В статье описан протокол восстановления микробиоты пастеризованного донорского молока с использованием микробиоты собственного молока матери в практических, реальных условиях. Он демонстрирует эффективный рост бактерий и модуляцию микробиома, поддерживая целесообразное применение этой процедуры в рамках рутинного ухода за родильным домом и связанного с ним банка грудного молока.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Индивидуализированное восстановление микробиоты грудного молока человека: возможный подход в реальных условиях
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Собственное материнское молоко (MOM) является наиболее полноценным пищевым ресурсом для новорожденных. В тех случаях, когда матери не могут вырабатывать достаточное количество молока или не могут кормить грудью, предпочтительной альтернативой является пастеризованное донорское грудное молоко (ПДМ), которое обычно предоставляется банками грудного молока. PDM предлагает превосходный спектр питательных и иммунологических элементов по сравнению с любой коммерчески доступной формулой. Однако для обеспечения биобезопасности PDM подвергается пастеризации — процессу, который инактивирует комменсальную микробиоту и снижает количество некоторых биологически активных соединений. В этом исследовании представлен протокол, разработанный для восстановления микробиоты ПДМ с использованием МОМ в качестве микробного источника, адаптируя подход к реальным клиническим условиям.
Протокол был внедрен в клиническое исследование, проведенное в родильном доме и связанном с ним банке грудного молока, с целью обеспечения персонализированным донорским молоком недоношенных детей, чьи матери не могут вырабатывать достаточное количество молока. Методология включает в себя инокуляцию PDM 10% MOM с последующей инкубацией при 37 °C в течение 4 ч. Микробиологический анализ продемонстрировал успешный рост бактерий в инокулированном молоке (ВМ) после инкубации, при этом профиль микробиоты восстановленного молока (РМ) очень похож на профиль МОМ, что указывает на эффективное восстановление микробиоты. Эти результаты свидетельствуют о том, что протокол восстановления осуществим для внедрения в неонатальную помощь с потенциалом для улучшения питательных и иммунологических качеств PDM, тем самым поддерживая здоровье и развитие новорожденных, не находящихся на грудном вскармливании.
Введение
Грудное молоко широко признано лучшим источником питания для новорожденных, обеспечивая не только необходимыми макро- и микроэлементами, но и сложным набором элементов, включая различные метаболиты и компоненты иммунной системы, такие как антитела, цитокиныи клетки. Кроме того, полезные свойства в грудном молоке также обусловлены сообществом комменсальных микроорганизмов. Все эти элементы грудного молока играют важнейшую роль в развитии новорожденного1. На сообщество микроорганизмов, известное как микробиота, влияет сочетание таких факторов, как диета, образ жизни матери, тип родов и гестационный возраст, в результате чего каждое молоко имеет микробиоту с определенными характеристиками2. Механизмы, с помощью которых микробиота грудного молока способствует неонатальному развитию, варьируются от защиты кишечной поверхности путем колонизации комменсальными бактериями до содействия созреванию иммунной системы за счет выработки метаболитов, которые взаимодействуют с иммунными клетками в кишечнике3. По этой причине индивидуализированный профиль микроорганизмов в молоке каждой матери делает его формой персонализированной медицины для новорожденных4.
Наличие здоровой микробиоты может помочь защитить новорожденного от колонизации потенциально патогенными микроорганизмами, занимая экологическую нишу и поддерживая питание, особенно для недоношенных детей, которые более уязвимы к этим внешним воздействиям из-за нахождения в больничных условиях и незрелой иммунной системы. Более того, матери, которые рожают преждевременно, часто испытывают трудности с выработкой молока в достаточном количестве для своих новорожденных. Выработка молока, как правило, ниже, чем младше гестационный возраст5 лет. В этих случаях оптимальным вариантом кормления новорожденного является пастеризованное донорское молоко, предоставляемое банками грудного молока (ИСБ)6.
Бразилия обладает самой большой и обширной сетью ИСБ в мире7. Эта сеть собирает, готовит и распределяет более 160 000 литров пастеризованного донорского грудного молока (ПДМ) по всей стране бесплатно для родителей через национальную единую систему здравоохранения (Sistema Único de Saúde), управляемую Министерством здравоохранения7. Пастеризация имеет важное значение для обеспечения биобезопасности донорского молока, предназначенного для новорожденных. Этот процесс обычно проводится по методу Холдера, который предполагает погружение емкости с сырым донорским грудным молоком в водяную баню при температуре 62,5 °C на 30 мин 6,8. Полученный PDM затем хранится в холодильнике до тех пор, пока он не будет готов к употреблению. Однако пастеризация снижает жизнеспособность комменсальной микробиоты молока и снижает биодоступность различных биологически активных компонентов. Это связано с тем, что процесс пастеризации стандартизирован для предотвращения передачи патогенных микроорганизмов новорожденному. В этом контексте в 2017 году Качо и его коллеги описали возможность восстановления комменсальной микробиоты собственного молока матери путем инокуляции ее в различных пропорциях в PDM9. Их результаты показали, что использование 10% концентрации собственного молока матери (MOM) является оптимальной концентрацией для поддержания исходного состава профиля микробиома MOM. Такой подход снижает риск чрезмерного роста определенных бактерий, которые, хотя и обычно комменсальны, могут стать вредными, если их непропорционально много в восстановленном молоке. В частности, в исследовании было отмечено, что разведение в соотношении 1:10 (10% MOM + 90% PDM), инкубированное в течение 4 часов, привело к хорошо сбалансированной бактериальной нагрузке — примерно 60% от той, которая обнаружена в неразбавленном MOM, что указывает на более безопасный и эффективный подход. Напротив, более высокие разведения, такие как 3:10, приводили к чрезмерному росту бактерий, что подчеркивает критическую необходимость контролируемых концентраций и условий для обеспечения безопасности.
В данной статье мы демонстрируем, что процедура восстановления микробиоты грудного молока при ПДМ может быть реализована в реальных ситуациях в рамках плановой медицинской помощи родильного дома и связанного с ним банка грудного молока.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Этот протокол был выполнен в рамках процедур клинического исследования, проведенного нашей исследовательской группой (Бразильский реестр клинических испытаний, ReBEC RBR-729kr8x), и получил одобрение Комитета по этике (процесс CAAE No 41063520.4.0 000.0121) и информированное согласие всех участников до рандомизации и коллетирования образцов.
Процедура восстановления микробиоты молока выполняется в три этапа:
1. Получение сырого материнского молока
ПРИМЕЧАНИЕ: С порядком получения молока можно ознакомиться в других разделах10,11.
- Перед процедурой получите информированное согласие матери в соответствии с этическим комитетом и обязательно объясните матери все, что будет сделано, обращаясь к любым сомнениям, опасениям, страхам и тревогам по поводу процедуры, чтобы мать могла расслабиться.
- Попросите мать сцедить молоко с помощью электрического молокоотсоса в стерилизованный контейнер под наблюдением старшей медсестры отделения, соблюдая установленные местные гигиенические нормы каждого родильного отделения.
- После сбора пометьте контейнер с молоком, указав информацию о матери, дату и время сбора. Хранить собственное молоко матери (MOM) при температуре -4 °C или ниже до 12 часов.
2. Размораживание пастеризованного донорского молока (ПДМ)
ПРИМЕЧАНИЕ: ИСБ имеют свой собственный запас ПДМ, замороженный при температуре ниже -4 °C в течение максимального периода до 6 месяцев, и процедура хорошо описана в литературе в других местах 12,13,14.
- Размораживают сырое молоко или ПДМ, хранящие в стерилизованных стеклянных контейнерах с пластиковыми крышками на водяной бане при температуре 40 °C, что обеспечивает поддержание температуры и сокращение времени обработки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не размораживайте PDM при комнатной температуре или при температуре охлаждения (внутри холодильника), так как время размораживания в этих случаях увеличивается, что способствует воздействию микроорганизмов и их росту. - Снимите бутылки с грудным молоком с водяной бани до того, как молоко в бутылке нагреется выше 5 °C.
3. Посев ПДМ с МОМ для восстановления микробиома
ПРИМЕЧАНИЕ: Стандартное объемное соотношение для процесса инокуляции PDM MOM составляет 90%: 10% (v/v). Этапы процедуры заключаются в следующем:
- Проинструктируйте лаборанта надеть лабораторный халат, маску, кепку и перчатки.
- Очистите рабочую поверхность раствором для очистки поверхностей в соответствии с местным институциональным протоколом.
- Расставьте материалы, которые будут использоваться, и подготовьте оборудование. Разогрейте инкубатор (водяную баню) водой до 37 °С.
- Спланируйте окончательный объем используемого инокулированного молока и выберите контейнер подходящего размера. Поместите емкость со свежим сырьем MOM и PDM в жидком виде на рабочую поверхность.
- Соберите аликвоту до 1 мл МОМ с помощью стерильного оборудования для последующего секвенирования 16S и подсчета бактерий. Храните аликвоту в криопробирке, не содержащей ДНКазы/РНКазы, при температуре -80 °C.
- С помощью стерильного волюметрического инструмента (например, шприца, пипетки) переложите оставшийся объем, эквивалентный 10% от конечного желаемого объема молока, в контейнер, безопасный для пищевых продуктов, чтобы погрузить его в водяную баню при температуре 37 °C.
- Соберите 1 мл аликвоты PDM с помощью стерильного оборудования для последующего секвенирования 16S и подсчета бактерий. Храните аликвоту в криопробирке, не содержащей ДНКазы/РНКазы, при температуре -80 °C.
- С помощью стерильного волюметрического инструмента (например, шприца, пипетки) переложите количество PDM, эквивалентное 90% от конечного желаемого объема молока (например, шприца, пипетки) с предыдущего этапа, теперь формируя инокулированное материнское молоко (ВМ).
- Закройте контейнер крышкой, которая предотвращает загрязнение внутренней части бутылки внешней жидкостью, и погрузите ее в водяную баню при температуре 37 °C на 4 часа, чтобы микроорганизмы, инокулированные в молоко, могли размножаться.
- Через 4 ч снимите емкость с ферментированным ИМ с водяной бани, теперь называемой восстановленным молоком (РМ).
- Резервируйте аликвоту до 1 мл с помощью стерильного оборудования для последующего секвенирования 16S и подсчета бактерий. Храните аликвотный запас в криопробирке, не содержащей ДНКазы/РНКазы, при температуре -80 °C.
- Оставшийся объем переложите в продезинфицированный контейнер для кормления новорожденных.
4. Валидация метода путем бактериального культивирования на планшетах
ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры должны выполняться в стерильных условиях, чтобы предотвратить загрязнение и обеспечить точность разведений. Рост бактерий можно оценить с помощью методов, описанных в других разделах 9,15.
- Приготовьте серийные разведения каждого образца молока (PDM, MOM, IM, RM) в стерильном физиологическом растворе в концентрациях 10-1, 10-2, 10-3 и 10-4 . Тщательно перемешайте каждое разбавление, чтобы обеспечить равномерное распределение бактерий.
- Пиппет и распределите по 100 мкл каждого разведенного образца на планшеты Man-Rogosa-Sharpe (MRS) и Mannitol Salt Agar (MSA) в трех экземплярах с помощью стерильной петли Дригальского или стеклянного разбрасывателя. Следите за тем, чтобы объем равномерно распределился по агаровой пластине.
- Инкубируйте агаровые планшеты MRS в анаэробную банку, содержащую для создания среды с низким содержанием кислорода для роста молочнокислых бактерий.
- Инкубируйте пластины солевого агара маннита (MSA) аэробно, чтобы поддержать рост видов Staphylococcus.
- Инкубируйте планшеты при температуре 37 ± 2 °C в течение 48-72 часов.
- Выберите разведение с подсчетным количеством колоний бактерий (25-250 колоний) на каждом типе агара
- Подсчитайте видимые колонии на каждой из трех пластин репликации для выбранного разведения.
- Рассчитайте среднее количество колоний по тройным планшетам для выбранного разведения в средах MRS и MSA.
- Определите количество колониеобразующих единиц (КОЕ) на мл для каждого образца с помощью следующей формулы и преобразуйте в логарифмическую шкалу по основанию 10 (log10) для облегчения интерпретации. Приступаем к статистическому анализу результатов.
Количество КОЕ/мл = Количество колоний × общем коэффициенте разбавления/объеме в мл
5. Анализ микробиома молока
ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ микробиома молока может быть выполнен в соответствии с методами и конвейером, описанными в другихразделах 16. Скриншот скрипта R, используемого в этом анализе, представлен на дополнительном рисунке S1.
- Центрифугируйте 500 мкл образца в течение 15 с при давлении 180 × g для осаждения клеток и твердых частиц.
- Соберите 350 мкл надосадочной жидкости и используйте ее для экстракции ДНК.
- Количественно оцените выделенную ДНК с помощью спектрофотометра.
- Амплифицируйте участки V3 и V4 рибосомальной РНК 16S с использованием 20 нг ДНК и праймеров 357F/805R (см. Таблицу материалов)17.
- Используйте магнитные шарики для очистки полученных ампликонов и количественного определения ампликонов со штрих-кодом с помощью флуориметра ДНК.
- Секвенируйте ампликоны в режиме парного конца 250.о.
- Обработайте полученные последовательности, выполнив качественную обрезку и снятие адаптера18. Используйте режим парного конца (PE) с оценкой Phred33 и установите минимальную длину чтения 200.о., чтобы обеспечить высокое качество чтения.
- Импортируйте данные парных последовательностей в QIIME 219 с помощью формата файла манифеста и команды: qiime tools import.
- Обработайте импортированные последовательности с помощью DADA2 для шумоподавления, дерепликации и удаления химер с помощью команды: qiime dada2 denoise-paired. На этом шаге генерируются высококачественные репрезентативные последовательности и таблица признаков.
- Фильтруйте признаки и последовательности, чтобы сохранить только те из них, которые имеют достаточное представление, с помощью команд: qiime feature-table filter-features и qiime feature-table filter-seqs.
- Подготовьте ссылочную базу данных путем извлечения областей, усиленных праймерами (V3-V4) с помощью: qiime feature-classifier extract-reads.
- Используйте алгоритм VSEARCH для таксономической классификации со ссылочной базой данных Silva при пороге идентичности 97%, выполнив команду:
qiime feature-classifier classify-consensus-vsearch - Интегрируйте таксономические присвоения с таблицей признаков с помощью инструментов BIOM: biom add-metadata.
- Выполнение статистического анализа, как описано в других разделах20,21.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Анализ роста бактерий с помощью планшетного культивирования
Микробиологические тесты, проведенные для валидации метода инокуляции PDM MOM, предложенного Cacho et al.9, показали, что, исходя из количества КОЕ/мл, не было существенных различий между образцами инокулированного молока до и после 4-часовой инкубации. Тем не менее, различия в количестве колоний наблюдались в эти две временные точки, что указывает на рост бактерий во время инкубации на MSA для Staphylococcus ...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Здесь мы представляем протокол, который должен применяться в родильных домах, связанных с банком грудного молока, с целью обеспечить ПДМ восстановление микробиоты молока от конкретной матери, которая по разным причинам не может обеспечить достаточного количества молока для своего новорожденного. Протокол прост и по сути основан на двух шагах. Первый включает в себя применение процедур, обычно выполняемых в банках грудного молока для надлежащего сбора и последующей пастеризации донорского...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.
Благодарности
Авторы выражают признательность за финансовую поддержку со стороны Programa de Pesquisas para o SUS, PPSUS/2020, Ministério da Saúde do Brasil; Fundação de Amparo à Pesquisa e Inovação do Estado de Santa Catarina, номер гранта: 2021TR000506; Programa de Pesquisa Universal, Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) do Ministério de Ciência e Tecnologia do Brasil, Grant Number: 420996/2023-0; Programa Institucional de Bolsas de Iniciação Científica 2022 - 2024, Номер гранта: 120815/2023-0. Мы также благодарим волонтеров за предоставленные образцы.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Электрический молокоотсос | Horigen | XN-2219M2 | Мягкий молокоотсос dual plus |
| Pyrex Бутылки для медиа | Corning | CLS1395100 | Стеклянная тара с пластиковыми крышками |
| 1000 &микро; L пипетка Labmate pro | Corning HTL SA | 5666 | Дозатор переменного объема |
| Криогенный флакон | Corning | CLS431417 | Флаконы объемом 2 мл без ДНКазы/РНКазы |
| Центрифужные пробирки 15 мл | Corning | CLS431470 | Пробирки без ДНКазы/РНКазы 15 мл |
| Водяная баня | EcoSonics | Q3.0/40A | |
| Man– Rogosa– Шарп (MRS) | Difco | 288210 | Питательная среда для молочнокислых бактерий |
| Маннитовая соль Агар (MSA) | Himedia | MH118 | Staphylococcus питательная среда |
| Анаэробная баночная | пермутация | Создайте среду с низким содержанием кислорода для роста молочнокислых бактерий | |
| Extracta Комплект – Набор | Loccus | MPTA-PV16-B Y | ДНК |
| Nanodrop | Promega | E6150 | Quantus DNA |
| GoTaqG2 | Promega | M7841 | Система ампликации ПЦР |
| Quantus Флуориметр | Promega | E5150 | Набор для количественного определения ДНК / РНК |
| MiSeq System | Illumina Inc. | M-GL-00006 v4.0 | Оборудование для секвенирования |
| MiSeq Reagent Kit v2 (300 циклов) | Illumina Inc. | MS-102-2002 | Наборы и реагенты для секвенирования |
| Название программного обеспечения | |||
| Trimmomatic http://www.usadellab.org/cms/index.php?page=trimmomatic | Инструмент для чтения данных Illumina NGS | ||
| QIIME 2 | https://docs.qiime2.org/2024.10/ | Пакет для анализа микробиома | |
| Primer name< | strong>Primer sequence | ||
| 16S_357F | TCGTCGGCAGCGTCAGA TGTGTATAAGAGACAGC CTACGGGNGGCWGCAG | ||
| 16S_805R | GTCTCGTGGGCTCGGAG ATGTGTATAAGACAGG ACTACHVGGGTATCTAATC |
Ссылки
- Szyller, H., et al. Bioactive components of human milk and their impact on child's health and development, Literature Review. Nutrients. 16 (10), 1487(2024).
- Fernández, L., Rodríguez, J. M. Human milk microbiota: Origin and potential uses. Nestle Nutr Inst Workshop Ser. 94, 75-85 (2020).
- Fernández, L., Ruiz, L., Jara, J., Orgaz, B., Rodríguez, J. M. Strategies for the preservation, restoration and modulation of the human milk microbiota. Implications for human milk banks and neonatal intensive care units. Front Microbiol. 9, 2676(2018).
- Meier, P. P. More evidence: Mothers' own milk is personalized medicine for very low birthweight infants. Cell Rep Med. 3 (8), 100710(2022).
- Fewtrell, M. S., et al. Predictors of expressed breast milk volume in mothers expressing milk for their preterm infant. Arch Dis Child Fetal Neonatal Ed. 101 (6), F502-F506 (2016).
- Abrams, S. A., et al. Donor human milk for the high-risk infant: Preparation, safety, and usage options in the United States. Pediatrics. 139 (1), e20163440(2017).
- Brasil é referência em doação de leite materno. , Serviços e Informações do Brasil. At https://www.gov.br/pt-br/noticias/saude-e-vigilancia-sanitaria/2020/02/brasil-e-referencia-em-doacao-de-leite-materno (2024).
- Landers, S., Updegrove, K. Bacteriological screening of donor human milk before and after holder pasteurization. Breastfeed Med. 5 (3), 117-121 (2010).
- Cacho, N. T., et al. Personalization of the microbiota of donor human milk with mother's own milk. Front Microbiol. 8, 1470(2017).
- Pumping breast milk. , Centers for Disease Control and Prevention - CDC. https://www.cdc.gov/nutrition/infantandtoddlernutrition/breastfeeding/pumping-breast-milk.html (2023).
- Expressing and storing breast milk. , NHS UK. https://www.nhs.uk/conditions/baby/breastfeeding-and-bottle-feeding/breastfeeding/expressing-breast-milk/ (2020).
- Arslanoglu, S., et al. Recommendations for the establishment and operation of a donor human milk bank. Nutr Rev. 81 (Supplement_1), 1-28 (2023).
- Moro, G. E., et al. Processing of donor human milk: Update and recommendations from the European Milk Bank Association (EMBA). Front Pediatr. 7, 49(2019).
- Landers, S., Hartmann, B. T. Donor human milk banking and the emergence of milk sharing. Pediatr Clin North Am. 60 (1), 247-260 (2013).
- Stachelska, M. A. Identification of Lactobacillus delbrueckii and Streptococcus thermophilus strains present in artisanal raw cow milk cheese using real-time PCR and classic plate count methods. Pol J Microbiol. 66 (4), 491-499 (2017).
- Ruiz, L., et al. Comparison of two approaches for the metataxonomic analysis of the human milk microbiome. Front Cell Infect Microbiol. 11, 622550(2021).
- Lopez Leyva, L., Brereton, N. J. B., Koski, K. G. Emerging frontiers in human milk microbiome research and suggested primers for 16S rRNA gene analysis. Comp Struct Biotechnol J. 19, 121-133 (2021).
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: A flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
- Bolyen, E., et al. interactive, scalable and extensible microbiome data science using QIIME 2. Nat Biotechnol. 37 (8), 852-857 (2019).
- McMurdie, P. J., Holmes, S. phyloseq: An R package for reproducible iInteractive analysis and graphics of microbiome census data. PLoS ONE. 8 (4), e61217(2013).
- R Core Team. R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. https://www.R-project.org/ (2024).
- Torrez Lamberti, M. F., et al. Metabolomic profile of personalized donor human milk. Molecules. 25 (24), 5783(2020).
- Mallardi, D., et al. Inoculation of mother's own milk could personalize pasteurized donor human milk used for feeding preterm infants. J Transl Med. 19 (1), 420(2021).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
