Method Article

Высокопроизводительный метод наблюдения за фенотипами подвижности у Pseudomonas aeruginosa

DOI:

10.3791/67761

⸱

June 20th, 2025

 , 
1Département de biologie, Faculté des sciences, Université de Sherbrooke

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол представляет собой быстрый и эффективный метод идентификации генетических факторов, участвующих в различных типах движений у Pseudomonas aeruginosa.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Двигательное поведение часто играет важную роль в способности бактерии использовать ресурсы, доступные в окружающей среде. Это особенно верно для универсального патогена Pseudomonas aeruginosa, который может проявлять различные типы движений, включая роение и подергивание, которые являются важными патогенными признаками, способствующими колонизации поверхности, образованию биопленки и уклонению от защитных сил хозяина. В данной рукописи представлен протокол высокопроизводительной моторики для изучения двигательного поведения P. aeruginosa. Протокол позволяет одновременно тестировать несколько штаммов P. aeruginosa из полногеномной библиотеки мутантов, например, для выявления и анализа генетических факторов, участвующих в его подвижности. Этот подход дает возможность всесторонне изучить моторику и получить представление о молекулярных механизмах, лежащих в основе моторики P. aeruginosa . Описанный здесь протокол также может быть модифицирован для учета различных типов анализов подвижности, а также других видов бактерий, что обеспечивает мощную платформу для улучшения понимания поведения бактерий в различных контекстах.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pseudomonas aeruginosa является условно-патогенным микроорганизмом, который может колонизировать различные среды обитания благодаря своей замечательной метаболической универсальности 1,2. Эта универсальность имеет решающее значение для перехода от планктонного способа роста к биопленкам, что способствует его способности процветать в широком спектре ниш, начиная от воды и заканчивая человеческим телом 3,4,5. Переходу между этими способами роста способствует обширная способность передвигаться в этих средах с использованием различных типов подвижности, включая плавание, роениеи подергивание. Каждый тип подвижности опосредован различными механизмами и клеточными структурами и позволяет P. aeruginosa реагировать на сигналы окружающей среды 7,8. Плавательная подвижность приводится в движение одним полярным жгутиком и используется для продвижения через жидкие среды к питательным веществам, например,9. Роевая подвижность представляет собой скоординированное движение, которому способствует образование жгутиков и биоповерхностно-активных веществ, и позволяет колониям распространяться по полутвердым поверхностям10,11. Наконец, подергивающаяся моторика не зависит от жгутиков. Вместо этого подергивание опосредовано пили IV типа (T4P) и используется для перемещения по поверхности12,13. Подергивающаяся подвижность также способствует ранним этапам формирования биопленки P. aeruginosa, обеспечивая первоначальное прикрепление к поверхности. После первоначального прикрепления подергивание позволяет бактериям перемещаться по поверхностям и создавать микроколонии, которые затем могут развиваться в зрелые биопленки 1,4,13.

Традиционно анализы бактериальной подвижности проводятся индивидуально, по одному штамму за раз, на мягкой агаровой пластине или с использованием методов микроскопии 6,14,15. Полутвердые среды уже много лет используются для изучения подвижности бактерий. В настоящее время эти методы все еще используются для определения фенотипов подвижности у бактерий. Например, традиционно подвижность роения наблюдают путем инокуляции 2,5 мкл культуры P. aeruginosa в центр чашки Петри, содержащей среду М9 в концентрации 0,5%-0,8% агара16. Подергивающую подвижность обычно измеряют путем изучения распространения бактерий на поверхности раздела между агаром (на уровне 1%) и основанием чашки Петри после того, как укол инокулирует P. aeruginosa через питательную среду. Большой ореол расширения интерстициальной колонии получается после 48 ч инкубации, в то время как недергающиеся штаммы не образуют такой зоны расширения колонии 1,17,18.

В последнее время с помощью подходов к мутагенезу транспозонов были обнаружены новые гены, участвующие в подвижности или образовании биопленки у P. aeruginosa 19,20,21. Например, новые гены, участвующие в подергивающейся подвижности, были обнаружены с использованием библиотеки мутантных транспозонов высокой плотности у P. aeruginosa19. Еще одним полезным инструментом в функциональной геномике является использование упорядоченных мутантных коллекций22,23. Коллекция Keio24, содержащая делеции одного гена для всех несущественных генов Escherichia coli, является, вероятно, самой известной коллекцией мутантов и использовалась для определения генов, влияющих на различные фенотипы от роста в различных средах25 до морфологии клеток26 и более. Такие коллекции также доступны для Salmonella enterica serovar Typhimurium27, Bacillus subtilis28, P. aeruginosa29 и многих других видов. Эти коллекции также хорошо подходят для изучения подвижности в масштабах всего генома, что привело к разработке высокопроизводительного метода изучения подвижности P. aeruginosa. Здесь метод был протестирован путем оценки вклада мутантов P. aeruginosa как в подергивание, так и в роевую подвижность на пластинах с высокой плотностью. Этот высокопроизводительный метод может быть использован для различных фенотипов подвижности, а также подходит для изучения подвижности других бактерий.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ПРИМЕЧАНИЕ: Общий рабочий процесс этой процедуры представлен на рисунке 1.

figure-protocol-1
Рисунок 1: Рабочий процесс эксперимента. (1) Подготовьте необходимое количество сред подвижности на основе типа подвижности, представляющей интерес в экспериментах. (2) Используя ручную или автоматизированную систему репликаторов, подготовить исходные исходные исходные планшеты для мутантной библиотеки транспозонов P . aeruginosa из коллекции мутантов с соответствующей плотностью, уделяя особое внимание точности и равномерному инокуляции по всем лункам планшетов. (3) Перенос образцов с исходных пластин мутантной коллекции на пластины подвижности. (4) После инкубации наблюдайте и анализируйте фенотипы подвижности и определяйте гены, участвующие в интересующей вас подвижности, используя высококачественные изображения. (5) Проведение традиционных тестов подвижности для подтверждения попаданий, выявленных в ходе экспериментов с высокопроизводительной подвижностью. Создано с помощью BioRender. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Роящиеся пластины - M9 mediaТвичинговые пластины - LB mediaИсходные пластины - LB media
200 мл 5-кратного раствора солей M910 г NaCl10 г NaCl
10 мл 20% глюкозы10 г триптона10 г триптона
25 мл казаминокислот5 г дрожжевого экстракта5 г дрожжевого экстракта
1 мл 1М MgSO410 г Агар15 г Агар
500 мл 1% агараДобавьте dH2O в 1 лДобавьте dH2O в 1 л
Добавьте dH2O в 1 лГентамицин (конечная концентрация 15 г/мл)

Таблица 1: Состав среды для различных планшетов, используемых в анализе.

1. Подготовка тарелок питательной среды

ПРИМЕЧАНИЕ: Смотрите Таблицу материалов для приготовления исходных растворов и условий хранения. Плиты следует заполнять на выровненной поверхности. При сушке тарелки должны лежать ровно на поверхности (т.е. не укладываться друг на друга). Это обеспечивает равномерное высыхание питательной среды в тарелке. Могут подойти любые планшеты uniwell с типичной посадочной площадью, но пластины с большими внутренними размерами (без внутренних стенок), такие как пластины Singer Instruments Plus или однолуночные необработанные планшеты для культивирования тканей VWR, облегчают работу с более высокой плотностью колоний на пластину.

  1. Приготовьте соответствующее количество среды для экспериментов в соответствии с рецептом, приведенным в таблице 1. Поддерживайте температуру среды при температуре ~45 °C-50 °C, чтобы предотвратить затвердевание агара.
    1. Для исходных планшетов приготовьте 59 LB (лизогенный бульон) планшетов, содержащих 1,5% агара и 15 мкг/мл гентамицина, который необходим для репликации полной библиотеки PA14 - 59 x 25 мл =~ 1500 мл. Приготовьте еще 15 пластин LB 1,5% агара и 15 мкг/мл гентамицина для масштабирования библиотеки в формате 384-плотности - 15 x 25 мл = ~400 мл.
    2. Твичинговые пластины: Если вы работаете в формате 96 плотности, подготовьте 59 твичинговых пластин (LB 1% агара). Подготовьте 15 твичинговых пластин, если работаете в формате 384-й плотности.
    3. Роящиеся пластины: Подготовьте 15 (формат с плотностью 384) или 59 (формат с плотностью 96) роящиеся пластины (M9-глюкоза 0,5% агара)
  2. Снимите крышку с тарелки и налейте 25 мл среды на тарелку. Равномерно распределите носитель по пластине, осторожно поднимая каждый угол пластины по одному. Повторите это покачивающее движение 2-3 раза. Поставьте крышку обратно на тарелку.
  3. Дайте пластинам застыть и высохнуть при комнатной температуре (RT) в течение ночи. Если пластины используются не сразу, положите их в герметичные пакеты и храните в сухом месте. Они могут храниться в течение 3 недель.

2. Подготовка исходных пластин библиотеки транспозонных мутантов P. aeruginosa

ПРИМЕЧАНИЕ: Исходные пластины относятся к пластинам LBA-гентамицина, содержащим копию библиотеки PA14, которые позже используются для инокуляции пластин подвижности. Библиотека мутантных транспозонов P. aeruginosa (библиотека PA14) представляет собой набор из 59 замороженных 96-луночных планшетов29. Ниже описаны шаги по подготовке исходных пластин для каждого формата. Этот протокол может быть адаптирован для лабораторий, которые не имеют доступа к репликатору Rotor+. Исследователи могут успешно выполнять те же экспериментальные процедуры, используя ручные репликаторы, такие как подпружиненные 96-контактные репликаторы, используемые здесь для репликации замороженных пластин библиотеки PA14 в течение первого дня (см. Таблицу материалов) или любые другие 96-контактные репликаторы. Ручные репликаторы необходимо стерилизовать и дать им остыть перед каждым использованием.

  1. День 1: Репликация библиотеки PA14 с 59 замороженных 96-луночных планшетов на исходные планшеты
    1. Простерилизуйте подпружиненный 96-контактный репликатор, поместив его на горячую плиту при максимальной температуре на 8 минут. После стерилизации дайте репликатору достаточно остыть (~10 минут), чтобы избежать уничтожения бактерий.
    2. Возьмитесь за одну исходную пластину. Используя стерильный 96-контактный репликатор, осторожно опустите контакты репликатора в одну 96-луночную пластину, затем перенесите клетки непосредственно на поверхность исходной пластины. Повторяйте до тех пор, пока все 59 замороженных 96-луночных планшетов библиотеки PA14 не будут реплицированы на исходные планшеты.
    3. Инкубируйте исходные пластины 96-й плотности при 37 °C в течение 16-18 часов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании метода с форматом 96-й плотности, эти исходные пластины затем могут быть использованы для инокуляции пластин подвижности.
  2. День 2: Масштабирование с плотности 96 до формата с плотностью 384
    ПРИМЕЧАНИЕ: День 2 можно пропустить, если вы работаете с плотностью 96.
    1. После инкубации оставьте пластины (расплинывающими на поверхности, не уложенными) при комнатной температуре (~1 ч) для остывания. Если на крышках есть конденсат, удалите конденсат с помощью деликатной салфетки, чтобы капли воды не попали на пластины, что может вызвать перекрестное загрязнение между колониями.
    2. Настройте репликатор со следующими параметрами, чтобы обеспечить точный перенос колонии. Включите репликатор. В разделе Выбор режима работы выберите Выбор и запуск хранимых программ.
    3. В разделе Выбор исходных пластин выберите PlusPlate 96 Агар. В разделе Выбор целевых пластин выберите PlusPlate 384 Agar. В разделе Select pads выберите Short Pin 96.
    4. В разделе «Репликация параметров программы» выберите «Общие » и нажмите « Переработать» > «Нет».
    5. В разделе «Источник» выберите «Смещение » и нажмите « Случайный радиус > умолчанию». В разделе Target выберите Pinning и отрегулируйте давление до 20%. Оставьте все остальные настройки по умолчанию.
    6. Вставьте короткий контакт RePads 96 в соответствующий отсек.
    7. Расположите исходную и целевую пластины на обозначенной платформе репликатора. Поместите на платформу исходные пластины с плотностью 96 (пластины 1, 2, 3 и 4) и новую пустую исходную пластину (пластины LBA). Используя выбранные параметры, робот для закрепления микробных матриц будет переносить колонии с пластин 96-й плотности на новую пластину 384-й плотности. Нажмите кнопку Выполнить.
    8. Поменяйте все пластины на платформе (следующие четыре исходные пластины 96-й плотности и новую пустую исходную пластину) и повторяйте до тех пор, пока все пластины не будут увеличены. Для последнего набора табличек используйте таблички 57, 58, 59 и 1. Каждая пластина 384-й плотности будет состоять из чередующихся колоний из четырех пластин 96-й плотности (см. рис. 2). Инкубируйте планшеты LBA с плотностью 384 при 37 °C в течение 16-18 часов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эти исходные пластины с плотностью 384 могут быть затем использованы для инокуляции пластины подвижности для выполнения протокола при плотности 384. На любом этапе после инкубации планшеты могут храниться при температуре 4 °C до 3 недель.

figure-protocol-2
Рисунок 2: Масштабирование с пластин с плотностью 96 до пластин с плотностью 384. Колонии из четырех исходных пластин 96-й плотности переносятся и объединяются в одну пластину 384-й плотности. Каждый квадрант пластины 384-луночной плотности соответствует одной из исходных 96-луночных пластин (красный, синий, желтый и зеленый), сохраняя положение каждого мутанта. Создано с помощью BioRender. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

3. Эксперимент с высокопроизводительной подвижностью

Примечание: Протокол был выполнен здесь в формате 384-й плотности, но тот же протокол может быть адаптирован к формату 96-й плотности путем изменения параметров репликатора для переноса с исходных пластин на пластины подвижности с использованием выбора 96 вместо 384.

  1. После инкубации оставьте пластины (расплинывающими на поверхности, не уложенными) при комнатной температуре (~1 ч) для остывания. Если на крышках образовался конденсат, удалите его с помощью деликатной салфетки, чтобы капли воды не попали на пластины, что может вызвать перекрестное загрязнение между колониями.
  2. Возьмите соответствующее количество пластин (59 для формата с 96-й плотностью или 15 для формата с 384-й плотностью) для нужного анализа: 0,5% агаровые пластины M9-глюкозы для роения, LB и 1% агаровые пластины для твичинга.
  3. Настройте репликатор со следующими параметрами, чтобы обеспечить точный перенос колонии.
    1. Включите репликатор. В разделе Выбор режима работы выберите Выбор и запуск хранимых программ. В разделе Выберите исходные пластины, выберите PlusPlate 384 Агар.
    2. В разделе Выбор целевых пластин выберите PlusPlate 384 Agar. В разделе Select pads выберите Short Pin 384. В разделе Репликация параметров программы выберите Общие > Перезапустить > Нет.
    3. В программе Singer выберите «Воспроизвести многие».
    4. В разделе «Источник» выберите «Смещение > случайным > радиус по умолчанию». В разделе Target выберите Pinning и отрегулируйте давление до 2%. Оставьте все остальные настройки по умолчанию.
  4. Вставьте короткий контакт RePads 384 в соответствующее отделение.
  5. Расположите исходную и целевую пластины на обозначенной платформе репликатора. Поместите на платформу исходные пластины с плотностью 384 и пустые пластины подвижности. Используя выбранные параметры, робот для закрепления микробной матрицы будет переносить колонии с исходных пластин с 384-й плотностью на пластины подвижности. Каждая пластина 384-й плотности будет состоять из копии одной исходной пластины 384-й плотности.
  6. Убедитесь, что перенос происходит равномерно и что все колонии надлежащим образом прикреплены к поверхности агара пластин подвижности. Положите привитые пластины подвижности в полиэтиленовые пакеты. Осторожно поместите пакеты с пластинами в инкубатор, установленный на 37 °C на 18 часов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пластины помещены в пакеты для поддержания влажности и предотвращения неравномерной сушки. Поместите пластины в инкубатор крышками вверх.
  7. После инкубации проверьте пластины подвижности на предмет равномерного роста колонии и отсутствия загрязнения.
  8. День 3: Визуализация пластин для измерения подвижности
    ПРИМЕЧАНИЕ: PhenoBooth от Singer Instruments используется для получения изображений пластин подвижности с высоким разрешением. Он использует камеру научного класса и создает 23-мегапиксельные изображения. Он включает в себя пять световых каналов для получения изображений колоний с высоким разрешением из чашек Петри и прямоугольных пластин. Другие высококачественные тепловизоры также работают.
    1. После инкубационного периода пластины подвижности готовы к процессу визуализации. Включите Phenobooth и нажмите на значок , соответствующий программному обеспечению Phenobooth.
    2. Откроется страница Выбрать проект; нажмите на Новый проект > подсчету колоний. Выберите нужный путь к файлу для сохранения изображений в поле «Местоположение». В поле Разрешение выберите 5626 x 4220. Нажмите OK, теперь устройство готово к съемке.
    3. Вставьте пластину в считыватель средней стороной вверх после снятия крышки. Перед закрытием считывателя убедитесь, что пластина расположена правильно, чтобы избежать заклинивания пластины.
    4. Установите параметр на белый свет на вкладке Освещение. Нажмите на кнопку «Предварительный просмотр». Отрегулируйте параметры экспозиции на вкладке настроек PhenoBooth, чтобы получить оптимальные параметры для наблюдения за фенотипами подвижности.
    5. Нажмите на кнопку «Приобрести»; Захваченные изображения появятся в левой части экрана. По завершении закройте программу (все снятые изображения будут сохранены в ранее выбранном файле во вкладке «Местоположение»).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Phenobooth сохраняет изображения в формате JPEG, но для последующих этапов анализа изображения могут быть в формате TIFF, JPEG или PNG.

4. Анализ фенотипов моторики

ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ изображений выполняется, как подробно описано во Френче и др.30,31. Скрипт для выполнения анализа данных доступен в31 (ImageJ Macro).

  1. Вкратце, изображения обрабатываются в ImageJ32, который генерирует значение для каждой колонии на пластине подвижности. Во-первых, преобразуйте изображения в 8-битный формат и сегментируйте колонии и связанные с ними области подвижности от фона с помощью команды threshold. Нарисуйте область интереса (ROI) вокруг каждой колонии и измерьте область подвижности. В результате создается таблица, содержащая интегрированное значение плотности для каждой скважины, организованное по строкам. Эту таблицу можно сохранить в виде файла CSV для дальнейшего анализа.
    1. Запустите макрос в программе ImageJ и откройте папку с изображениями.
    2. При появлении запроса отрегулируйте поворот пластины, изменив угол наклона пластины с помощью параметра «Предварительный просмотр» так, чтобы пластина была прямой. Когда все будет удовлетворено, нажмите кнопку OK .
    3. Затем переместите прямоугольник вокруг колоний и используйте его для обрезки части пластины, содержащей колонии. Когда все будет готово, нажмите кнопку OK .
    4. Следующий запрос определит сетку, используемую для рисования ROI вокруг каждой колонии и измерения области подвижности. Выберите подходящую плотность колонии. При необходимости отрегулируйте различные параметры, чтобы каждый круг был вокруг колонии. Когда все будет готово, активируйте функцию Okay? и нажмите кнопку OK . Это позволит измерить область подвижности для каждой колонии и сохранить файл CSV в папке, содержащей данные.
  2. Объедините этот CSV-файл с легендой пластины, также организованной по строкам, чтобы идентифицировать каждую область подвижности с соответствующим мутантом. Более низкие значения интегральной плотности соответствуют мутантам, которые были неподвижными или демонстрировали сниженную подвижность.

5. Традиционные анализы моторики для валидации попаданий

ПРИМЕЧАНИЕ: После наблюдения за мутантами с нарушенной моторикой в протоколе с высокой пропускной способностью важно проверить полученные попадания по отдельности. Протокол индивидуальной подвижности отличается от протокола, используемого для тестирования с высокой пропускной способностью, но используемые среды одинаковы.

  1. Анализ роевой подвижности
    ПРИМЕЧАНИЕ: Роевая подвижность осуществляется так, как подробно описано в Ha et al.16.
    1. Вкратце, автоклав раствор агара с М9 (0,5% агара), глюкозой, казаминокислотами и MgSO4. Остывший, перемешанный агар высыпать в пластины Петри (25 мл на тарелку).
    2. Заквашите 2,5 мкл ночного бактериального посева. Инкубировать при температуре 37 °C в течение 18 ч крышками вверх для наблюдения за фенотипами подвижности.
  2. Анализ подергивающейся моторики
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подергивающаяся моторика осуществляется в соответствии с подробным описанием Haley et al.33,34.
    1. Вкратце, автоклавируйте LB 1% агар (см. Таблицу 1). Остывший, перемешанный LB 1% агар высыпать в пластины Петри (по 25 мл на тарелку).
    2. Заколите бактерии на дно подергивающихся пластин (1% агара). Инкубируйте планшеты при 37 °C в течение 48 часов, а затем при RT еще 48 часов. Снимите агар с тарелки и визуализируйте зону подергивания, окрашивая чашку Петри 1% кристаллической фиалки.
    3. Сфотографируйте чашки Петри с помощью PhenoBooth с теми же параметрами, которые описаны в шаге 3.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы использовали этот протокол для характеристики влияния инактивации гена на подвижность P. aeruginosa при высокой пропускной способности. В этой статье мы подробно описали его использование для изучения роевой и дергающейся подвижности в полногеномной делеционной коллекции P. энегнойная палочка штамма PA14 (библиотека PA14). Протокол обеспечивает большую универсальность и простоту использования, позволяя вносить изменения в различные этапы протокола, такие ка...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Описанный здесь протокол высокопроизводительной подвижности позволяет нам обрабатывать и анализировать фенотип подвижности многих колоний с точностью и воспроизводимостью. По сравнению с традиционными ручными методами, этот полуавтоматический подход увеличивает масштабируемость и пропускную способность анализов подвижности, что позволяет оценивать подвижность бактерий на уровне всего генома. Протокол был оптимизирован для использования с библиотекой PA14, но этот анализ может быть исполь...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют о неразглашении информации.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим лабораторию Surette в Университете Макмастера за предоставление копии библиотеки PA14. Мы благодарим д-ра Фабриса Жан-Пьера за его полезные комментарии к рукописи. Эта работа была поддержана Советом по естественным наукам и инженерным исследованиям Канады (RGPIN-2019-06044) и стартовым грантом для новых исследователей от Fonds de recherche du Québec - Santé (FRQS; #295613). J.-P.C. является обладателем стипендии Chercheur boursier junior 2 от Fonds de recherche du Québec-Santé (FRQS).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
96 скважинных пластин и bbsp;  Corning   3701 
Agar Fisher Scientific   BP1423-2 Конечная концентрация 0,5% для роевой подвижности или 1% для подёргивающейся подвижности соответственно. 
Касаминокислоты   Fisher Scientific   223050 Подготовьте 20% запаса воды. Фильтр стерилизует с 0,22 и мю; m фильтровать и хранить при температуре 4°C. Конечная концентрация 0,5% в минимальной среде M9. 
Хрустальный фиолетовый  Bio Basic   CB0331Приготовьте 1% раствор в воде. 
D-глюкоза   Bio Basic   GB0219 Подготовьте 20% запас (1,1 м) в воде и стерилизуйте с помощью автоклава. Итоговая концентрация 0,2% в минимальной среде M9. 
Filtropur S 0.2 Sarstedt 83.1826.001
Гентамицин сульфат   Bio Basic   GB0217 Приготовьте бульон на 30 мг/мл в воде. Фильтр стерилизует с 0,22 и мю; M фильтровать и хранить при температуре 4°°; C – конечная концентрация в пластинах 15 и микро; g/mL..    
Инокуляционная петля и игла  Fisher Scientific 22363597
M9 Минимальные соли, 5X Fisher Scientific 248510Подготовьте запас на 1 метр в воде и стерилизуйте автоклавом. Итоговая концентрация 1 мМ в минимальной среде M9.   
Сульфат магния (MgSO4)   Fisher Scientific M63-500  Подготовьте приклад MgSO4 объемом 1 M в воде. Фильтр стерилизует с 0,22 и мю; М фильтрует и хранит при комнатной температуре. Итоговая концентрация 
Библиотека мутантов с вставкой транспозона PA14   Liberati и др., 2006 (см. ссылку 29)59 пластин на 96 лунок для всей коллекции. В каждой скважине содержится один мутант в LB с 25% глицерина. 
чашка Петри 92x16mm Sarstedt 82.1473.001
PhenoBooth+ Певческие инструменты https://www.singerinstruments.com/solution/phenobooth/specification/ Растворить 11,3 г порошка в 200 мл очищенной воды. Автоклав на 121 градус; C на 15 мин. 
Пластиковый шприц 10 мл Fisher Scientific 14955459
Rotor+     Певческие инструменты https://www.singerinstruments.com/resource/rotor-had/ 
Короткие контакты RePads 384 плотности Певческие инструменты   REP-004 
Короткие контакты RePads 96 плотности   Певческие инструменты   REP-002 
Хлорид натрия (NaCl)   Fisher Scientific BP358-212 
Пружинный 96-контактный репликаторEnzyScreen   CR1000 
Хирургическое лезвие из нержавеющей стали No 25 Fisher Scientific 08-918-5F
Tryptone Oxoid   LP0042B 
Номерные знаки ЮнивеллаПевческие инструменты   PlusPlates: PLU-003   Размер пластины: 54 и больше раз; 34 и раза; 38 см — без внутренних стен, которые обеспечивают большие внутренние размеры. 
Номерные знаки ЮнивеллаVWRПластины с одной скважиной тканевой культуры: 75780-348Те же размеры, что и у PlusPlate.
Дрожжевый экстракт  Fisher Scientific 248510 

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Burrows, L. L. Pseudomonas aeruginosa twitching motility: type IV pili in action. Annu Rev Microbiol. 66, 493-520 (2012).
  2. Khan, F., Pham, D. T. N., Oloketuyi, S. F., Kim, Y. M. Regulation and controlling the motility properties of Pseudomonas aeruginosa. Appl Microbiol Biotechnol. 104 (1), 33-49 (2020).
  3. Gellatly, S. L., Hancock, R. E. W. Pseudomonas aeruginosa new insights into pathogenesis and host defenses. Pathog Dis. 67 (3), 159-173 (2013).
  4. Ribbe, J., Baker, A. E., Euler, S., O'Toole, G. A., Maier, B. Role of cyclic Di-GMP and exopolysaccharide in type IV pilus dynamics. J Bacteriol. 199, e00859-e00916 (2017).
  5. Arora, S. K., Neely, A. N., Blair, B., Lory, S., Ramphal, R. Role of motility and flagellin glycosylation in the pathogenesis of Pseudomonas aeruginosa burn wound infections. Infect Immun. 73 (7), 4395-4398 (2005).
  6. Kearns, D. B. A field guide to bacterial swarming motility. Nat Rev Microbiol. 8 (9), 634-644 (2010).
  7. Limoli, D. H., et al. Interspecies interactions induce exploratory motility in Pseudomonas aeruginosa. eLife. 8, e47365(2019).
  8. Breidenstein, E. B. M., Fuente-Núñez, C., de la Hancock, R. E. W. Pseudomonas aeruginosa: all roads lead to resistance. Trends Microbiol. 19 (8), 419-426 (2011).
  9. Toutain, C. M., Zegans, M. E., O'Toole, G. A. Evidence for two flagellar stators and their role in the motility of Pseudomonas aeruginosa. J Bacteriol. 187 (2), 771-777 (2005).
  10. Köhler, T., Curty, L. K., Barja, F., van Delden, C., Pechère, J. C. Swarming of Pseudomonas aeruginosa is dependent on cell-to-cell signaling and requires flagella and requires flagella and pili. J Bacteriol. 182 (21), 5990-5996 (2000).
  11. Tremblay, J., Richardson, A. P., Lépine, F., Déziel, E. Self-produced extracellular stimuli modulate the Pseudomonas aeruginosa swarming motility behaviour. Environ Microbiol. 9 (10), 2622-2630 (2007).
  12. Kühn, M. J., et al. Mechanotaxis directs Pseudomonas aeruginosa twitching motility. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (30), e2101759118(2021).
  13. Talà, L., Fineberg, A., Kukura, P., Persat, A. Pseudomonas aeruginosa orchestrates twitching motility by sequential control of type IV pili movements. Nat Microbiol. 4 (5), 774-780 (2019).
  14. Tittsler, R. P., Sandholzer, L. A. The use of semi-solid agar for the detection of bacterial motility. J Bacteriol. 31 (6), 575-580 (1936).
  15. Turnbull, L., Whitchurch, C. B. Motility assay: Twitching motility. Methods Mol Biol. 1149, 73-86 (2014).
  16. Ha, D. -G., Kuchma, S. L., O'Toole, G. A. Plate-based assay for swarming motility in Pseudomonas aeruginosa. Methods Mol Biol. 1149, 67-72 (2014).
  17. Semmler, A. B. T., Whitchurch, C. B., Mattick, J. S. A re-examination of twitching motility in Pseudomonas aeruginosa. Microbiology. 145 (Pt 10), 2863-2873 (1999).
  18. Henrichsen, J. Twitching Motility. Annu Rev Microbiol. 37, 81-93 (1983).
  19. Nolan, L. M., et al. A global genomic approach uncovers novel components for twitching motility-mediated biofilm expansion in Pseudomonas aeruginosa. Microb Genom. 4 (11), e000229(2018).
  20. Overhage, J., Lewenza, S., Marr, A. K., Hancock, R. E. W. Identification of genes involved in swarming motility using a Pseudomonas aeruginosa PAO1 mini-Tn5-lux mutant library. J Bacteriol. 189 (5), 2164-2169 (2007).
  21. De Bleeckere, A., et al. High throughput determination of the biofilm prevention concentration for Pseudomonas aeruginosa biofilms using a synthetic cystic fibrosis sputum medium. Biofilm. 5, 100106(2023).
  22. Brochado, A. R., Typas, A. High-throughput approaches to understanding gene function and mapping network architecture in bacteria. Curr Opin Microbiol. 16 (2), 199-206 (2013).
  23. Hertzberg, R. P., Pope, A. J. High-throughput screening: new technology for the 21st century. Curr Opin Chem Biol. 4 (4), 445-451 (2000).
  24. Baba, T., et al. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Mol Syst Biol. 2, 2006.0008(2006).
  25. Tong, M., et al. Gene dispensability in Escherichia coli grown in thirty different carbon environments. mBio. 11 (6), e02259-e02320 (2020).
  26. French, S., Côté, J. P., Stokes, J. M., Truant, R., Brown, E. D. Bacteria getting into shape: genetic determinants of E. coli morphology. mBio. 8, e01977-e02016 (2017).
  27. Porwollik, S., et al. Defined single-gene and multi-gene deletion mutant collections in Salmonella enterica sv Typhimurium. PLoS One. 9 (7), e99820(2014).
  28. Koo, B. M., et al. Construction and analysis of two genome-scale deletion libraries for Bacillus subtilis. Cell Syst. 4 (3), 291-305.e7 (2017).
  29. Liberati, N. T., et al. An ordered, nonredundant library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 transposon insertion mutants. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (8), 2833-2838 (2006).
  30. French, S., et al. A robust platform for chemical genomics in bacterial systems. Mol Biol Cell. 27 (6), 1015-1025 (2016).
  31. French, S., Guo, A. B. Y., Brown, E. D. A comprehensive guide to dynamic analysis of microbial gene expression using the 3D-printed PFIbox and a fluorescent reporter library. Nat Protoc. 15 (2), 575-603 (2020).
  32. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  33. Haley, C. L., Kruczek, C., Qaisar, U., Colmer-Hamood, J. A., Hamood, A. N. Mucin inhibits Pseudomonas aeruginosa biofilm formation by significantly enhancing twitching motility. Can J Microbiol. 60 (3), 155-166 (2014).
  34. Déziel, E., Comeau, Y., Villemur, R. Initiation of biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa 57RP correlates with emergence of hyperpiliated and highly adherent phenotypic variants deficient in swimming, swarming, and twitching motilities. J Bacteriol. 183 (4), 1195-1204 (2001).
  35. Gao, P., et al. oprC impairs host defense by increasing the quorum-sensing-mediated virulence of Pseudomonas aeruginosa. Front Immunol. 11, 1696(2020).
  36. Rosenau, F., et al. Lipase LipC affects motility, biofilm formation and rhamnolipid production in Pseudomonas aeruginosa. FEMS Microbiol Lett. 309 (1), 25-34 (2010).
  37. Anyan, M. E., et al. Type IV pili interactions promote intercellular association and moderate swarming of Pseudomonas aeruginosa. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (50), 18013-18018 (2014).
  38. Burdman, S., Bahar, O., Parker, J. K., De La Fuente, L. Involvement of type IV pili in pathogenicity of plant pathogenic bacteria. Genes. 2 (4), 706-735 (2011).
  39. Lewis, K. A., et al. Nonmotile subpopulations of Pseudomonas aeruginosa repress flagellar motility in motile cells through a type IV pilus- and pel-dependent mechanism. J Bacteriol. 204 (5), e00528-e00621 (2022).
  40. Chang, C. Y. Surface sensing for biofilm formation in Pseudomonas aeruginosa. Front. Microbiol. 8, 2671(2018).
  41. Zegadło, K., et al. Bacterial motility and its role in skin and wound infections. Int J Mol Sci. 24 (2), 1707(2023).
  42. Jurado-Martín, I., Sainz-Mejías, M., McClean, S. Pseudomonas aeruginosa: An audacious pathogen with an adaptable arsenal of virulence factors. Int J Mol Sci. 22 (6), 3128(2021).
  43. Qin, S., et al. Pseudomonas aeruginosa: pathogenesis, virulence factors, antibiotic resistance, interaction with host, technology advances and emerging therapeutics. Sig Transduct Target Ther. 7 (1), 199(2022).
  44. Piskovsky, V., Oliveira, N. M. Bacterial motility can govern the dynamics of antibiotic resistance evolution. Nat Commun. 14 (1), 5584(2023).
  45. Xu, J., Koizumi, N., Nakamura, S. Crawling motility on the host tissue surfaces is associated with the pathogenicity of the zoonotic spirochete Leptospira. Front Microbiol. 11, 1886(2020).
  46. Rasmussen, L., et al. A high-throughput screening assay for inhibitors of bacterial motility identifies a novel inhibitor of the Na+-driven flagellar motor and virulence gene expression in Vibrio cholerae. Antimicrob Agents Chemother. 55 (9), 4134-4143 (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Pseudomonas AeruginosaBacterial MotilitySwarming MotilityTwitching MotilityHigh Throughput ProtocolMotility AssayGenome Wide MutantBiofilm FormationColony Pinning RobotImageJ Analysis

Related Articles