке...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Эта работа была финансово поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (номер гранта: 81972999) и Планом развития науки и технологий Сучжоу (Фундаментальные исследования по медицинскому применению, SKY2023036 и SKY2023115).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
16 смешанных стандартных растворов ПАУ o2si Smart Solutions (Южная Каролина, США)110124-0616 ПАУ смешанные стандартные растворы  включает нафталин (Nap), аценафтилен (Acy), аце-нафтен (Ace), флуорен (Flo), фенантрен (Phe), антрацен (Ant), флуорантен (Flu), пирен (Pyr), бензо[a] антрацен (BaA), хризен (Chr), бензо[b] флуорантен (BbF), бензо[k] флуорантен (BkF), бензо[a] пирен (BaP), индено [1,2,3-cd] пирен (IcdP), дибенз [a, h]антрацен (DahA), бензо [g,h,i] перилен (BghiP).
1260 Infinity II LC SystemAgilent Technologies (Санта-Клара, США)FLD(G1321A); DAD SL (G1315C)
АцетонитрилScharlab (Барселона, Испания)AC03661000растворитель
CNWBOND HC-C18 SPE ANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) Inc. (Шанхай, КИТАЙ)SBEQ-CA0801C18 представляет собой обратнофазную насадку с хорошим балансом между гидрофильными и гидрофобными, которая может хорошо адсорбировать и разделять полярные и неполярные органические соединения.
Диатомовая земляAgilent Technologies, Inc (Санта-Клара, США)12214013Для разделения, очистки и удаления органических примесей‌
Дисперсионный SPE 15 мл, ENAgilent Technologies, Inc (Санта-Клара, США)5982-5056Фильтр для очистки проб
ANPEL Laboratory Technologies (Шанхай) Inc. (Шанхай, КИТАЙ)SCAA-104Игольчатый фильтр с органической фазой (нейлон), 0,22 и микро; m
HexaneScharlab (Барселона, Испания)HE02481000растворитель
MilliporeMerck (Нью-Джерси, США)Приготовление сверхчистой воды
Organomation - N-EVAP Nitrogen EvaporatorsOrganomation (Массачусетс, США)Выпариваниерастворителей
Sorvall ST4 Plus ThermoFisher Scientific (Waltham, США)центрифугирование
  Vortex- Genie 2 (G560E)Scientific Industries (Нью-Йорк, США)Vortex
ZORBAX Eclipse PAH AgilentTechnologies, Inc (Санта-Клара, США)959990-918Эта колонка обычно используется в системах ВЭЖХ для достижения точного и надежного анализа ПАУ.

Ссылки

  1. Wang, H., et al. Association of maternal exposure to ambient particulate pollution with incident spontaneous pregnancy loss. Ecotoxicol Environ Saf. 224, 112653(2021).
  2. Grippo, A., et al. Air pollution exposure during pregnancy and spontaneous abortion and stillbirth. Rev Environ Health. 33 (3), 247-264 (2018).
  3. Tanner, J. P., et al. Associations between exposure to ambient benzene and pm2. 5 during pregnancy and the risk of selected birth defects in offspring. Environ Res. 142, 345-353 (2015).
  4. Feng, Y., et al. Global air pollution exposure and congenital anomalies: An updated systematic review and meta-analysis of epidemiological studies. Int J Environ Health Res. 34 (5), 2333-2352 (2024).
  5. Lin, Y., et al. Sources, transformation, and health implications of pahs and their nitrated, hydroxylated, and oxygenated derivatives in PM2.5 in Beijing. J Geophys Res-Atmos. 120 (14), 7219-7228 (2015).
  6. Chen, Y., et al. Determining priority sources of PM2.5-bound polycyclic aromatic hydrocarbons by their contribution to disability adjusted life years. Atmos Environ. 248, 118202(2021).
  7. Carls, M. G., et al. Fish embryos are damaged by dissolved pahs, not oil particles. Aquat Toxicol. 88 (2), 121-127 (2008).
  8. He, Y., et al. Developmental toxicity of the organic fraction from hydraulic fracturing flowback and produced waters to early life stages of zebrafish (Danio rerio). Environ Sci Technol. 52 (6), 3820-3830 (2018).
  9. Ren, F., et al. AHR-mediated ROS production contributes to the cardiac developmental toxicity of PM2.5 in zebrafish embryos. Sci Total Environ. 719, 135097(2020).
  10. Manjunatha, B., Deekshitha, B., Seo, E., Kim, J., Lee, S. J. Developmental toxicity induced by particulate matter (PM2.5) in zebrafish (Danio rerio) model. Aquat Toxicol. 238, 105928(2021).
  11. Chen, J., Zhang, M., Aniagu, S., Jiang, Y., Chen, T. PM2.5 induces cardiac defects via AHR-SIRT1-PGC-1α mediated mitochondrial damage. Environ Toxicol Pharmacol. 106, 104393(2024).
  12. Zhang, H., et al. Crosstalk between AHR and Wnt/β-catenin signal pathways in the cardiac developmental toxicity of PM2.5 in zebrafish embryos. Toxicology. 355, 31-38 (2016).
  13. González-Curbelo, M., et al. Evolution and applications of the QuECHERS method. TrAC Trends Anal Chem. 71, 169-185 (2015).
  14. Wilkowska, A., Biziuk, M. Determination of pesticide residues in food matrices using the qQuECHERS methodology. Food Chem. 125 (3), 803-812 (2011).
  15. Zhao, C., et al. Acute toxicity and bioconcentration of pyrimorph in zebrafish, Brachydanio rerio. Pest Manag Sci. 67 (9), 1178-1183 (2011).
  16. Aleström, P., et al. Zebrafish: Housing and husbandry recommendations. Lab Anim. 54 (3), 213-224 (2019).
  17. Matthews, M., Varga, Z. M. Anesthesia and euthanasia in zebrafish. ILAR J. 53 (2), 192-204 (2012).
  18. Ji, C., et al. AHR-mediated m6A RNA methylation contributes to PM2.5-induced cardiac malformations in zebrafish larvae. J Hazard Mater. 457, 131749(2023).
  19. Alegbeleye, O. O., Opeolu, B. O., Jackson, V. A. Polycyclic aromatic hydrocarbons: A critical review of environmental occurrence and bioremediation. Environ Manage. 60 (4), 758-783 (2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Детекция ПАУподготовка пробфлуоресцентный детектордиодно-матричный детекторэкстрагируемое органическое веществотоксичность для развития
Модифицированный метод QuEChERS-ВЭЖХ для обнаружения полициклических ароматических углеводородов в эмбрионах рыбок данио, подвергшихся воздействию мелкодисперсных частиц
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.