Методическая статья

Создание трехмерного кокультурного модуля эпителиальных клеток с использованием нановолокнистых мембран

DOI:

10.3791/67780

⸱

27 декабря 2024 г.

 ,  ,  , 
1Department of Pharmacology, School of Medicine, Ajou University, 2Department of Medical Sciences, The Graduate School, Ajou University, 33D Immune System Imaging Core Center, Ajou University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В данной работе мы демонстрируем, как эпителиальные клетки, культивируемые фибробластами в двухслойной системе на основе нанофиброзной мембраны, могут стабильно прилипать к мембране и расти на ней.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Технические препятствия в культуре эпителиальных клеток включают дедифференцировку и потерю функции. Биомиметические трехмерные (3D) методы культивирования клеток могут повысить эффективность клеточных культур. В этом исследовании представлена усовершенствованная двухслойная культуральная система, предназначенная для культивирования эпителиальных клеток в виде тканеподобных слоев с культивированием фибробластов в 3D-среде. Поливиниловый спирт (ПВА) и поли(ε-капролактон) (PCL) нановолокнистые мембраны (ЯМ) были изготовлены с помощью электроспиннинга и использованы в качестве физиологически значимого внеклеточного матрикса для культивирования эпителиальных клеток и фибробластов соответственно. В верхних вставных лунках эпителиальные клетки легких культивировали на ПВА НМ, а в нижних камерах фибробласты культивировали на ПХЛ НМ. Такая конфигурация исключает прямой межклеточный контакт и облегчает изучение паракринной сигнализации, опосредованной растворимыми факторами. Конфокальная микроскопия была использована для анализа распределения, характера роста и экспрессии внутриклеточных белков, включая окклюденсы зон в эпителиальных клетках. Методы Z-стекинга позволили провести детальные 3D-реконструкции, дающие точное представление о целостности плотных соединений и пространственной организации в эпителиальном слое. С помощью сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) оценивали морфологические характеристики типов клеток на нановолокнистых мембранах. Визуализация СЭМ выявила сложные структуры клеточной поверхности и взаимодействия с нановолокнами, предлагая всесторонний взгляд на клеточную архитектуру и взаимодействие клеток с нановолокнистой структурой. Набор для подсчета клеток (CCK-8) — это простой метод измерения скорости роста эпителиальных клеток и фибробластов с течением времени. Он обеспечивает пролиферативное поведение и потенциальные синергетические эффекты кокультивирования этих клеток. Эти результаты подчеркивают эффективность простой системы совместной культивирования вставок для одновременного культивирования фибробластов и эпителиальных клеток, что имеет решающее значение в различных физиологических и фармакологических контекстах, включая регенерацию эпителиальной ткани, микроокружение опухоли эндотелиальными, иммунными и другими клетками стромы, анализ токсичности и тест на активность препарата.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

На протяжении десятилетий классическая двумерная (2D) монослойная культура была необходима для понимания инфекций, фармакологии и токсикологии. Тем не менее, важно учитывать сложность, динамические взаимодействия между несколькими композициями и трехмерную (3D) архитектуру микроокружения тканей. Таким образом, двумерная клеточная культура имеет ограничения в имитации тканеподобных структур 3,4. Например, отсутствует передача сигналов «от клетки к клетке» и «от клетки к внеклеточному матриксу» (ECM), которая необходима для дифференцировки клеток, пролиферации и клеточных функций в микроокружении vivo. По этим причинам были разработаны системы 3D клеточных культур5. Клетки в 3D-культуре растут и взаимодействуют с окружающим внеклеточным матриксом в трех измерениях. Кроме того, был разработан подход 3D-кокультуры, состоящий из более чем одного типа клеток, чтобы преодолеть разрыв между упрощенными моделями типа одной клетки in vitro и динамическими клеточными взаимодействиями, происходящими in vivo6. Системы 3D-кокультуры завоевали популярность в изучении межклеточной коммуникации и межклеточного матриксного взаимодействия (ВКМ) 7,8,9,10. Современные системы 3D кокультуры имеют несколько форм и могут быть разделены на прямую и косвенную кокультуру 8,9. При прямой кокультуре различные клеточные функции в культивируемых клетках могут в основном подвергаться воздействию прямого контакта, а не паракринных эффектов. Для сравнения, непрямая кокультура имеет большее преимущество в исследовании паракринного взаимодействия за счет использования барьеров или слоев для разделения различных типов клеток.

Для изготовления биомиметических каркасов, имитирующих ECM, используются различные материалы и методы с использованием биосовместимых и биоразлагаемых веществ10. Структура нановолокнистого каркаса имитирует конфигурацию нативной ВКМ в биологических тканях, обеспечивая 3D-архитектуру для клеточной культуры11,12. Электроспиннинговые нановолокнистые мембраны (ЯМ) были использованы в прямой и непрямой кокультуре различных типов клеток 13,14,15.

Эпителиальные клетки образуют физический барьер для основных органов, в то время как фибробласты являются преобладающими клетками стромы, которые опосредуют ремоделирование ВКМ и регулируют соседний эпителий 6,16,17. Эпителиальные клетки и фибробласты взаимодействуют с ламинином в базальной мембране и фибронектином в интерстициальном матриксе, соответственно, через рецепторы интегрина на поверхности клетки18. При культивировании эпителиальных клеток на поливиниловых спиртовых (ПВА) НМ диаметром 150 - 250 нм и микропорами они образуют вместо клеточных агрегатов и сфероидов многослойные, а их характер роста аналогичен таковому характеру роста клеток эпителиальнойткани19. Для сравнения, поли(капролактон) (PCL) NM с диаметром 400-1500 нм и микропорами 10-50 мкм обеспечивают пространственную размерность, аналогичную интерстициальному матриксу, для роста культивируемых фибробластов13,14. Благодаря своей биосовместимости, мембраны PVA и PCL широко используются в тканевой инженерии20,21.

В этом исследовании представлена усовершенствованная двухслойная культуральная система с использованием пористых электроспиннинговых ЯМ для культивирования эпителиальных клеток в виде тканеподобных слоев и фибробластов в 3D-структуре. Протокол можно разделить на пять ключевых этапов: изготовление нановолокон, пост-сшивание волокон и оценка качества, подготовка лунки для культуры, прикрепленной к мембране, посев клеток и 3D-кокультура, а также анализы 3D-культивируемых клеток.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Изготовление водостойких нановолокон ПВС

  1. Взвесьте 0,02 г полиакриловой кислоты (ПАА) и 1 г ПВА, затем добавьте их в чистую стеклянную бутылку, содержащую магнитный стержень. Добавьте в бутылку 7,8 мл дистиллированной воды, поставьте бутылку на мешалку и установите температуру 84 °C, скорость 500 об/мин, время 12 часов.
  2. Дайте флакону остыть до комнатной температуры, прежде чем добавлять 0,2 мл глутарового альдегида (GA). Поставьте бутылку на тарелочную мешалку и установите скорость на 500 об/мин, время на 30 мин и температуру на комнатную температуру.
  3. Используйте шприц объемом 5 мл для электроспиннинга, отделите поршни от бочек и очистите мелкий пластиковый мусор внутри бочек и кончика плунжеров.
  4. С помощью игл перекройте поток жидкости, затем налейте раствор ПВА в каждый цилиндр (объем: 2,5-3 мл каждый). Соберите поршни, затем снимите иглы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В растворе может быть пузырь, поэтому подождите, пока пузырь исчезнет. Это занимает 10-30 минут.
  5. Соберите новую металлическую иглу 27 G, затем поместите ее в электропрядильный станок.
  6. Хорошо оберните коллектор пленкой.
  7. Дайте панели форсунок вернуться в исходное положение. Используйте следующие настройки для машины: (каждый насос) объем впрыска: 2 мл, скорость впрыска: 6 мкл/мин, скорость ролика: 100 об/мин, расстояние от наконечника до коллектора: 14 см. Проверьте расход жидкости для каждого насоса.
  8. Запустите машину с электрическим потенциалом примерно 12 кВ.
  9. Убедитесь, что влажность составляет 40 - 50% в начале и 25 - 30% в конце процесса. Используйте увлажнитель воздуха, когда влажность снижается, и поместите посуду с дистиллированной водой внутрь машины за день до электроспиннинга, чтобы повысить влажность.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это критический фактор для успешного изготовления нановолокон ПВА.
  10. Регулярно проверяйте расход. Если игла заблокирована, временно остановите машинку. Удалите каплю с помощью лабораторной салфетки и подождите, пока не появится новая капля. Если нет, поменяйте иглу, то продолжайте работу машины.
  11. Процесс изготовления нановолокна ПВС занимает ~6 часов. После завершения процесса электропрядения отсоедините фольгу, содержащую волокнистый коврик, от коллектора и храните коврик из нановолокна в адсорбенте под вакуумом.

2. Обработка нановолокнистой мембраны ПВА парами соляной кислоты (HCl) и оценка качества волокна

ПРИМЕЧАНИЕ: Водостойкость ПВА НМ хорошо сохраняется после реакции после сшивания парами HCl. Этот процесс оптимизирован для подходящей толщины, размера пор и шероховатости NM. PVA является очень гидрофильным полимером, а нановолокна PVA с электроспиннингом нестабильны в контакте с водой и во влажных условиях. НМ ПВС следует обрабатывать парами HCl сразу после изготовления полимера ПВА.

  1. Разрежьте коврик из нановолокна на кусочки нужного размера для транс-луночной вставки.
  2. Приготовьте небольшую чашку, содержащую 1,5 мл чистой HCl. Поместите содержащую HCl чашку и кусочки нановолокна в вакуумную камеру и закройте крышку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пары HCl используются в качестве агента после сшивки, чтобы сделать нановолокно водостабильным.
  3. Откройте клапан, подключенный к вакуумному насосу, подождите 10 секунд, пока дым HCl не поднимется, а затем закройте клапан. Обработайте мембраны дымом HCl в течение 2 минут.
  4. После обработки парами HCl добавьте к мембранам несколько капель дистиллированной воды (DW), положите их на предметное стекло и снимите мембрану с фольги. После сушки на воздухе в течение 20 минут мембраны естественным образом прилипают к предметному стеклу.
  5. Покройте мембраны углеродной лентой тонким слоем золота с помощью автораспылительного коатера. Получение изображений с помощью сканирующего электронного микроскопа (СЭМ).
  6. После сшивания НМ ПВА с HCl промойте их 3 раза с помощью 1x PBS и проверьте pH после замачивания в питательных средах, чтобы подтвердить отсутствие остаточной HCl.

3. Изготовление нановолокон PCL и оценка качества нановолокон

  1. Взвесьте 1,5 г PCL и добавьте его в чистую стеклянную бутылку. Добавьте в бутылку 8,5 мл хлороформа, поставьте бутылку на мешалку и растворите PCL в хлороформе в течение 12 часов при комнатной температуре.
  2. Повторите шаги с 1.3 по 1.9, за исключением шагов 1.7 и 1.8, установите скорость впрыска на уровне 8 мкл/мин и напряжение на уровне 17,5 кВ.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Изготовление PCL занимает ~3,5 часа.
  3. Отрежьте небольшой кусочек мембраны и покройте кусочки методом автоматического распыления в течение 5 минут. Получение изображений SEM.

4. Сборка двух слоев мембран в транс-лунку

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе мы используем 24-луночный планшет и соответствующую вставную лунку. ПВА НМ крепится к колодцу вставки, а ПХЛ НМ крепится к нижнему колодцу.

  1. Разрежьте коврик из нановолокна на круглые кусочки, диаметром 10 мм и 13 мм для ПВА и ПХЛ НМ соответственно.
  2. Используйте полидиметилсилоксан (PDMS) Sylgard 184 в качестве адгезивного агента для крепления мембран к вкладышу и камере колодца. Перед использованием смешайте Sylgard 184 Base (часть A) и Отвердитель (часть B) в пластиковом стаканчике в соотношении 10:1 по массе. С помощью чистого предметного стекла энергично перемешайте раствор PDMS в течение 2-3 минут, пока вся смесь не заполнится пузырьками. Дайте пузырьку образоваться и исчезнуть в течение 10 минут перед использованием; тем временем дайте предметному стеклу нагреться до 100 °C.
  3. Разложите PDMS на предметном стекле и хорошо окуните нижний край вкладыша в PDMS. Держите вставку хорошо вверх дном на нагревателе слайдов, чтобы PDMS затвердел (~10-15 минут). Тщательно проверьте с помощью наконечника объемом 200 мкл, чтобы убедиться, что PDMS не липкий.
  4. Обрабатывайте детали PVA NM так, как описано в шагах с 2.2 по 2.4.
  5. Аккуратно прижмите вставку к элементу ПВА НМ так, чтобы нижняя часть вкладыша хорошо смотрела на сторону нановолокна мембранного элемента. Добавьте каплю дистиллированной воды в центр лунки и с помощью щипцов снимите фольгу. Хорошо вставьте вставку в новую 24-луночную пластину и дайте мембране высохнуть.
  6. При креплении детали PCL NM к нижней лунке обязательно окуните наконечник объемом 200 мкл в смесь PDMS и точно расставьте точки по четырем углам и по центру.
  7. Поместите пластину на нагреватель слайдов и дайте PDMS застыть в течение 5-7 минут, чтобы обеспечить качество сборки.
  8. Поместите кусочек PCL NM в лунку, содержащую PDMS, с нановолоконной стороной мембраны, прикрепленной к PDMS. С помощью небольшой чистой щетки слегка прижмите фольгированную сторону мембранного куска для полного крепления. Добавьте в лунку 0,2 мл 70% этанола, чтобы легко удалить фольгу.
  9. Простерилизуйте вкладыш и дно лунки в переходной лунке под ультрафиолетовым светом на ночь.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Смешанный PDMS можно хранить при температуре -20 °C для дальнейшего использования. ВНИМАНИЕ: Пластину, прикрепленную к нановолокнистой мембране PCL, можно хранить сухой, но перед использованием она должна быть влажной с 70% этанолом.
  10. На следующий день хорошо промойте вкладыш и дно, добавив 200 мкл и 500 мкл 1x фосфатно-солевого буфера (PBS) соответственно в течение 3 x 10 минут. Вкладыш и нижняя лунка готовы к использованию.

5. Посев клеток и сборка двух слоев для модели кокультуры

Примечание: Клетки MLE-12 культивировали в 1x модифицированной среде Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)/F12 с 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) и 1% антибиотиком пенициллин/стрептомицин. Клетки NIH3T3 культивировали в 1x DMEM с высоким содержанием глюкозы с 10% FBS и 1% антибиотиком пенициллин/стрептомицин.

  1. Храните клетки в чашке для культивирования диаметром 150 мм. Когда они слигнутся на 70-80%, промойте клетки 10 мл 1x PBS и трипсинизируйте их 2 мл предварительно подогретого 0,05% раствора трипсина/ЭДТА в течение 3 минут при 37 °C.
  2. Осторожно постучите по чашке, чтобы выбить клетки со дна, а затем добавьте 8 мл полной питательной среды к каждому типу клеток, чтобы нейтрализовать фермент трипсин. Перенесите клеточную суспензию в центрифужную пробирку объемом 50 мл, центрифугируйте при 400 × г в течение 5 мин и выбросьте надосадочную жидкость. Окрашивайте клетки с помощью Cell-Tracker, чтобы наблюдать за распределением засеянных клеток на NM (подробнее см. раздел 6).
  3. Ресуспендируйте клеточную гранулу в 5 мл полной среды DMEM/F12. Определите количество клеток и отрегулируйте на 6 × 106 MLE-12 клеток/мл и 8 × 105 NIH3T3 клеток/мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Полная среда DMEM/F12 используется для кокультуры с клетками MLE-12 и NIH3T3.
  4. Заполните нижнюю лунку 500 μL полным фильтрующим материалом DMEM/F12 (лунка без PCL). Перенесите вкладыш, прикрепленный к нановолокнистой мембране ПВА, в транслунку и добавьте 50 мкл клеточной суспензии MLE-12. Инкубируйте клетки при 37 °C и 5%CO2.
  5. Одновременно заполните нижнюю лунку нановолокнистой мембраны, прикрепленной к PCL, 500 мкл клеточной суспензии NIH3T3 и инкубируйте клетки при 37 °C и 5%CO2.
  6. Через 2 ч соберите вкладыш, содержащий ячейку MLE-12, и нижнюю лунку, содержащую ячейку NIH3T3, в межлуночной установке. Это модель кокультуры с клетками MLE-12 в качестве верхнего слоя и клетками NIH3T3 в качестве нижнего слоя. Совместное культивирование клеток в двухслойных мембранах в течение желаемого времени.

6. Анализ распределения клеток

  1. Приготовьте 5 мкМ красного и зеленого раствора Cell-Tracker в общем объеме 2 мл полной среды DMEM/F12.
  2. После трипсинизации смешайте клетки MLE-12 с ранее приготовленным красным раствором Cell-Tracker, а NIH3T3 с зеленым раствором Cell-Tracker. Инкубируйте клетки при 37 °C и 5%CO2 в течение 30 минут, чтобы обеспечить оптимальную маркировку клеток. Добавьте к образцам 8 мл полной среды DMEM/F12 и центрифугируйте при температуре 400 × г в течение 5 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Cell Tracker не может влиять на жизнеспособность и пролиферацию клеток. Следовательно, клетки, окрашенные с помощью Cell-Tracker, могут быть культивированы до слияния. Интенсивность флуоресценции в окрашенных клетках может снизиться через 4-5 дней после культивирования.
  3. Повторите шаги с 5.3 по 5.6.
  4. Во время наблюдения под конфокальным микроскопом перенесите вставную лунку с 24-луночного планшета на 12-луночный планшет.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это сводит к минимуму расстояние между линзой объектива и клетками, что позволяет наблюдать за морфологией клеток.

7. Конфокальные наблюдения за кокультивируемыми клетками в 3D

Примечание: Прикрепление эпителиальных клеток к ПВА ЯМ слабое по сравнению с прикреплением фибробластов к НМ ПХЛ. Отбракуйте старый фильтрующий материал вручную с помощью аспирации пипеткой и аккуратно добавьте новый фильтрующий материал или раствор в стенку лунки. В процессе окрашивания старайтесь не допускать пересыхания мембран.

Примечание: Прикрепление клеток может быть улучшено путем нанесения покрытия ламинином или включения пептидов интегрин-связывающих мотивов в нановолокна ПВА19.

  1. Перенесите вкладыш на новый 24-луночный планшет. Выбросьте старый фильтрующий материал и добавьте 150 μл 4% раствора параформальдегида (PFA). Выдерживать 15 минут при комнатной температуре.
  2. Удалите 4% раствор PFA и промойте прилипшие клетки 150 мкл 1x PBS.
  3. Для блокирования и пермеабилизации добавьте 150 мкл 5% нормальной козьей сыворотки и 0,2% Triton X-100, разведенных в 1x PBS, и инкубируйте в течение 30 минут при комнатной температуре.
  4. Приготовьте конъюгированные с Alexa Fluor 594 антизональные окклюденсы Ab (1:400) и Phalloidin-iFlour 488 (1:1000), разбавив их в реагенте-разбавителе антител. Удалите блокирующий раствор, добавьте 150 μл раствора флуорофора на лунку и инкубируйте в течение 1 ч при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Готовьте растворы антител с максимальной точностью, так как это напрямую повлияет на качество результатов. Избегайте воздействия света.
  5. Сбросить раствор антитела и промыть клетки 150 мкл 1x PBS в течение 10 минут.
  6. Добавьте 150 μL Hoechst 33342, разведенного в 1x PBS (1:1,000) и инкубируйте в течение 10 минут; Избегайте воздействия света.
  7. Удалите раствор Hoechst 33342 и промойте прилипшие клетки 150 мкл 1x PBS в течение 10 минут.
  8. Подготовьте чистое предметное стекло и добавьте точное количество водного монтажного геля. С помощью щипцов с заостренными кончиками аккуратно отсоедините мембраны от окружающего края. Поместите мембраны на монтажный гель так, чтобы сторона, содержащая клетки, была обращена вверх. Добавьте точное количество монтажного геля и накройте крышкой. Заклейте горки лаком для ногтей, обеспечив точное и полное прилегание.
  9. Наблюдайте за клетками под конфокальным микроскопом с использованием следующих настроек визуализации: Контроль мощности лазера: 405 Интенсивность 10; Контроль мощности лазера: 488 Интенсивность 10; Контроль мощности лазера: 561 Интенсивность 10; Чувствительность детектора: 420LP (значение 600); Чувствительность детектора: 525/50 (значение 700); Чувствительность детектора: 561LP (значение 750).

8. Анализ прикрепления клеток к нановолокнам

  1. Выбросьте старый носитель и промойте ячейки 150 μл 1x PBS.
  2. Зафиксируйте элементы 150 мкл 3% ГА, разведенным в 1x PBS на 1 ч при комнатной температуре.
  3. Промойте ячейки 150 μл 1x PBS за 10 минут.
  4. Зафиксируйте клетки вторично, добавив 150 мкл 1% тетраоксида осмия (OsO4), разведенного в 1x PBS в течение 1 часа.
    ВНИМАНИЕ: OsO4 и его пары вредны. Его необходимо использовать в вытяжном шкафу.
  5. Слейте раствор и промойте клетки 300 мкл 1x PBS в течение 2 x 10 минут.
  6. Обезвоживайте клетки с помощью сортированного этанола от 50%, 70%, 90% и 95% до 100% в течение 10 минут на каждом этапе. Выполните последний этап обезвоживания, добавив свежий 100% этанол в течение 10 минут.
  7. Полностью высушите клетки и мембраны на воздухе. С помощью щипцов с заостренными кончиками отсоедините мембраны и поместите мембраны на держатель образца с помощью двустороннего постукивания. Выполните ионное распыление в течение 5 минут перед наблюдением за ячейками под СЭМ при 2000-кратном увеличении.

9. Анализ роста клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе анализ CCK-8 используется для количественной оценки скорости роста клеток в соответствии с инструкциями производителя.

  1. Приготовьте смесь CCK-8, смешав 9 частей предварительно подогретого DMEM/F12 (по объему) с 1 частью реагента CCK-8. После удаления старой питательной среды добавьте 150 мкл смеси CCK-8 в ячейкосодержащую лунку.
  2. Перенесите вкладыш на новую 24-луночную пластину, чтобы отделить ее от нижней лунки, содержащей клетки. Инкубируйте клетки в течение 45 мин при 37 °C и 5%CO2.
  3. Соберите надосадочную жидкость и перенесите ее в пробирку объемом 1,5 мл. Центрифугируйте при 1 800 × г в течение 3 мин.
  4. Добавьте 100 мкл надосадочной жидкости из микроцентрифужной пробирки в 96-луночный планшет. Считывание оптической плотности (OD) на длине волны 450 нм.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом протоколе изложены важнейшие этапы совместного культивирования эпителиальных клеток легких MLE-12 и фибробластов NIH3T3 путем построения двухслойной модели на основе нановолокнистой мембраны (рис. 1). Эта модель подходит для визуализации живых клеток, иммуногистохимии и количественного анализа конечных точек кокультивируемых клеток. Другие типы клеток также могут быть использованы для оптимизации плотности клеток и условий роста.

СЭМ показывает равномерное распределение изготовленных нановолокон ПВА без образования гранул (Рисунок 2A). Диаметр нановолокон ПВС варьировался от 150 нм до 230 нм (180 ± 25 нм, среднее ± стандартное отклонение (SD)). Нановолокна в электроспиннинговых НМ PCL были случайно ориентированы и структурно напоминали коллаген (рис. 2B). Большинство волокон в PCL NM имели диаметр от 300 нм до 7 мкм (3,8 ± 2,5 мкм). Таким образом, нановолокнистая мембрана ПВА имела меньшие размеры пор, чем нановолокнистая мембрана PCL.

Перед посевом клетки MLE-12 и NIH3T3 окрашивали в красный и зеленый цвета Cell-Tracker соответственно и контролировали на протяжении всего процесса совместного культивирования. Как показано на рисунке 3, можно отчетливо наблюдать пространственное распределение ячеек MLE-12 во вставной камере и ячеек NIH3T3 в нижней камере. Анализ фокус-стекинга показал, что клетки NIH3T3 были диспергированы и обнаружены на разной глубине (102 ± 20 мкм), в то время как клетки MLE-12 образовывали слои толщиной 80 ± 10 мкм. СЭМ показывает прикрепление клеток к мембранам. Клетки NIH3T3 проникают в нанофиброзную мембрану PCL и распространяются вдоль осей нановолокна, в то время как клетки MLE-12 прилипают к поверхности нановолокнистой мембраны ПВА и демонстрируют агрегацию (рис. 4). Далее мы исследовали цитоскелетную организацию клеток NIH3T3 и клеток MLE-12 путем окрашивания актинами. Клетки NIH3T3, культивируемые на нанофиброзной мембране PCL, демонстрируют метательное распределение актиновых филаментов, напоминающих клетки в тканях, а окрашивание актином в клетках MLE-12, культивируемых на нановолокнистой мембране PVA, демонстрирует круглые агрегаты без клеточного распространения (рис. 5).

Сравнивали распределение и характер роста клеток MLE-12 в монокультуре и кокультуре. Клетки с красным окрасом Cell-Tracker в монокультуре на НМ ПВА образовывали агрегаты, но клетки в условиях кокультуры сохраняли равномерное распределение на мембране (рис. 6A). При 3D-анализе изображений конфокальной микроскопии характер роста кокультивируемых клеток MLE-12 на НМ ПВА показывает слоистую адгезию культивируемых клеток к мембране с большей плотностью сливающихся клеток по сравнению с клетками, культивируемыми в отсутствие фибробластов (рис. 6B). Кроме того, межклеточная адгезия и экспрессия зонального окклюдина (ZO)-1 на клеточных поверхностях (стрелка указана), но не клеточных агрегатов, были более заметны в условиях кокультуры, чем в культуре без фибробластов (рис. 6C).

Пролиферацию клеток на мембранах измеряли с помощью анализа CCK-8. Пролиферация клеток NIH3T3 и MLE-12 со временем увеличивалась (рис. 7). Однако на мембранах наблюдались более низкие темпы роста клеток, чем на культуральной пластине (данные не показаны). Кокультивируемые клетки NIH3T3 и MLE-12 на НМ демонстрируют стабильную скорость роста по сравнению с монокультуральными клетками в культуральной тарелке.

figure-results-1
Рисунок 1: Схема, иллюстрирующая метод совместного культивирования фибробластов NIH3T3 и эпителиальных клеток MLE-12 в двухслойной системе на основе скаффолда. Сокращения: ПВА = поливиниловый спирт; PCL = поли(ε-капролактон). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 2: Структура нановолокон ПВА и ПХЛ. (А) ПВА и (В) нановолокнистые мембраны ПХЛ были получены методом электропрядения. Структура и диаметр нановолокон измеряются с помощью СЭМ мембранных поверхностей. Масштабные линейки = 1 мкм (А), 10 мкм (В). Сокращения: ПВА = поливиниловый спирт; PCL = поли(ε-капролактон). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-3
Рисунок 3: Пространственное распределение клеток NIH3T3 на нанофиброзной мембране PCL и клеток MLE-12 на нановолокнистой мембране PVA. Клетки NIH3T3 (4 × 105) окрашивали Cell-Tracker Green, а клетки MLE-12 (3 × 105) окрашивали Cell-Tracker Red. Засеянные клетки культивировали в течение 24 ч и наблюдали с помощью Z-стекингового изображения конфокального микроскопа. Цифры указываются в мкм; Стрелки показывают размеры с x (ширина), y (длина), z (глубина). Сокращения: ПВА = поливиниловый спирт; PCL = поли(ε-капролактон). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-4
Рисунок 4: Адгезия и морфология клеток NIH3T3 на нанофиброзной мембране PCL и клеток MLE-12 на нановолокнистой мембране PVA. Клетки культивировали на мембранах в течение 24 ч и наблюдали с помощью СЭМ при 2000-кратном увеличении. Масштабные линейки = 15 мкм. Сокращения: ПВА = поливиниловый спирт; PCL = поли(ε-капролактон). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-5
Рисунок 5: Волокна актинового стресса в клетках NIH3T3 на нановолокнистой мембране PCL и клетках MLE-12 на нановолокнистой мембране PVA. Клетки NIH3T3 (4 × 105) и клетки MLE-12 (3 ×10 5 клеток) засеивали на нановолокнистые мембраны PCL и PVA соответственно. После 48 ч культивирования клетки окрашивали фаллоидином-iFlour 488 и наблюдали с помощью конфокальной микроскопии. Масштабные линейки = 50 μм. Сокращения: ПВА = поливиниловый спирт; PCL = поли(ε-капролактон); FITC = флуоресцеин изотиоцианат. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-6
Рисунок 6: Схема роста кокультивируемых клеток MLE-12 на нановолокнистой мембране ПВА. (A) Окрашенные в красный цвет клетки MLE-12 Cell-Tracker (3 × 10,5 клеток) засеивали на нановолокнистую мембрану ПВА и культивировали отдельно (клетки -NIH3T3) и с клетками NIH3T3 в двухслойной системе (+клетки NIH3T3) в течение 48 ч. (B) Монокультивированные и совместно культивируемые клетки MLE-12 в течение 48 ч окрашивали препаратами Hoechst 33342 (синий) и Phalloidin-iFlour 488 и наблюдали с помощью конфокального микроскопа. 3D-изображения отображаются с помощью функции обработки поверхностей программного обеспечения Imiris. (C) Клетки MLE-12 культивировали в течение 48 ч и флуоресцентно мечили Phalloidin-iFlour 488 и антителом против ZO-1 (красный). Масштабные линейки = 50 μм. Сокращения: ПВА = поливиниловый спирт. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-7
Рисунок 7: Скорость роста клеток в двухслойной системе кокультуры. Клетки NIH3T3 (4 × 10,5) и клетки MLE-12 (3 × 10,5) подвергаются кокультивированию в течение указанного времени. Рост клеток во вкладыше и нижней лунке измеряют с помощью анализа CCK-8. Данные представлены в виде среднего значения ± SD (n = 3). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Переход от 2D-моделей культур к 3D-моделям культур представляет собой значительный шаг вперед в разработке моделей кокультуры in vitro. 3D-модель культуры должна имитировать микроокружение ткани, в котором клетки могут пролиферировать, агрегировать и дифференцироваться. Использование 3D-моделей кокультуры на основе скаффолдов улучшает воспроизведение архитектуры тканей. В этом исследовании транс-луночная система на основе NM обеспечивает непрямую 3D-кокультуру двух типов клеток. PCL NM с большими порами в нижней камере обеспечивает клеточную инфильтрацию и имитирует интерстициальный матрикс. Этот каркас поддерживает рост и пространственную организацию фибробластов. Использование нанофиброзной мембраны ПВА в верхней камере позволяет формировать эпителиальные клетки MLE-12 в слое. Диаметр и размер пор нановолокнистой мембраны ПВА делают ее идеальным субстратом для поддержки адгезии и роста эпителиальных клеток, которые имитируют эпителиальные клетки на базальной мембране в эпителиальных тканях19.

Клеточные адгезивные белки, такие как фибронектин и ламинин, являются ключевыми белками в ВКМ, которые соединяют клетки с коллагеновыми фибриллами23. Эпителиальные клетки взаимодействуют с ламинином через рецепторы интегрина на их поверхности18. Клетки MLE-12, посеянные на НМ ПВА, прилипли к мембране и выросли на ней в трехмерном пространстве. Тем не менее, связывание эпителиальных клеток с пористым PVA NM было низким, что приводило к агрегации, поскольку у них отсутствуют специфические биологические мотивы, взаимодействующие с культивируемыми клетками. В нашей системе кокультуры прямой межклеточный контакт между клетками NIH3T3 и MLE-12 отсутствует, а коммуникация происходит исключительно посредством паракринной сигнализации. Присутствие кокультивируемых клеток NIH3T3 может стабилизировать прикрепление клеток MLE-12 к мембране на протяжении всего периода культивирования. Эта стабилизация может быть связана с секрецией фибробластами растворимых факторов, включая коллаген, фибронектин, ламинин и различные факторы роста24. Для сравнения, в опухолевой модели с прямым совместным культивированием фибробластов и раковых клеток в нанофиброзном каркасе PCL, фибробласты изменяют свойства ВКМ посредством ремоделированияматрицы25.

Эпителиальные клетки опираются на базальную мембрану, которая действует как поддержка роста и избирательно проницаемый слой. В настоящее время разрабатывается несколько технологических стратегий, в том числе органоидная технология, для создания сложных 3D-моделей эпителиальных тканей26. Однако структура органоидов затрудняет использование традиционных анализов27. Кроме того, традиционная микроскопия для сбора экспериментальных данных осложняется тем, что органоиды культивируются во время встраивания в 3D гидрогелевую матрицу27. В этом исследовании вставная камера была отделена от нижней камеры для облегчения точного наблюдения за эпителиальными клетками, культивируемыми на ПВА NM. Более того, 3D-органоиды образуются путем дифференцировки стволовых клеток. Таким образом, культивирование стволовых клеток занимает много времени и является сложной процедурой по сравнению с системой совместного культивирования, а также сообщается о гетерогенности органоидов28.

По сравнению с монокультурой, кокультура эпителиальных клеток и фибробластов улучшает адгезию к каркасу и поддерживает стабильный рост и функцию культивируемых эпителиальных клеток. Кроме того, дополнительные материалы, включая факторы роста и цитокины, не требуются в питательной среде из-за растворимых факторов, секретируемых кокультурируемыми фибробластами. Несмотря на преимущества использования нановолокнистых каркасов в кокультуре клеток путем обеспечения структурной поддержки, они не могут обеспечить ECM, окружающие культивируемые клетки, по сравнению с биосовместимыми гидрогелями29. Таким образом, это ограничение может быть достигнуто с помощью клеток на ЯМ с надслойными гидрогелями.

В заключение следует отметить, что простая система ко-культивирования вставок для одновременного культивирования фибробластов и эпителиальных клеток имеет решающее значение в различных физиологических и фармакологических контекстах, включая регенерацию эпителиальной ткани, микроокружение опухоли, анализ токсичности и тест на активность препарата. Система 3D-кокультуры на основе нановолокнистых мембран будет оснащена приборами и спроектирована для высокопроизводительных исследований абсорбции лекарств и скрининга транспорта.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана грантом Корейского проекта исследований и разработок в области технологий здравоохранения через Корейский институт развития индустрии здравоохранения (KHIDI), финансируемым Министерством здравоохранения и социального обеспечения Республики Корея (HR16C0001); Проект по наращиванию потенциала в области фундаментальных научных исследований через грант Корейского института фундаментальных наук (Национальный центр исследовательских помещений и оборудования), финансируемый Министерством образования (2019R1A6C1010003); и гранты Национального исследовательского фонда Кореи (NRF), финансируемые правительством Кореи (MSIT) (2022R1A4A5032702).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,05% Трипсин/ЭДТАWelgeneLS015-01
100x Пеницилин/СтрептомицинGibco10378016
20xPBS раствор ЛПСCBP007A
4% ПараформальдегидBiosesangPC2031-050-00
Alexa Fluor-594 конъюгированное антитело ZO-1Invitrogen339194
разбавитель антител OP QuantoEpredia10129-576
CCK-8 набор для анализаDonginbioCCK-3000
Чашка для клеточных культур (150x20)SPL20151
CellTracker зеленый CMFDAInvitrogenC7025
CellTracker красный CMTPXInvitrogenC34552
ХлороформSamchunC0584
Коническая трубкаSPL50050
Защитное стеклоCorningCLS2980245
DMEM с высоким содержанием глюкозыWelgeneLM001-05
DMEM/F12WelgeneLM 002-05
DURAN Основания влагопоглотителя с плоским фланцем, резьбаDWK Life Sciences 7.022 260
DURAN Стеклянная крышка эксикатора и Запорный кранDaihan ScienceSM.2444061
DURAN Запорный кран, со шпинделем из ПТФЭDWK Life Sciences 
Электропрядильная машинаNanoNCESR200RD
этиловым спиртом, чистымSigma Aldrich459844
FBSSigma AldrichTMS-013-BKR 
Флуоресцентный лазерный конфокальный сканер Модуль K1-fluoNanoscope Systems
Gel/mountBiomeda Corp.M01
Раствор глутаральдегидаSigma Aldrich340855
Hoechst 33342InvitrogenH1399
Металлическая насадка 27GNanoNC
Лак для ногтейNature Republic Нормальная
козья сывороткаVector LaboratoriesS-1000
Тетраоксид осмияSigma Aldrich201030
Phalloidin-iFlour 488abcamab176753
Пластиковый замок Syringe_Lure (10 мл)HENKE SASS WOLFAL10
Поли(акриловая кислота)Sigma Aldrich323667
поли(виниловый спирт)Sigma Aldrich341584
поликапролактонSigma Aldrich440744
Pure HCLDuksan1129
Сканирующая электронная микроскопияSECSNE-4500M
Слайдовое стеклоMarienfeld SuperiorK15663717
Sylgard 184 комплектвсезнанияOMNI.05255
Synergy H1 Многорежимный считывательBiotek
Triton X-100Sigma AldrichX100
10322671

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kämpfer, A. A. M., et al. Development of an in vitro co-culture model to mimic the human intestine in healthy and diseased state. Toxicol In Vitro. 45 (Pt 1), 31-43 (2017).
  2. Barrila, J., et al. Three-dimensional organotypic co-culture model of intestinal epithelial cells and macrophages to study Salmonella enterica colonization patterns. npj Microgravity. 3, 10(2017).
  3. Breslin, S., O'Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug Discov Today. 18 (5-6), 240-249 (2013).
  4. Krause, S., et al. A novel 3D in vitro culture model to study stromal epithelial interactions in the mammary gland. Tissue Eng Part C: Methods. 14, 261-271 (2008).
  5. Urzì, O., et al. Three-dimensional cell cultures: The bridge between in vitro and in vivo models. Int J Mol Sci. 24 (15), 12046(2023).
  6. Duell, B. L., Cripps, A. W., Schembri, M. A., Ulett, G. C. Epithelial cell coculture models for studying infectious diseases: benefits and limitations. J Biomed Biotech. 2011, 852419(2011).
  7. Goers, L., Freemont, P., Polizzi, K. M. Co-culture systems and technologies: taking synthetic biology to the next level. J. R. Soc. Interface. 11 (96), 20140065(2014).
  8. Liu, R., et al. From 2D to 3D co-culture systems: A review of co-culture models to study the neural cells interaction. Int J Mol Sci. 23 (21), 13116(2022).
  9. Vis, M. A. M., Ito, K., Hofmann, S. Impact of culture medium on cellular interactions in in vitro co-culture systems. Front Bioeng Biotechnol. 8, 911(2020).
  10. Kook, Y. M., Jeong, Y., Lee, K., Koh, W. G. Design of biomimetic cellular scaffolds for co-culture system and their application. J Tissue Eng. 8, 2041731417724640(2017).
  11. Stocco, T. D., et al. Nanofibrous scaffolds for biomedical applications. Nanoscale. 10 (26), 12228-12255 (2018).
  12. Gao, X., Han, S., Zhang, R., Liu, G., Wu, J. Progress in electrospun composite nanofibers: composition, performance and applications for tissue engineering. J Mater Chem B. 7 (45), 7075-7089 (2019).
  13. Kim, T. E., et al. Three-dimensional culture and interaction of cancer cells and dendritic cells in an electrospun nano-submicron hybrid fibrous scaffold. Int J Nanomedicine. 11, 823-835 (2016).
  14. Oh, Y. S., Choi, M. H., Shin, J. I., Maza, P. A. M. A., Kwak, J. Y. Coculturing of endothelial and cancer cells in a nanofibrous scaffold-based two-layer system. Int J Mol Sci. 21 (11), 4128(2020).
  15. Lee, S. J., et al. Bacterial infection-mimicking three-dimensional phagocytosis and chemotaxis in electrospun poly(ε-caprolactone) nanofibrous membrane. Membranes. 11 (8), 569(2021).
  16. DeLeon-Pennell, K. Y., Barker, T. H., Lindsey, M. L. Fibroblasts: The arbiters of extracellular matrix remodeling. Matrix Biol. 91-92, 1-7 (2020).
  17. Lühr, I., et al. Mammary fibroblasts regulate morphogenesis of normal and tumorigenic breast epithelial cells by mechanical and paracrine signals. Cancer Lett. 325 (2), 175-188 (2012).
  18. Humphries, J. D., Byron, A., Humphries, M. J. Integrin ligands at a glance. J Cell Sci. 119 (19), 3901-3903 (2006).
  19. Tran, T. X. T., et al. Synthetic Extracellular Matrix of Polyvinyl Alcohol Nanofibers for Three-Dimensional Cell Culture. J Funct Biomater. 15, 262(2024).
  20. Oun, A. A., Shin, G. H., Rhim, J. -W., Kim, J. T. Recent advances in polyvinyl alcohol-based composite films and their applications in food packaging. Food Packaging Shelf Life. 34, 100991(2022).
  21. Zhang, W., et al. Applications of poly(caprolactone)-based nanofibre electrospun scaffolds in tissue engineering and regenerative medicine. Curr Stem Cell Res Ther. 16 (4), 414-442 (2021).
  22. Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Front Mol Biosci. 7, 33(2020).
  23. Rosso, F., Giordano, A., Barbarisi, M., Barbarisi, A. From cell-ECM interactions to tissue engineering. J Cell Physiol. 199 (2), 174-180 (2004).
  24. Malakpour-Permlid, A., et al. Identification of extracellular matrix proteins secreted by human dermal fibroblasts cultured in 3D electrospun scaffolds. Sci Rep. 11, 6655(2021).
  25. Lv, D., Hu, Z., Lu, L., Lu, H., Xu, X. Three-dimensional cell culture: a powerful tool in tumor research and drug discovery. Oncol Lett. 14 (6), 6999-7010 (2017).
  26. Torras, N., García-Díaz, M., Fernández-Majada, V., Martínez, E. Mimicking epithelial tissues in three-dimensional cell culture models. Front Bioeng Biotechnol. 6, 197(2018).
  27. Wilson, S. S., Tocchi, A., Holly, M. K., Parks, W. C., Smith, J. G. A small intestinal organoid model of non-invasive enteric pathogen-epithelial cell interactions. Mucosal Immunol. 8 (2), 352-361 (2015).
  28. Huch, M., Knoblich, J. A., Lutolf, M. P., Martinez-Arias, A. The hope and the hype of organoid research. Development. 144 (6), 938-941 (2017).
  29. Luo, L., Liu, L., Ding, Y., Dong, Y., Ma, M. Advances in biomimetic hydrogels for organoid culture. Chem Commun. (Camb). 59 (64), 9675-9686 (2023).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Electrospinning TechniquePolyvinyl Alcohol MembranePolycaprolactone MembraneFibroblast CocultureParacrine SignalingConfocal MicroscopyScanning Electron Microscopy

Похожие статьи